Phản ứng giải trình tự DNA được thực hiện trên máy xác định trình tự DNA tự
3.2.1. Biểu hiện gen gp120B trong vi khuẩn E.coli chủng BL21 StarTM (DE3)
Chúng tôi sử dụng chủng biểu hiện E.coli BL 21 StarTM (DE3). Đây là chủng mang đột biến gen rne (gen mã hóa RNase E) làm cho enzyme RNase E mất hoạt tính làm thối hóa mRNA, qua đó tăng tính bền vững cho mRNA. Đồng thời chủng thiếu hụt lon protease (protease nội bào) và ompT protease (protease màng ngồi tế bào). Vì vậy, chủng có ưu điểm là hạn chế được sự phân cắt của protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai ổn định hơn trong tế bào sau khi được tổng hợp. Ngoài ra, hệ gen của E.coli BL21 StarTM (DE3) có chứa gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, có nguồn gốc từ bacteriophage λ DE3. Gen này được đưa vào hệ gen E.coli BL21 StarTM (DE) và đặt dưới sự điều khiển của promoter lacUV5 nên cần IPTG để cảm ứng sự biểu hiện T7 RNA polymerase. T7 RNA polymerase là enzyme hoạt động mạnh, có khả năng sao chép hồn tồn bất kỳ một trình tự DNA nào đặt dưới dự kiểm soát của T7 promoter.
Để biểu hiện được gen trong tế bào vi khuẩn E.coli, chúng tôi biến nạp vector
tái tổ hợp pETgp120B vào tế bào E.coli BL21 StarTM
(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt. Chọn 2 thể biến nạp bất kì và ni hoạt hóa qua đêm ở 37°C trong môi trường LBA, lắc với tốc độ 200v/p. Sau đó, dịch ni được cấy chuyển sang môi trường LBA và nuôi lắc tiếp cho đến khi OD600 đạt 0,6-0,8 (khoảng 2 giờ) thì bổ sung thêm chất cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1mM và nuôi tiếp ở 37°C trong 3 giờ.
Khoa Cơng nghệ sinh học 48
Hình 3.9: Kết quả biểu hiện gen mã hóa protein gp120B
ĐC 1: Thang Protein chuẩn; ĐC 2,4: Mẫu không cảm ứng; ĐC 3,5: Mẫu cảm ứng bằng IPTG 1mM.
Protein tổng số của dịch chiết tế bào đã được phân tích trên gel polyacrylamide (Hình 3.9). Kết quả điện di trên cho thấy các mẫu cảm ứng bằng IPTG 1mM (ĐC 3,5) xuất hiện một băng protein có kích thước xấp xỉ 38kDa, đúng như tính tốn lý thuyết; trong khi ở các mẫu không được cảm ứng không xuất hiện băng protein này. Điều đó chứng tỏ protein tái tổ hợp đã được biểu hiện một cách có hiệu quả trong tế bào E.coli BL21 StarTM (DE3) với chất cảm ứng IPTG.