Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3. Phƣơng pháp gắn sản phẩm PCR vào vector biểu hiện
Tạo dòng đoạn gen gp120b_EX được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR có trình tự nhận biết của 2 enzyme giới hạn BamH I và Xho I và vector biểu hiện pET32a(+) cùng được xử lý bằng 2 enzyme giới hạn trên.
Thành phần phản ứng gắn bao gồm: H2O khử ion vô trùng; Dung dịch đệm của T4 DNA ligase; Sản phẩm PCR; Vector pET32a(+) đã mở vòng; T4 DNA ligase. Phản ứng được ủ ở 14°C trong 16 giờ đảm bảo nhiệt độ cho T4 DNA ligase hoạt động.
2.3.4. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli
Cơ chế biến nạp bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để DNA plasmid dễ dàng chui vào tế bào thể nhận. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA- plasmid ngoại lai được gọi là tế bào khả biến. Quá trình biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli gồm 2 giai đoạn: Tạo tế bào khả biến và biến nạp.
Khoa Công nghệ sinh học 33
Tạo tế bào khả biến:
- Tế bào E.coli được nuôi qua đêm trong 5ml môi trường LB lỏng.
- Pha loãng huyền dịch tế bào đã nuôi cấy theo tỷ lệ 1:100 trong 5ml môi trường LB.
- Nuôi lắc ở 37°C, 200v/phút. Sau 2 giờ tiến hành kiểm tra mật độ tế bào bằng phương pháp quang phổ kế ở bước sóng 600nm. Khi giá trị OD600 đạt từ 0,6 – 1 là đạt yêu cầu.
- Chuyển 1ml dịch tế bào sang ống eppendorf vô trùng.
- Để trên đá 10 phút. Sau đó ly tâm thu sinh khối ở 4°C, tốc độ 4.000v/phút, trong thời gian 10 phút; loại dịch nổi.
- Rửa cặn tế bào bằng CaCl2 100mM (tỷ lệ 1:10) ở 4°C. Ly tâm 4.000v/phút, loại dịch nổi.
- Rửa lại bằng CaCl2 100mM (tỷ lệ 1:20) ở 4°C; ly tâm thu cặn.
- Hòa cặn tế bào thành huyền dịch trong 100µl CaCl2 100mM, giữ trong đá ít nhất 1 giờ trước khi tiến hành biến nạp.
Biến nạp:
- Bổ sung 3-4µl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến. - Để trên đá trong 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42°C trong 1phút 30 giây.
- Chuyển ống tế bào vào trong đá xốp để 3 phút.
- Bổ sung 250µl mơi trường LB lỏng; ni lắc ở 37°C trong 1 giờ.
- Cấy trải 100µl-150µl trên mơi trường thạch LBA (mơi trường LB đặc có bổ sung Amp (100µg/ml)).
Khoa Cơng nghệ sinh học 34
2.3.5. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli
Để thu nhận plasmid tái tổ hợp, DNA plasmid được tách chiết lại từ tế bào vi khuẩn đã biến nạp và kiểm tra bằng cách cắt với enzyme giới hạn. Quá trình tách chiết gồm các bước cơ bản: Phá màng; Loại protein; Tủa nucleic acid.
- Cấy các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh vào 2ml môi trường LBA. Nuôi lắc qua đêm ở 37°C, 200v/phút.
- Ly tâm hỗn hợp dịch tế bào đã biến nạp 12.000v/p trong 1 phút; loại dịch nổi và thu cặn.
- Bổ sung Sol I (Tris-HCl 50mM, pH 8,0 + EDTA 10mM, pH 8,0) và trộn đều bằng máy vortex.
- Bổ sung Sol II (NaOH 200mM + SDS 1%), đảo nhẹ bằng tay.
- Bổ sung Sol III (Kac-Potasium Acetat 3M, pH 5,5), đảo nhẹ bằng tay. - Chiết bằng chloroform:isomylalcohol (24:1); đảo nhẹ.
- Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút.
- Thu dịch nổi, tủa bằng muối NAOAC 3M (1/10 thể tích) và Ethanol 100% (2,5 thể tích) ở -20°C ít nhất trong 1 giờ.
- Ly tâm 12.000v/phút trong 20 phút; loại bỏ dịch nổi thu cặn. - Rửa cặn bằng Ethanol 70%
- Làm khơ cặn và hịa tan lại trong dung dịch TE-RNase (100µg/ml) - Ủ trong bể ổn nhiệt 37°C trong 1 giờ để loại ARN.
- Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%