Phản ứng giải trình tự DNA được thực hiện trên máy xác định trình tự DNA tự
ATGAGCGATA AAATTATTCA CCTGACTGAC GACAGTTTTG ACACGGATGT ACTCAAAGCG GACGGGGCGA TCCTCGTCGA TTTCTGGGCA GAGTGGTGCG GTCCGTGCAA AATGATCGCC
GACGGGGCGA TCCTCGTCGA TTTCTGGGCA GAGTGGTGCG GTCCGTGCAA AATGATCGCC CCGATTCTGG ATGAAATCGC TGACGAATAT CAGGGCAAAC TGACCGTTGC AAAACTGAAC ATCGATCAAA ACCCTGGCAC TGCGCCGAAA TATGGCATCC GTGGTATCCC GACTCTGCTG CTGTTCAAAA ACGGTGAAGT GGCGGCAACC AAAGTGGGTG CACTGTCTAA AGGTCAGTTG AAAGAGTTCC TCGACGCTAA CCTGGCCGGT TCTGGTTCTG GCCATATGCA CCATCATCAT CATCATTCTT CTGGTCTGGT GCCACGCGGT TCTGGTATGA AAGAAACCGC TGCTGCTAAA TTCGAACGCC AGCACATGGA CAGCCCAGAT CTGGGTACCG ACGACGACGA CAAGGCCATG GCTGATATCG GATCCTGTAA CATCTCAGTC ATTACACAAG CTTGTCCAAA GGTATCCTTT
BamHI
GAGCCAATTC CCATACATTA TTGTACCCCG GCTGGTTTTA CGATTCTAAA GTGTAACAAT AAAAAGTTCA AGGGAGCAGG ACCATGTACA AATGTCAGTA CAGTACAATG TACACATGGA AAAAAGTTCA AGGGAGCAGG ACCATGTACA AATGTCAGTA CAGTACAATG TACACATGGA ATTAGACCAG TAGTATCAAC TCAACTGCTG TTAAATGGCA GTTTAGCAGA AGAAGAGGTA GTAATTAGAT CTAGCAATTT CTCGGACAAT GCTAAAGTCA TAATAGTACA GCTGAATGAA TCTGTAGAAA TTAATTGTAC AAGACCCAAC AACAATACAA GAAAAAGGGT AAGTATAGGA CCAGGGCGAG CATGGTATAC AACAAAACAA ATAGTAGGAG ATATAAGACA AGCACATTGT AACATTAGTA GAACAAAATG GAATGACACT TTAAAACAGA TAACTGAAAA ATTAAGAGAA CAATTTGGGA ACAAAACAAT AATCTTTTAT CAATCTTCAG GAGGGGACCC AGAAATTGTA
AGGCACAGTT TTAATCTCGA GCACCACCAC CACCACCACT GA
XhoI
Hình 3.7: Trình tự gen gp120B_EX trong vector pET32a(+)
Kết quả giải trình tự gen (Hình 3.7) cho thấy, trình tự gen trong vector biểu hiện pET32a(+) giống với trình tự gen gp120 phân type B đã được tách dòng. Gen
gp120B_EX có thêm trình tự nhận biết của hai enzyme giới hạn BamH I và Xho I ở hai đầu; ngoài ra còn gắn thêm trình tự protein Thioredoxin và 6 Histhidin. Như vậy quá trình khuếch đại đoạn gen gp120B bằng cặp mồi biểu hiện không có sự sai lệch về trình tự gen.
Khoa Công nghệ sinh học 46
Trước khi tiến hành biểu hiện, chúng tôi sử dụng trình tự đoạn gen đích đã được gắn vào vector pET32a(+) để dịch mã ra các acid amin trên cơ sở lý thuyết. Kết quả dịch mã (Hình 3.8) cho thấy, trình tự đoạn gen đích hoàn toàn thông suốt, không xuất hiện mã kết thúc (stop codon) trong gen khi gắn vào hệ vector pET32a(+). 5 10 15 20 25 30 | | | | | | 1 M S D K I I H L T D D S F D T D V L K A D G A I L V D F W A 31 E W C G P C K M I A P I L D E I A D E Y Q G K L T V A K L N 61 I D Q N P G T A P K Y G I R G I P T L L L F K N G E V A A T 91 K V G A L S K G Q L K E F L D A N L A G S G S G H M H H H H 121 H H S S G L V P R G S G M K E T A A A K F E R Q H M D S P D Thrombin 151 L G T D D D D K A M A D I G S C N I S V I T Q A C P K V S F Enterokinase 181 E P I P I H Y C T P A G F T I L K C N N K K F K G A G P C T 211 N V S T V Q C T H G I R P V V S T Q L L L N G S L A E E E V 241 V I R S S N F S D N A K V I I V Q L N E S V E I N C T R P N 271 N N T R K R V S I G P G R A W Y T T K Q I V G D I R Q A H C 301 N I S R T K W N D T L K Q I T E K L R E Q F G N K T I I F Y 331 Q S S G G D P E I V R H S F N L E H H H H H H
Amino acid composition. --- 24 A 10 C 19 H 6 M 23 T 13 R 13 Q 28 I 12 F 4 W 20 N 17 E 24 L 16 P 5 Y 22 D 28 G 25 K 24 S 20 V Number of residues: 353
Molecular weight (MW): 38 ; Checking number (CN): 626337
Hình 3.8: Trình tự acid amin của các epitope đã được chọn dịch mã trên lý thuyết khi gắn vào vector pET32a(+)
Ghi chú: Một vùng epitope của protein gp120 phân type B (phần in màu xanh dương) (182 acid amin) được thiết kế dưới dạng protein dung hợp với Thioredoxin (phần in màu hồng) (109 acid amin) và 6 Histhidin (6 H) (12 acid amin). Trong phân tử có hai vị trí cắt của Thrombin và Enterokinase. Khối lượng phân tử của protein dung hợp tính theo lý thuyết là khoảng 38 kDa.
Khoa Công nghệ sinh học 47
tôi nhận thấy đoạn gen gp120B_EX trong vector pET32a(+) có khung đọc đúng, có mã mở đầu và mã kết thúc, không có điểm kết thúc ở vùng khởi động, đảm bảo cho quá trình biểu hiện protein thông suốt. Vector pET32a(+) mang gen gp120B_EX
được đặt tên là pETgp120B.