Tách dòng và biểu hiện thành công gen mã hóa kháng nguyên 56 kdal. Đưa ra quy trình tối ưu điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa: môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, pH, nồng độ chất cảm ứng và thời gian biểu hiện. Tinh chế kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp có độ sạch cao, hoạt tính sinh học tốt.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRỊNH VĂN TOÀN NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN 56 KDA TÁI TỔ HỢP TỪ Orientia tsutsugamushi TRONG Escherichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ CAO HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRỊNH VĂN TOÀN NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN 56 KDA TÁI TỔ HỢP TỪ Orientia tsutsugamushi TRONG Escherichia coli Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 842010.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Phạm Bảo Yên TS Lê Thị Lan Anh Hà Nội – Năm 2018 LỜI CẢM ƠN ut t t v tr v t TS Lê Thị Lan Anh – P s us t ộc h c Các bệnh nhiệt đ i – Viện Y sinh nhiệt đ i – Trung tâm nhiệt đ i Việt-Nga TS Phạm Bảo Yên – PTN tr ng đ ểm công nghệ enzyme protein – Khoa Sinh h c – Trư nhiên – HQG H Nội nhữ động viên tạo m i Cô kính m ại h c Khoa h c tự t úp đỡ, dạy b o, đ ều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình h c tập, nghiên cứu hồn thành luậ vă tốt nghiệp t Tơi TS Võ Viết Cường anh chị Phòng Độc học Các bệnh nhiệt đới – Viện Y sinh nhiệt đ i ln tận tình b o, động viên cho l i khuyên quý báu suốt th i gian thực tâp T ũ t il ic t i cán nghiên cứu, kỹ thuật viên Viện Y sinh nhiệt đ i - Trung tâm nhiệt đ i Việt-Nga h tơi hồn thành luậ vă cách thuận lợi đ Ti p theo, t Trư oa tạo đ ều kiệ để tự cá T y C tro Khoa sinh h c – tận tình b o cho tơi suốt q trình tập tạ trư ng Cuố đì ù ù ,t è u đượ y tỏ ỗ trợ độ t v đ uy ữ t tro t tro suốt trì tập Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 01 năm 2019 Học viên Trịnh Văn Toàn a MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Bệnh sốt mò 1.1.1 Tác nhân gây bệnh .3 1.1.2 Đặc điểm lâm sàng bệnh sốt mò 1.1.3 Đáp ứng miễn dịch sốt mò 1.1.4 Chẩn đốn bệnh sốt mò 1.1.5 Điều trị 1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh sốt mò giới Việt Nam 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Tại Việt Nam 1.3 Cơ sở nghiên cứu kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp 10 1.3.1 Kháng nguyên màng 56 kDa .10 1.3.2 Nghiên cứu tạo kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp chẩn đốn sốt mò 12 1.3.3 Cơng nghệ protein tái tổ hợp 13 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu .17 2.1.1 Các chủng vi sinh vật plasmid 17 2.1.2 Hóa chất .17 2.1.3 Máy móc thiết bị 20 2.1.4 Vật tƣ tiêu hao 20 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Nhân gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa phƣơng pháp PCR 20 2.2.2 Điện di ADN gel agarose 21 2.2.3 Tạo dòng tế bào biểu mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa 22 2.2.4 Biểu kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp tế bào E coli Rosseta 122 2.2.5 Điện di SDS – PAGE 24 2.2.6 Thẩm tách miễn dịch Western blot 24 2.2.7 Tinh protein tái tổ hợp sắc ký lực 25 2.2.8 Thẩm tách loại muối 26 2.3 Một số phần mềm sử dụng luận văn .27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Tách dòng biểu đoạn gen mã hoá kháng nguyên 56 kDa E coli 28 3.1.1 Khuếch đại đoạn gen mã hoá kháng nguyên 56 kDa phƣơng pháp PCR 28 3.1.2 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa 29 3.1.3 Biểu gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa vi khuẩn E coli Rosseta 1………………….…………………………………………………………………30 3.1.4 Kiểm tra mức độ phản ứng protein tái tổ hợp với mẫu huyết bệnh nhân kỹ thuật Western blot 31 3.2 Lựa chọn số điều kiện biểu kháng nguyên 56 kDa 33 3.2.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng .33 3.2.2 Ảnh hƣởng nồng độ IPTG đến trình tổng hợp kháng nguyên 56 kDa 34 3.2.3 Ảnh hƣởng thời gian thu mẫu đến sinh tổng hợp kháng nguyên 56 kDa 36 3.3 Tinh kháng nguyên 56 kDa 37 3.3.1 Xử lý tiền tinh chế 37 3.3.2 Kết tinh kháng nguyên 56 kDa sắc ký lực 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Vi khuẩn O tsutsugamushi ấu trùng mò……………………………….3 Hình 2: Triệu chứng lâm sàng bệnh sốt mò .4 Hình 3: Phân bố địa lý kiểu gen O tsutsugamushi khu vực châu Á .8 Hình 4: Số ca bệnh sốt mò thu thập bệnh viện tỉnh Yên Bái, Hà Giang, Hà Nội Hình 5: Quan hệ phát sinh loài O tsutsugamushi .11 Hình 6: Lựa chọn vùng mã hóa kháng ngun 56 kDa………… ……………….13 Hình 7: Con đƣờng tạo thành protein tái tổ hợp 14 Hình 8: Chu trình nhiệt phản ứng PCR .21 Hình 9: Cột sắc kí lực Hitrap 26 Hình 10: Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa gel agarose 1% 28 Hình 11: Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc Rosetta sau biến nạp mang plasmid tái tổ hợp 29 Hình 12: Kết kiểm tra biểu protein tái tổ hợp HT-09, HT-11, HT49 YB-50 tế bào E coli Rosetta 31 Hình 13: Kết kiểm tra tính sinh miễn dịch protein tái tổ hợp Western blot 32 Hình 14: Ảnh hƣởng nhiệt độ lên khả tổng hợp kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp 33 Hình 15: Ảnh hƣởng nồng độ IPTG lên khả sinh trƣởng E coli tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp 34 Hình 16: Ảnh hƣởng nồng độ IPTG lên khả tổng hợp kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp tế bào E o mang HT09, HT11, HT49 YB50 35 Hình 17: Ảnh hƣởng thời gian thu mẫu đến sinh tổng hợp kháng nguyên 56 kDa 37 Hình 18: Kết xử lý tiền tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp 39 Hình 19: Kết tinh kháng nguyên tái tổ hợp .40 Hình 20: Kiểm tra bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể bẳng phƣơng pháp Western blot protein tái tổ hợp HT-09 , HT-11, HT-49 YB-50 sau tinh M ure 41 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các môi trƣờng sử dụng 17 Bảng 2: Các dung dịch sử dụng điện di SDS-PAGE 18 Bảng 3: Các dung dịch sử dụng tinh chế protein 18 Bảng 4: Các dung dịch sử dụng Western Blot 19 Bảng 5: Các dung dịch dùng điện di ADN gel agarose 19 Bảng 6: Một số dung dịch lên men 19 Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR đoạn gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa 21 Bảng 8: Thành phần phản ứng tạo plasmid tái tổ hợp 22 Bảng 9: Bảng thông số khảo sát riêng lẻ yếu tổ ảnh hƣởng đến biểu kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp .23 Bảng 10: Thành phần gel cô, gel tách điện di SDS-PAGE .24 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Nghĩa tiếng việt AD Antigenic determinant Vùng định kháng nguyên Amp Ampicillin Kháng sinh Ampicillin ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic ARN Ribonucleic acid Axit ribonucleic APS Ammonium persulfate Ammonium persulfate Bp Base pair Cặp bazơ-nitơ ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme IFA Immunofluorescence Assay Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang IgG Immunoglobulin G Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M Immunoglobulin M IPTG Isopropyl-beta-Dthiogalactoside Chất cảm ứng Isopropyl-betaD-thiogalactoside kDa Kilo Dalton Kilo Dalton LB Luria-Bertani Môi trƣờng LB dNTP Nucleoside 5´-triphosphates Nucleoside 5´-triphosphates OD Optical density Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp pLATE_56 Plasmid tái tổ hợp mang gen mã kDa hóa kháng nguyên 56 kDa Plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa PVDF Polyvinyl difluoride Polyvinylidin difluorit Rpm Revolutions per minute Vòng/phút SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodexin sunfat SDSPAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Điện di gel polyacrylamit có SDS TAE Tris-acetate-EDTA Tris-acetate-EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine VD Variable domains Vùng biến đổi kháng nguyên PBS Phosphate buffered saline Phosphate buffer salin ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh sốt mò hay sốt bụi rậm (scrub typhus) bệnh truyền nhiễm cấp tính, lƣu hành đe dọa sức khỏe ngƣời khu vực Châu Á - Thái Bình Dƣơng Theo thống kê, hàng năm giới có khoảng triệu ca bệnh tỷ ngƣời có nguy mắc bệnh [9, 26] Bệnh sốt mò thuộc nhóm bệnh lây truyền từ động vật sang ngƣời, tác nhân gây bệnh Orientia tsutsugamushi (tên gọi trƣớc Rickettsia tsutsugamushi) - loại vi khuẩn gram âm ký sinh nội bào bắt buộc, truyền bệnh cho ngƣời vật chủ trung gian qua vết đốt ấu trùng mò [26] Các nghiên cứu dịch tễ học bệnh sốt mò cho thấy khu vực lƣu hành O tsutsugamushi trải rộng từ Pakistan, Afghanistan tới Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, ph a đông Liên bang Nga tới quần khu vực Đông Nam Thái Bình Dƣơng, ph a bắc nƣớc c Bệnh sốt mò đƣợc chẩn đốn điều trị kịp thời kháng sinh thích hợp, bệnh khỏi sau 3-5 ngày Tuy nhiên, triệu chứng lâm sàng sốt mò đa dạng dễ nhầm với sốt khác nhƣ sốt rét, sốt xuất huyết, Do vậy, phần lớn bệnh nhân bị chẩn đoán sai dẫn đến tỷ lệ tử vong lên tới 30% [36] Hiện nay, bên cạnh dựa vào triệu chứng lâm sàng bệnh, bệnh viện lớn áp dụng nhiều phƣơng pháp chẩn đoán sinh học cho phát nhiễm O tsutsugamushi bao gồm phân lập vi khuẩn, xét nghiệm huyết học nhƣ IFA, ELISA, kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR Trong đó, phƣơng pháp ELISA dựa tƣơng tác đặc hiệu kháng nguyên vi khuẩn kháng thể thể sản xuất Sự bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể đƣợc phát thông qua phản ứng tạo màu phát huỳnh quang Đây phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm chẩn đốn sốt nhƣ nhƣ chẩn đoán nhanh, độ nhạy độ đặc hiệu cao, giá thành xét nghiệm thấp, thích hợp sử dụng vùng lƣu hành bệnh sốt mò Phân tích Western blot ly giải tồn tế bào O tsutsugamushi phát thấy kháng nguyên protein có trọng lƣợng phân tử lần lƣợt 22 kDa, 47 kDa, 56 kDa 110 kDa [32] Trong số kháng ngun kháng ngun protein khơng tan đƣợc lắng xuống dạng tủa (pha không tan) Pha tan không tan đƣợc thu lại kiểm tra điện di protein gel polyacrylamide 12,6% Kết khảo sát ban đầu cho thấy kháng nguyên tái tổ hợp 56 kDa biểu dạng không tan Để làm tăng t nh tan protein này, điều kiện biểu đƣợc khảo sát, nhiên, kết cho thấy kháng nguyên HT-09, HT-11, HT-49 YB-50 biểu dạng khơng tan (đƣờng chạy P1, hình18) Kết hồn tồn phù hợp với nghiên cứu trƣớc (10) Để thuận lợi cho trình tinh chế, mẫu protein dạng không tan đƣợc làm tan nồng độ ure khác từ 0, 2, 4, M Kết cho thấy kháng nguyên HT-11 YB-50 tan tốt nồng độ M ure (hình 18 B, D, đƣờng chạy S4) tan nồng độ M ure (phụ lục), HT-09 HT-49 tan tƣơng đối tốt nồng độ M ure (hình 18 A, C, đƣờng chạy S4) tan gần nhƣ hoàn toàn nồng độ M ure (phụ lục) Sau trình xử lý protein nồng độ ure từ thấp đến cao, kết cho thấy protein đ ch tan chủ yếu nồng độ M ure (hình 18), protein tạp đƣợc loại bỏ hiệu qua bƣớc làm tan tủa, kết phù hợp với công bố trƣớc Các nghiên cứu Cao cộng năm 2007, Ching cộng năm 1998 cho thấy kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp tan tốt nồng độ M ure [10] nhiên số nghiên cứu khác nồng độ M ure nồng độ phù hợp để làm tan protein tái tổ hợp 56 kDa [14] Căn vào kết hình 18 để giảm chi phí cho q trình xử lý tiền tinh chế thuận lợi cho trình loại ure sau tinh sạch, nồng độ M ure đƣợc lựa chọn để hòa tan kháng nguyên tái tổ hợp HT-09, HT-11, HT-49 YB-50 Dịch protein hòa tan M ure đƣợc thu lại đƣa lên cột sắc ký lực Hitrap HP chelating ml để tiến hành tinh protein 38 B A D C Hình 18: Kết xử lý tiền tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp HT09 (A), HT-11 (B), HT-49 (C) YB-50 (D) ure TS Protein tổng số, S1 Protein pha tan, P1 Protein pha không tan, S2 Protein tan M ure, P2 Protein không tan M ure, S3 Protein tan M ure, P3 Protein không tan M ure, S4 Protein tan M ure, P4 Protein không tan M ure 3.3.2 Kết tinh kháng nguyên 56 kDa sắc ký lực Trong thí nghiệm này, dung dịch protein tan M ure đƣợc đƣa lên cột sắc ký lực Hitrap HP Chelating ml Protein đƣợc đƣa lên cột dung dịch đệm chứa 10 mM Imidazole, phân đoạn chứa protein sau tinh đƣợc thu dung dịch đệm chứa 100 mM Imidazole Các phân đoạn chứa protein tái tổ hợp đƣợc tiến hành điện di kiểm tra gel polyacrylamide Kết cho thấy, kháng nguyên HT-09, HT-11, HT-49 YB-50 tập trung chủ yếu phân đoạn E3, E4 E5 39 (hình 19) Hàm lƣợng protein sau tinh kháng nguyên HT-09, HT-11, HT49 YB-50 phân đoạn E4 có giá trị lần lƣợt 12,57 mg/ml; 11,6 mg/ml; 8,98 mg/ml 8,02 mg/ml Sử dụng phần mềm phân t ch độ protein Gel Analyzer để kiểm tra độ protein sau tinh Kết kháng nguyên sau tinh có độ 95% Ngoài ra, suất tạo protein 56 kDa tái tổ hợp đạt đƣợc lần lƣợt 31,3 mg/L (HT-09), 28,6 mg/L (HT-11), 22,15 mg/L (HT-49) 19,77 mg/L (YB-50) cao so với nghiên cứu trƣớc [10,17] M BF FT W E3 E4 E5 E6 E7 E8 C B A C D Hình 19: Kết tinh kháng nguyên tái tổ hợp HT-09 (A) , HT-11 (B), HT49 (C) YB-50 (D) BF Dung dịch protein trƣớc qua cột, FT Dung dịch qua cột, W Dung dịch rửa cột, E3-E9 Các phân đoạn protein thu đƣợc nồng độ 100 mM Imidazole, M Thang chuẩn protein (Thermo Scientific) 40 Kiểm tra tính bắt cặp đặc hiệu với kháng thể phƣơng pháp Western blot cho thấy protein tái tổ hợp sau tinh bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng O tsutsugamushi với băng protein đậm xuất màng lai với k ch thƣớc nhƣ tính tốn khoảng 50 kDa (hình 20) Phân đoạn E4 E5 protein đƣợc hoà với để tiến hành thẩm tích loại ure Dung dịch protein sau thẩm tích đƣợc sử dụng làm nguyên liệu chế tạo kít ELISA phát nhiễm O tsutsugamushi YB-50 HT-09, HT-49 HT-11 M kDa 120 85 50 35 25 20 Hình 20: Kiểm tra bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể bẳng phƣơng pháp Western blot protein tái tổ hợp HT-09 , HT-11, HT-49 YB-50 sau tinh M ure Đƣờng chạy 1.YB-50, đƣờng chạy HT-09, đƣờng chạy HT-49, đƣờng chạy HT-11, M Thang chuẩn protein (Thermo Scientific) 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Tách dòng thành cơng đoạn gen mã hóa kháng nguyên HT-09, HT-11, HT-49 YB-50 tế bào E coli DH5α - Biểu thành công kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp tế bào E coli Rosetta - Khảo sát đƣợc số điều kiện lên men ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp protein 56 kDa tái tổ hợp nhƣ sau: Nhiệt độ Nồng độ IPTG (mM) Thời gian thu mẫu (giờ) HT09 37oC 0,1 HT11 30oC 0,1 HT49 o 30 C 0,5 YB50 37oC 0,5 - Tinh thành công kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp sắc ký lực Đề xuất - Bốn protein tái tổ hợp 56 kDa đƣợc sử dụng làm nguyên liệu chế tạo kit ELISA phát nhiễm O tsutsugamushi gây bệnh sốt mò 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Minh, N.V (2017), ''Đặc điểm di truyền phân tử vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây bệnh sốt mò số tỉnh phía Bắc'', Tạp chí khoa h c cơng nghệ nhiệt đ i, số 13, pp tr 59-66 Châu, N.V (2003), ''Tìm hiểu phân bố lồi mò (trombiculidae) liên quan đến phân bố sốt mò (tsutsugamushi) số địa phƣơng thuộc tỉnh Quảng Ninh'', Tạp chí Phòng chống sốt rét, (số 6), pp tr 5363 Hằng, N.L.K (2016), ''Xác định nhiễm Orientia tsutsugamushi bệnh nhân nghi nhiễm sốt mò đến điều trị số bệnh viện Hà Nội, 2015-2016'', Tạp chí Y h c dự phòng, số 8, pp tr 55-60 Hành, N.B (2009), ''Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng điều trị sốt mò bệnh viện 87, Nha Trang – Khánh Hòa năm 2008 – 2009'', Tạp Dược lâm sàng 108, pp tr 111 – 118 Vân, L.T.H (2014), ''Tình hình sốt mò n Bái năm 2014'', Nhà xuất b n khoa h c tự nhiên công nghệ, pp tr 172-179 Tiếng Anh: Biswal, M., A Kumar, N Sharma, A Bhalla, S Singhi, and S Sethi (2016), ''Genetic diversity of Orientia tsutsugamushi strains from patients in North India'', International Journal of Infectious Diseases, 45, pp 166-167 Cao, M., L Che, J Zhang, J Hu, S Srinivas, R Xu, H Guo, Y Zhang, C Wang, and Y Feng (2016), ''Determination of scrub typhus suggests a new epidemic focus in the Anhui Province of China'', Scientific reports, 6, pp 20737 43 Chen, W.-J., D.-S Niu, X.-Y Zhang, M.-L Chen, H Cui, W.-J Wei, B.-H Wen, and X.-R Chen (2003), ''Recombinant 56-kilodalton major outer membrane protein antigen of Orientia tsutsugamushi Shanxi and its antigenicity'', Infection and immunity, 71 (8), pp 4772-4779 Ching, W.-M., L Jiang, E.K Morris, R Aguilera-Olvera, Z Zhang, T.C Chan, C.-C Chao, and S.A Casares (2018), ''Dissemination of Orientia tsutsugamushi, a causative agent of scrub Typhus, and immunological responses in the humanized Draga Mouse'', Frontiers in immunology, 9, pp 816 10 Ching, W.-M., H Wang, C Eamsila, D Kelly, and G Dasch (1998), ''Expression and refolding of truncated recombinant major outer membrane protein antigen (r56) of Orientia tsutsugamushi and its use in enzyme-linked immunosorbent assays'', Clinical and diagnostic laboratory immunology, (4), pp 519-526 11 Coleman, R.E., V Sangkasuwan, N Suwanabun, C Eamsila, S Mungviriya, P Devine, A.L Richards, D Rowland, W.-M Ching, and J Sattabongkot (2002), ''Comparative evaluation of selected diagnostic assays for the detection of IgG and IgM antibody to Orientia tsutsugamushi in Thailand'', The American journal of tropical medicine and hygiene, 67 (5), pp 497-503 12 Fernandez, J.M and J.P Hoeffler, Gene expression systems: using nature for the art of expression 1998: Elsevier 13 Kelly, D.J., P.A Fuerst, W.-M Ching, and A.L Richards (2009), ''Scrub typhus: the geographic distribution of phenotypic and genotypic variants of Orientia tsutsugamushi'', Clinical Infectious Diseases, 48 (Supplement_3), pp S203-S230 44 14 Kim, D.-M., H.L Kim, C.Y Park, T.Y Yang, J.H Lee, J.T Yang, S.K Shim, and S.-H Lee (2006), ''Clinical usefulness of eschar polymerase chain reaction for the diagnosis of scrub typhus: a prospective study'', Clinical infectious diseases, 43 (10), pp 12961300 15 Kim, D., Y.M Lee, J.H Back, T Yang, J Lee, H.J Song, S.K Shim, K.J Hwang, and M.Y Park (2010), ''A serosurvey of Orientia tsutsugamushi from patients with scrub typhus'', Clinical Microbiology and Infection, 16 (5), pp 447-451 16 Kim, G., N.-Y Ha, C.-K Min, H.-I Kim, N.T.H Yen, K.-H Lee, I Oh, J.-S Kang, M.-S Choi, and I.-S Kim (2017), ''Diversification of Orientia tsutsugamushi genotypes by intragenic recombination and their potential expansion in endemic areas'', PLoS neglected tropical diseases, 11 (3), pp e0005408 17 Kim, I.-S., S.-Y Seong, S.-G Woo, M.-S Choi, and W.-H Chang (1993), ''High-level expression of a 56-kilodalton protein gene (bor56) of Rickettsia tsutsugamushi Boryong and its application to enzymelinked immunosorbent assays'', Journal of clinical microbiology, 31 (3), pp 598-605 18 Lee, Y.-M., D.-M Kim, S.-H Lee, M.-S Jang, and G.P Neupane (2011), ''Phylogenetic analysis of the 56 kDa protein genes of Orientia tsutsugamushi in Southwest Area of Korea'', The American journal of tropical medicine and hygiene, 84 (2), pp 250-254 19 Liu, Q and R Panpanich (2002), ''Antibiotics for treating scrub typhus'', Cochrane Database of Systematic Reviews, (3), pp 20 Moffatt, B.A and F.W Studier (1987), ''T7 lysozyme inhibits transcription by T7 RNA polymerase'', Cell, 49 (2), pp 221-227 45 21 Novagen, I., pET system manual 2002, Novagen Madison, WI 22 Ohashi, N., A Tamura, and T Suto (1988), ''Immunoblotting analysis of anti-rickettsial antibodies produced in patients of tsutsugamushi disease'', Microbiology and immunology, 32 (11), pp 1085-1092 23 Paris, D.H., T.R Shelite, N.P Day, and D.H Walker (2013), ''Unresolved problems related to scrub typhus: a seriously neglected life-threatening disease'', The American journal of tropical medicine and hygiene, 89 (2), pp 301-307 24 Rai, J (1979), ''Studies on soluble complement fixing antigen of Rickettsia tsutsugamushi'', Indian Journal of Medical Research, 70, pp 942-953 25 Rapsang, A.G and P Bhattacharyya (2013), ''Scrub typhus'', Indian journal of anaesthesia, 57 (2), pp 127 26 Rodkvamtook, W., T Ruang-areerate, J Gaywee, A.L Richards, P Jeamwattanalert, D Bodhidatta, N Sangjun, A Prasartvit, A Jatisatienr, and C Jatisatienr (2011), ''Isolation and characterization of Orientia tsutsugamushi from rodents captured following a scrub typhus outbreak at a military training base, Bothong district, Chonburi province, central Thailand'', The American journal of tropical medicine and hygiene, 84 (4), pp 599-607 27 Rodkvamtook, W., Z Zhang, C.-C Chao, E Huber, D Bodhidatta, J Gaywee, J Grieco, N Sirisopana, M Kityapan, and M Lewis (2015), ''Dot-ELISA rapid test using recombinant 56-kDa protein antigens for serodiagnosis of scrub typhus'', The American journal of tropical medicine and hygiene, 92 (5), pp 967-971 46 28 Rosano, G.L and E.A Ceccarelli (2014), ''Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges'', Frontiers in microbiology, 5, pp 172 29 Sezonov, G., D Joseleau-Petit, and R D'Ari (2007), ''Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth'', Journal of bacteriology, 189 (23), pp 8746-8749 30 Sharma, P., R Kakkar, S.N Kaore, V.K Yadav, and R Sharma (2010), ''Geographical distribution, effect of season & life cycle of scrub typhus'', JK Science, 12 (2), pp 63 31 Swierzko, A., M Cedzynski, Y Knirel, S Senchenkova, N Kocharova, A Shashkov, K Amano, K Kyohno, and W Kaca (1997), ''Structural and serological studies of the O-antigen of the bacterium Proteus mirabilis OXK (serogroup O3) used in the Weil-Felix test'', Biochemistry Biokhimiia, 62 (1), pp 21-27 32 Tamura, A., N Ohashi, H Urakami, K Takahashi, and M Oyanagi (1985), ''Analysis of polypeptide composition and antigenic components of Rickettsia tsutsugamushi by polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting'', Infection and immunity, 48 (3), pp 671-675 33 Tay, S., M Rohani, T Ho, and S Devi (2002), ''Expression of recombinant proteins of Orientia tsutsugamushi and their applications in the serodiagnosis of scrub typhus'', Diagnostic microbiology and infectious disease, 44 (2), pp 137-142 34 Tsai, C.-C., C.-J Lay, C.-L Wang, Y.-H Ho, L.-S Wang, and L.-K Chen (2010), ''Levofloxacin versus tetracycline antibiotics for the treatment of scrub typhus'', International Journal of Infectious Diseases, 14 (1), pp e62-e67 47 35 Valderrama-Rincon, J.D., A.C Fisher, J.H Merritt, Y.-Y Fan, C.A Reading, K Chhiba, C Heiss, P Azadi, M Aebi, and M.P DeLisa (2012), ''An engineered eukaryotic protein glycosylation pathway in Escherichia coli'', Nature chemical biology, (5), pp 434 36 Xu, G., D.H Walker, D Jupiter, P.C Melby, and C.M Arcari (2017), ''A review of the global epidemiology of scrub typhus'', PLoS neglected tropical diseases, 11 (11) 37 http://www.impehcm.org.vn 48 PHỤ LỤC: Trình tự gen HT09 ATGACAATTG CTCAAGGTTT TAGAGCAGAG CTGGGGGTTA TGTACCTTAC AAATATAACT GCTCAGGTTG AAGAAGGTAA AGTTAAGGCA GATTCTGGAG GTAAGACAAA GGCAGATTCT GGAGGTGAGA TAAAGGCAGA TTCTGGAGGT GGGACAGATG CTCCTATACG TAAGCGGTTT AAACTTACAC CTCCTCAGCC TACTATAATG CCTATAAGTA TAGCTGATCG TGACTTTGGG ATTGATATTC GTAACATACC TCAGGCGCAA GCTGGGAATC TTAATAATGA GCAGCGTGCT GCAGCTAGGA TCGCTTGGTT AAAGAATTGT GCTGGTATTG ACTATAGGGT AAAAGATCCT AATAATCCTA ATGGGCCTAT GGTTATAAAT CCGATATTGT TAAATATTCC ACAGGGTAAC CCTATTCCTG TTGGAAATCA GCGAGCACAG CAGCCTGCAG GGTTTGCGAT ACATGACCAT GAGCAATGGA GGTATTTGGT AACTGGTCTT GCTGCATTAT CAAATGCTAA TAAACCTAGC GCTTCTCCTG TCAAAGTATT AAGTGAAAAA ATTACTCAGA TATATAGTGA TATAAAGCTA TTTGCTGATA TAGCTGGTAT TGATGTTCCT GATGCTGGTT TGCCTAATAG TGCAACTGTC GAACAGATAC AGAATAAAAT ACAAGAATTA AACGATGTAT TGGAAGAGCT CAGAGAATCT TTTGATGGGT ATCTTGGTGG TAATGCTTTT GCTAATCAGA TACAGTTGAA TTTTGTCATG CCGCAGCAAG CACAGCAGCA GGGGCAAGGG CAGCAACAGC AAGCTCAAGC TACAGCGCAA GAAGCAGTAG CAGCAGCAGC TGTTAGGCTT TTAAATGGCA ATAATCAGAT TGAGCAGTTA TATAGAGATC TTGTTAAATT GCAGCGTCAT GCAGGAATTA AGAAAGCAAT GGAAAAATTA GCTGCCCAAC AAGAAGAAGA TGCAAAGAAT CAAGGTGAAG GTGACTGCAA GCAGCAACAA GGAACATCTG AAAAATCTAA AGAAGGAAAA GCCAAAGAGG CAGAGTTTGA TCTGAGTATG ATTGTTGGCC AAGTTAAACT CTATGCTGAC GTAATGATAA CTGAATCATT CTCAATATAT GCTGGTGTT Trình tự gen HT11 ATGACAATTG CTCAAGGTTT TAGAGCAGAG CTGGGGGTTA TGTACCTTAG AAATATAAGC GCTGAGGTTG AAGTAGGTAA AGGCAAGGTA GATTCTAGAG GTGAGGTAAA GGCAGATTCT GGATGTGGGA TAGATGCTCC TATACGTAAG CGGCCTAAAC TTACACCACC TCAGCCTACT ATAATGCCTA TAAGTATAGC TGATCGTGAT GAGGGGGTTG ATACTGATAT TCTTGCTCAG GCTGCTGCTG GGCAACCACA GCTTACTGTT GAGCAGCGTG CTGCAGAGAG GATTGCTTGG TTGAAGAATT ATGCTGGTAT TGACTATATG GTCCCAGATC CTCAGAATCC TCATGCTAGA GTTATAAATC CTGTGTTGTT AAATATTACT CAAGGGCCAC CTAACGTACA GCCTAGACCT CGGCAAGATC TTAACATACT TGACCATGTT CAGTGGAGAC ATTTGGTAGT TGGTGTTACT GCATTGTCAC ATGCTAATAA ACCTAGTGTT ACTCCTGTCA AAGTATTAAG TGACAAAATT ACTAAGATAT ATAGTGATAT AAGACAATTC GCTAAGATAG CTAATATCGA AGTTCCTGAT GCTCCTTTGC CTAATAGTGC ATCTGTTGAA CAGATACAGG CTAAAATGGA AGAATTAAAT AATATCTTGG AAGAGCTCAG AGAATCTTTT GATGGGTATC TTGCTAATGC TTTTACTAAT 49 CAGATTCAGT TAAATTTTCG GATTCCGCAA GCGCAGCAAC AGCAGCAAGG ACAGCAACAG CAGCAAGGAC AAGTTACAGC TCAAGATGCA GCAGCAGCTG CAGCTGTTAG GGCTTTAAAT GGCAATGAAC AGATTATACA GTTATATAAA GATCTTGTTA AATTGCAGCG TCATGCAGGA ATTAGGAAGG CTATGGAACA ATTGGCTGCC CAAGAAGAAG GTGATGATCA AAATCAAGGA AGTTGCAAGG ATAAGAAGCA GCAAATAGCA ACTGAAGACT CTAAAAAAGA AAAAGGCAGA GAAACAGAGT TTGATCTGAG TATGATTGTT GGCCAAGTTA AACTCTATGC TGACTTATTT ACAACTGAAT CATTCTCAAT ATATGCTGGT GTT Trình tự gen HT49 ATGACAATTG CTCAAGGTTT TAGAGCAGAG CTGGGGGTTA TGTACCTTAC AAATATAACT GCTCAGGTTG AAGAAGGTAA GGGCAAAATA GGTTCTGATG TTGCTAAAGG TTCTGATGCT GCTAATGATA ACACTGGTAC GGATGCAAAT CAGGCAAAAC AACTTAAGCG ACCTCCTAAA CTTACACCGC CTCAACCTGT TATAATGCCT ATAAGTACAG CTGATCGTGA TATGGGTGTT GATGTTATTA ATGAGCCTCA AGCTCAAGTA CCACAAGCTC AGCAAAATGA TCCTCTTGTT CGTGGATTAC GTAGGATTGC TTGGTTAAAA CAGTATGCTG GTATTGACTA TATGGTGAAG GATCCTAATA ATCCTGGGCA GATGATGGTA AATCCTGTGT TGTTAAATAT TCCTCAAGGT CCGCCTGCTA ATAATCCAAG AGCGCCTATG CAACGTTGTG ATATACTTAA TCATGATCAC TGGAGGCATT TAGTAGTTGG TATTGCTGCA TTATCAAATG CTAATAAACC TAGCGCTTCT CCTGTCAAAG TATTAAGTGA TAAAATTACT CAGATATATA GTGATATAAA GCCATTTGCT GATATAGCTG GTATTGATGT TCCTGATACT GGTTTGCCTA ATAGTGCGTC TGTCGAACAG ATACAGAGAA AAATGCAAGA ATTAAATGAT GTATTGGAAG GACTCAGAGA TGCTTTTGAT GGGTATATTA ATAACGCTTT CGTTGATCAG ATACAGTTGA ATTTTGTCAT GCCGCCGCAA GCACAGCAGC AGCAGGGGCA AGGGCAGCAA CAGCAAGCTC AAGCTACAGT GCAAGAAGCA GTAGCAGCAG CAGCTGTTAG GCTTTTAAAT GGCAATGATC AGATTGCGCA GTTATATAAA GATCTTGTTA AATTGCAGCG TCATGCAGGA ATTAAGAAAG CGATGGAAAA ATTAGCTGCC CAACAAGAAG AAGATGCAAA GAATCAAGGT GAAGGTGACT GCAAGCAGCA ACAAGGAGCA TCTGAAAAAT CTAAAAAAGG AAAAGACAAA GAGGCAGAGT TTGATCTGAG TATGATTGTC GGCCAAGTTA AACTCTATGC TGACTTATTT GCAACTGAAT CATTCTCAAT ATATGCTGGT CTT Trình tự gen YB50 ATGACAATTG CTCAAGGTTT TAGAGCAGAG CTGGGGGTTA TGTACCTTAC AAATATAACT GCTCAGGTTG AAGAAGGTAA GGGCAAAATA GGTTCTGATG TTGCTAAAGG TTCTGATGCT GCTAATGATA ACACTGGTAC GGATACAAAT CAGGCAAAAC AACTTAAGCG ACCTCCTAAA CTTACACCGC CTCAACCTGT TATAATGCCT ATAAGTACAG CTGATCGTGA TATGGGTGTT GATGTTATTA ATGAACCTCA AGCTCAAGTA CCACAAGCTC AGCAAAATGA TCCTCTTGTT CGTGGATTAC GTAGGATTGC TTGGTTAAAA CAGTATGCTG GTATTGACTA TATGGTGAAG GATCCTAATA ATCCTGGGCA GATGATGGTA AATCCTGTGT TGTTAAATAT TCCTCAAGGT 50 CCGCCTGCTA ATAATCCAAG AGCGCCTATG CAACGTTGTG ATATACTTAA TCATGATCAC TGGAGGCATT TAGTAGTTGG TATTGCTGCA TTATCAAATG CTAATAAACC TAGCGCTTCT CCTGTCAAAG TATTAAGTGA TAAAATTACT CAGATATATA GTGATATAAA GCCATTTGCT GATATAGCTG GTATTAATGT TCCTGATACT GGTTTGCCTA ATAGTGCGTC TGTCGAACAG ATACAGAGAA AAATGCAAGA ATTAAATGAT GTATTGGAAG AACTCAGAGA TGCTTTTGAT GGGTATATTA ATAACGCTTT CGTTGATCAG ATACAGTTGA ATTTTGTCAT GCCGCCGCAA GCACAGCAGC AGCAGGGGCA AGGGCAGCAA CAGCAAGCTC AAGCTACAGT GCAAGAAGCA GTAGCAGCAG CAGCTGTTAG GCTTTTAAAT GGCAATGATC AGATTGTGCA GTTATATAAA GATCTTGTTA AATTGCAGCG TCATGCAGGA ATTAAGAAAG CGATGGAAAA ATTAGCTGCC CAACAAGAAG AAGATGCAAA GAATCAAGGT GAAGGTGACT GCAAGCAGCA ACAAGGAGCA TCTGAAAAAT CTAAAGAAGG AGGAAAAGGC AAAGAGGCAG AGTTTGATCT GAGTATGATT GTCGGCCAAG TTAAACTCTA TGCTGACGTA ATGATAACTG AATCATTCTC AGTATATGCT GGTGTT Sơ đồ hệ thống vector pLATE 51 Các dòng tế bào chọn lọc Xử lý tiền tinh chế kháng nguyên kDa tái tổ hợp Ure 8M: 8M ure 8M ure 8M ure 8M ure M P5 S5 M P5 S5 M P5 S5 M P5 S5 HT09 HT11 HT49 52 YB50 ... tế thực đề tài: “NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN 56 KDA TÁI TỔ HỢP TỪ Orientia tsutsugamushi TRONG Escherichia coli”, kết nghiên cứu đề tài tạo tiền đề cho nghiên cứu sản xuất kit... nhiệt độ lên khả tổng hợp kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp 33 Hình 15: Ảnh hƣởng nồng độ IPTG lên khả sinh trƣởng E coli tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp 34 Hình... HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRỊNH VĂN TOÀN NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN 56 KDA TÁI TỔ HỢP TỪ Orientia tsutsugamushi TRONG Escherichia coli Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm