NdeI
Thành phần của phản ứng cắt:
Plasmid pET-His 30µl Buffer Tango 10X 10µl Enzyme NdeI (10u/µl) 1µl Enzyme BamHI (10u/µl) 1µl dH2O 8µl
Tổng thể tích 50µl
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 37oC, 4 giờ. Sản phẩm cắt đƣợc tinh chế bằng bộ EZ10 Spin Column PCR Products Purification Kit.
2.2.1.4. Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pET-fgf2
Nhằm mục đích dòng hoá, gen mục tiêu đƣợc đƣa vào vector thông qua phản ứng nối dƣới hoạt động của enzyme T4 DNA ligase. T4 DNA ligase có khả năng nối hai trình tự DNA thông qua việc hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu 5’phosphate và đầu 3’OH của hai đoạn DNA.
Dƣới tác dụng của T4 DNA ligase, gen fgf-2 đƣợc nối vào plasmid pET-His, plasmid tái tổ hợp đƣợc tạo thành gọi là pET-fgf2.
Thành phần phản ứng nối như sau:
Buffer T4 DNA ligase 1,5 l Plasmid pET 3,0 l
Gen fgf-2 9,5 l T4 DNA ligase 1,0 l
Tổng thể tích 15,0 l
Phản ứng nối đƣợc tiến hành ở 11 oC trong 4 giờ. Sau đó hỗn hợp sản phẩm nối đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α.
2.2.1.5. Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5α a) Chuẩn bị tế bào E. coli DH5 khả nạp a) Chuẩn bị tế bào E. coli DH5 khả nạp
Phƣơng pháp hóa biến nạp dựa trên sự xáo trộn của màng tế bào do ion Ca2+ gây ra giúp DNA xâm nhập vào tế bào dễ dàng hơn. Quá trình sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây kích thích sự chuyển plasmid vào bên trong tế bào. Sau đó tế bào đƣợc nuôi lại trong môi trƣờng LB giúp tế bào hồi phục.
Thực hiện:
- Cấy một khuẩn lạc đơn E. coli DH5 vào 5ml môi trƣờng LB lỏng, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC. Hút 2,5ml dịch nuôi cấy trên vào erlen 1 lít chứa 250ml môi trƣờng LB lỏng, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút ở 37oC cho đến khi giá trị OD600 của dịch nuôi cấy đạt 0,6-0,8.
- Ngâm các erlen vào nƣớc đá trong 20-30 phút. Cho dịch nuôi cấy vào các ống falcon ly tâm đã đƣợc làm lạnh sẵn và ly tâm thu sinh khối tế bào ở 5.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC.
- Rửa sinh khối tế bào bằng dung dịch CaCl2-MgCl2 (20mM-80mM), vortex nhẹ, ly tâm thu sinh khối tế bào ở 5.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC.
- Thêm 3ml CaCl2 100mM và 1ml glycerol 80%, trộn nhẹ đều và cất giữ tế bào ở tủ âm.
Tất cả các bƣớc đƣợc thực hiện vô trùng.