Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế hFGF2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR2) tái tổ hợp từ Escherichia coli

[...]... trí biểu hiện protein tái tổ hợp 1.2.2.1 Biểu hiện ở tế bào chất Hầu hết protein đƣợc biểu hiện ở E coli đều đƣợc thiết kế biểu hiện ở tế bào chất của tế bào Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E coli gặp nhiều khó khăn nhƣ protein thƣờng đƣợc tạo ra ở dạng không tan, không có hoạt tính sinh học gọi là thể vùi (inclusion body), tế bào chất của E coli không có cơ chế thúc đẩy sự hình... thƣờng đƣợc sử dụng để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli Vector có vùng MCS chứa các enzyme cắt giới hạn giúp tạo dòng gen mục tiêu vào vector Vùng MCS đƣợc thiết kế nằm ở vùng hạ lƣu của T7 promoter Khi tế bào chủ tạo ra enzyme T7 RNA polymerase và gắn vào T7 promoter gen mục tiêu nằm ở vùng hạ lƣu của promoter sẽ đƣợc phiên mã, dịch mã và tạo protein tái tổ hợp tƣơng ứng Vì T7 promoter... khi đƣợc tạo dòng vào tế bào chủ không có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase Điều này giúp plasmid tồn tại ổn định trong tế bào chủ do protein tái tổ hợp khi tạo ra có thể gây độc cho tế bào Tuy nhiên, việc điều hòa biểu hiện T7 polymerase dựa vào promoter lac có hạn chế là trong một số trƣờng hợp không cảm ứng mà vẫn có sự biểu hiện rò rỉ Nếu gen cần biểu hiện có khả năng gây độc thì việc biểu hiện rò... trƣờng chăm sóc sắc đẹp và nhận đƣợc những phản hồi tích cực 1.2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 1.2.1 Giới thiệu chung Vào những năm 1970, các thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp đầu tiên đã thành công ở vi khuẩn nhƣ hormon somatostatin, sau đó là insulin đều có giá trị cao ứng dụng trong công nghiệp dƣợc phẩm và công nghệ sinh học Hiện nay, Escherichia coli là chủng chủ đang đƣợc... GGA Rosetta-gami Bất hoạt protease lon và ompT Đột biến trxB/gor hỗ trợ tốt cho việc tạo liên kết disulfide ở tế bào chất Protein tái tổ hợp đƣợc sản xuất ở E coli có thể thực hiện theo ba hƣớng: sản xuất nội bào, trong chu chất, và sản xuất ngoại bào Trong đó, sản xuất protein tái tổ hợp trong nội bào là chiến lƣợc đƣợc sử dụng phổ biến nhất Protein tái tổ hợp tạo ra có thể ở dạng tan hay không tan... vƣợt mức protein tái tổ hợp Hệ thống sử dụng chủng chủ E coli GJ1158 đƣợc thiết kế có promoter proU đƣợc cảm ứng bởi NaCl Để tăng cƣờng biểu hiện, hệ thống cảm ứng muối có nhân tố phiên mã T7 RNA polymerase, do đó protein đƣợc biểu hiện vƣợt mức với lƣợng lớn [31] 1.3 TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP Protein đƣợc tinh sạch dựa trên những đặc tính căn bản nhƣ độ hòa tan, kích thƣớc, điện tích và liên kết ái... nhiên, hiện nay việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E coli vẫn là phƣơng án đƣợc sử dụng phổ biến nhất do mức độ biểu hiện cao hơn so với các vị trí khác trong tế bào, việc thiết kế plasmid cũng đơn giản hơn Ngoài ra, hiện nay ngƣời ta cũng phát triển nhiều phƣơng pháp nhằm cải thiện tính tan của protein trong tể bào chất nhƣ đồng biểu hiện các phân tử chapreron; sử dụng các chủng E .coli. .. sự điều hoà operon lac Hệ thống cảm ứng bằng IPTG hiện nay rất phổ biến trong sản xuất protein tái tổ hợp do chất cảm ứng IPTG ổn định, có nhiều loại chủng chủ cũng nhƣ hệ thống vector đƣợc thiết kế thích hợp cho cảm ứng IPTG Chủng chủ E coli BL21(DE3) và hệ thống vector pET là hệ thống biểu hiện đƣợc sử dụng phổ biến trong biểu hiện protein tái tổ hợp [3, 24, 31] - 29 - Luận văn thạc sĩ sinh học Vật... Studier và cộng sự Những vector pET hiện nay đƣợc bổ sung thêm nhiều đặc tính mới giúp việc tạo dòng, phát hiện và tinh chế protein mục tiêu trở nên dễ dàng hơn Việc lựa chọn một loại vector pET phù hợp để biểu hiện protein mục tiêu phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trong đó, ba yếu tố quan trọng cần xét đến là mục tiêu ứng dụng của protein đích, các đặc tính sinh học về protein này và chiến lƣợc tạo dòng... protease lon và ompT - 13 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu C41/ C43 Đột biến dành cho biểu hiện protein màng JM 83 Tiết protein tái tổ hợp ra vùng ngoại vi tế bào chất Origami B Đột biến trxB/gor hỗ trợ tốt cho việc tạo thành liên kết disulfide ở tế bào chất Bất hoạt protease lon và ompT Hỗ trợ biểu hiện protein của eukaryote với các codon hiếm nhƣ AUA, AGG, AGA, CGG, CUA, CCC và GGA Rosetta-gami