CHƯƠNG III.
3.1.4. Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf
Để khẳng định các thể biến nạp thu đƣợc chứa plasmid tái tổ hợp pET-fgf2, chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc các thể biến nạp bằng cặp mồi đặc hiệu
FGF2-F/FGF2-R và cặp mồi T7 promoter/T7 terminator. Kết quả đƣợc trình bày ở
Hình 3.4. Kết quả sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5α bằng PCR khuẩn
lạc giếng 1, thang DNA 1kb; giếng 2, PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi
FGF2-F/FGF2-R; giếng 3, PCR plasmid pIDT-fgf2 bằng cặp mồi FGF2F/FGF2-R; giếng 4, PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi FGF2-
F/FGF2-R; giếng 5, PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi T7promoter/T7terminator; giếng 6,7, PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi
T7promoter/T7terminator.
Cặp mồi FGF2-F/FGF2-R sẽ bắt cặp đặc hiệu với trình tự ở hai đầu gen nên đoạn khuếch đại sẽ có kích thƣớc 438bp. Cặp mồi T7promoter/T7terminator bắt cặp đặc hiệu với vùng T7promoter và T7terminator trên plasmid nên sản phẩm khuếch đại sẽ có kích thƣớc dự đoán sẽ là 618bp bao gồm gen fgf2 và một đoạn DNA trên plasmid pET-His.
Kết quả điện di cho thấy ở giếng 4 xuất hiện một vạch PCR có kích thƣớc nằm giữa hai vạch thang 250bp và 500bp, ngang với vạch PCR của mẫu chứng dƣơng (giếng 3). Trong khi đó, với đối chứng âm là plasmid pET-His không mang gen fgf-2 nên không xuất hiện vạch (giếng 2, hình 3.4).
Bên cạnh đó, ở giếng 6, sản phẩm PCR khuẩn lạc bằng mồi T7promoter /T7terminator cho sản phẩm PCR là một vạch nằm ở khoảng giữa vạch 500bp và 750bp của thang chuẩn, phù hợp với kích thƣớc đoạn mang gen giữa hai mồi theo dự đoán là 618bp. Đây là kích thƣớc của gen fgf2 (438bp) và một phần trình tự giữa hai mồi trên vector. Trong khi đó, sản phẩm PCR plasmid pET-His làm khuôn chỉ cho một vạch có kích thƣớc 180bp (giếng 5, hình 3.4). Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã sàng lọc đƣợc những khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pET-fgf2. Những khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính đƣợc tách plasmid, tiếp tục kiểm tra sự hiện diện của gen
fgf2 bằng phƣơng pháp PCR plasmid và enzyme cắt hạn chế.