1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Nghiên cứu biểu hiện tối ưu lên men và tinh chế interleukin 2 người tái tổ hợp dạng cải biến trong escherichia coli

62 7 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 62
Dung lượng 2,26 MB

Nội dung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -*** Lê Phƣơng Hoàng Anh NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TỐI ƢU LÊN MEN VÀ TINH CHẾ INTERLEUKIN-2 NGƢỜI TÁI TỔ HỢP DẠNG CẢI BIẾN TRONG ESCHERICHIA COLI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS TS Trƣơng Nam Hải Hà Nội 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới GS TS Trương Nam Hải – Trưởng phòng Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi suốt thời gian tơi hồn thành khóa luận Tiếp đến xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy, cô trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái Tài Nguyên sinh vật, thầy, cô Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giảng dạy cho tơi suốt thời gian tham gia khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn tồn thể cán nghiên cứu, nhân viên phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học Công ty TNHH Vắc xin Sinh phẩm số 1(Vabiotech) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam tận tình bảo động viên cho lời khuyên quý giá công việc sống Và sau cùng, tình cảm chân thành tơi xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình, người hết lịng ủng hộ động viên tơi suốt thời gian học tập công tác Hà Nội, ngày 02 tháng 12 năm 2013 Học viên cao học Lê Phƣơng Hồng Anh ii Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Tổng quan ung thƣ 1.1.1 Ung thƣ 1.1.2 Tình hình ung thƣ Việt Nam giới 1.1.3 Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ 10 1.1.4 Liệu pháp chữa trị ung thƣ miễn dịch .11 1.2 Interleukin 12 1.2.1 Cấu trúc gene protein Interleukin 12 1.2.2 Hoạt tính sinh học 13 1.2.3 Interleukin chữa trị ung thƣ 15 1.3 Hệ biểu E coli .16 1.3.1 Hệ biểu E coli BL21 .17 1.3.2 Vector biểu pET22b(+) 18 1.4 Sắc ký sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .20 1.5 Tối ƣu hóa ni cấy tăng sản lƣợng IL-2 phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert 7.0 23 Chƣơng - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 2.1 Vật liệu 25 2.1.1 Các chủng vi sinh vật, plasmid .25 2.1.2 Hóa chất, enzyme, phần mềm 25 2.1.3 Máy móc .25 2.2 Phƣơng pháp 25 2.2.1 Tách chiết DNA plasmid từ E coli .26 2.2.2 Điện di DNA gel agarose 27 2.2.3 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp E coli BL21 27 2.2.4 Phƣơng pháp giải trình tự gene .28 iii Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2.2.5 Tối ƣu hóa điều kiện lên men phần mềm Design expert 7.0 28 2.2.6 Phƣơng pháp điện di protein gel polyacrylamide .30 2.2.7 Phƣơng pháp kiểm tra protein phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Western Blot 31 2.2.8 Phá tế bào phƣơng pháp siêu âm xử lý mẫu protein IL-2 trƣớc tinh chế 32 2.2.9 Tinh chế protein hệ sắc ký đảo pha RP-HPLC .33 2.2.10 Xác định độ tinh khiết sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau tinh 33 2.2.11 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng IL-2 ELISA 34 Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Giải trình tự gene mã hóa cho IL-2 đƣợc cải biến 36 3.2 Biểu gene il2 chủng vi khuẩn tái tổ hợp E coli BL21 38 3.3 Tối ƣu điều kiện lên men E coli sản xuất IL-2 tái tổ hợp dạng cải biến phần mềm design expert 39 a Khảo sát yếu tố 40 b Tối ƣu phần mềm 41 3.4 Tinh IL-2 từ dòng tế bào E coli .46 3.5 Xác định độ mẫu IL-2 sau tinh chế phần mềm Quantity One… .48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iv Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp base pair (cặp bazơ) IARC International Agency for Research on Cancer (Cơ quan nghiên cứu Quốc tế Ung thƣ) IFN interferon TNF tumor neucrosis factor (là cytokine tham gia vào trình làm chết tế bào ung thƣ) Amp Ampicilin DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside LB Luria-betani medium MCS Multiple cloning site PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris Acetate EDTA SDS Sodium dodecyl sulphate BSA Bovine serum albumin (Huyết bò) dH2O distilled water (nƣớc khử trùng) v/p vòng phút M mol/L ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay v Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1 Hình ảnh hiển vi biểu thị tế bào ung thƣ vú tế bào vú thƣờng .6 Hình Mẫu ung thƣ tế bào thận RCC giải phẫu Nhiều tế bào thận bị thay tế bào ung thƣ Hình 3: Ung thƣ hắc tố da .8 Hình Hai mƣơi loại ung thƣ phổ biến Hình Cấu trúc không gian Interleukin 12 Hình 6: Sự kích thích tăng sinh biệt hóa IL-2 lên tế bào T .14 Hình 7: Cơ chế hoạt động Interleukin 15 Hình 8: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+ .19 Hình 9: Cơ chế kiểm soát biểu gene nhờ chất cảm ứng IPTG 20 Hình 10: Mơ hình hệ thống HPLC .21 Hình 11: Mơ hình mơ tả hấp thụ đoạn peptide pha tĩnh sắc ký đảo pha 22 Hình 1: Cơng cụ RSM-CCD phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert 7.0………………………………………………………………………………… 29 Hình 1: Kết điện di kiểm tra plasmid gel Agarose…………………………………………………………………………… 37 Hình 2: Kết kiểm tra khả biểu IL-2 số dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang plasmid pET22-IL-2 39 Hình 3: Sơ đồ tối ƣu lên men vi khuẩn tái E coli tái tổ hợp sản xuất IL-2 .40 Hình 3.4: Sơ đồ biểu thị kết khảo sát ảnh hƣởng nhân tố riêng rẽ (nhiệt độ biểu hiện, thời gian biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng IPTG) dòng tế bào tái tổ hợp E coli Bl21 mang vector biểu pET22b-IL-2 41 Hình 5: Chi tiết thiết kế hàm lƣợng IL-2 sau thực 20 thí nghiệm .42 Hình 6: Kết tiến hành 20 thí nghiệm đánh giá phƣơng pháp ELISA điện di SDS– PAGE .43 Hình 7: Đồ thị mơ hình 20 thí nghiệm phần mềm Design Expert 7.0 44 Hình 8: Kết biểu dự đoán mà phầm mềm đƣa .45 Hình 9: Kết tiền xử lý tinh chế phá tế bào thu dịch thô IL-2 47 Hình 10: Kết tinh chế IL-2 hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC 48 Hình 11: Xác định thành phần độ tinh khiết protein 49 vi Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Một số oncogene tumor suppressor genes liên quan đến ung thƣ ngƣời Bảng 2.1 Công thức chế gel acrylamide……………………… ………… 30 Bảng 1: Điều kiện biểu giải pháp mà phần mềm đƣa nhằm tìm điều kiện tối ƣu cho lên men 45 Bảng 2: Thơng số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết sản phẩm phần mềm Quantity One 49 vii Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Cytokine sản phẩm hệ miễn dịch, đƣợc nhiều loại tế bào tiết Về chức chúng có tác dụng đa hƣớng, đa tác dụng ngƣợc trở lại tế bào tiết chúng Các nghiên cứu cytokine có liên quan khơng với nguyên nhân gây ung thƣ mà liên quan tới khả chữa trị bệnh ung thƣ Việc lựa chọn yếu tố liên quan đến trình hình thành phát triển ung thƣ mang tính định đến việc sử dụng cytokine điều trị bệnh Hiện có nhiều loại cytokine đƣợc phát triển thành dƣợc phẩm thƣơng mại Trong số Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp loại cytokine đƣợc thƣơng mại hóa sớm đƣợc cấp phép sử dụng quan quản lý thuốc thực phẩm Hoa Kỳ (US Food and Drug Administration-FDA) cấp phép sử dụng điều trị (1992) IL-2 có khả chữa trị ung thƣ vú, ung thƣ phổi,… đặc biệt hai loại ung thƣ hắc tố da ung thƣ biểu mô tế bào thận Trƣớc để có đƣợc IL-2 tinh khiết sử dụng điệu trị, sản phẩm thƣờng đƣợc tách chiết từ dòng tế bào T tự nhiên hay việc ni cấy tế bào động vật, ví dụ nhƣ tế bào ung thƣ hạc bạch huyết dòng Daudi Mặc dù IL2 sản xuất theo đƣờng có số hạn chế lƣợng IL-2 tách chiết thấp khơng đáp ứng đủ nhu cầu, hoạt tính sinh học riêng thấp (105 đến 106 U/mg), thƣờng tạo thành sản phẩm có dạng glycosyl hóa cao, tạo hiệu ứng không mong muốn tới sản phẩm sử dụng điều trị Do hƣớng tạo IL-2 ngƣời công nghệ Công nghệ DNA tái tổ hợp đƣợc mở nhằm tạo đƣợc lƣợng lớn IL-2 Trên giới, sản phẩm IL-2 thƣơng mại chủ yếu đƣợc sản xuất dựa công nghệ DNA tái tổ hợp Sản phẩm thƣơng mại Proleukin (Aldesleukin) công ty Chiron (Hoa Kỳ) sản xuất nhờ biểu vi khuẩn Escherichia coli ví dụ Trong q trình sản xuất nhằm tăng hoạt tính tăng tính an tồn cho sản phẩm trình tự amino acid IL-2 đƣợc cải biến Tên hóa học sản phẩm desalanyl-1, serein-125 human interleukin-2 mang ý nghĩa đột biến alanine vị trí Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ amino acid số 1, thay Cysteine vị trí 125 Serine Hiện công ty Chiron bán IL-2 tái tổ hợp với giá 680 USD/mg Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp nói riêng sản phẩm protein tái tổ hợp sử dụng điều trị nói chung cịn bị bỏ ngỏ Mặc dù việc nghiên cứu DNA tái tổ hợp đƣợc phát triển từ 10 năm trở lại song chƣa có sản phẩm tái tổ hợp đƣợc triển khai áp dụng hồn tồn q trình nghiên cứu đến q trình sản xuất Ngồi sản phẩm Proleukin hết hạn bảo hộ độc quyền, hội để chúng tơi nghiên cứu tạo đƣợc sản phẩm Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp Việt Nam, dùng điều trị ung thƣ với hi vọng sản phẩm đạt chất lƣợng tốt giá thành rẻ so với sản phẩm nhập Chính nghiên cứu thực đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện, tối ƣu lên men tinh chế IL-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến E coli” nhằm tạo đƣợc sản phẩm Interleukin-2 có trình tự amino acid giống với sản phẩm Proleukin đƣợc FDA Hoa Kỳ cơng nhận, có khả chữa ung thƣ Mục tiêu đề tài nâng cao suất tổng hợp nhƣ tinh IL-2 dạng cải biến với chi phí thấp để đƣa sản phẩm IL-2 ngƣời tái tổ hợp tiêu thụ thị Nghiên cứu đƣợc thực nhờ hỗ trợ kinh phí Dự án: “Hồn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp dòng tế bào E coli” Mã số KC.04.DA02/11-15, đƣợc ứng dụng kết thu đƣợc từ nghiên cứu triển khai đề tài: (1) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nƣớc: “Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.33) Viện Cơng nghệ sinh học chủ trì, giai đoạn 2005-2007 (2) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nƣớc: “Nghiên cứu đánh giá hiệu lực Interleukin-2 tái tổ hợp sản xuất Việt Nam dùng hỗ trợ điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.21/06-10) Viện Công nghệ sinh học chủ trì, giai đoạn 2009-2010 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan ung thƣ 1.1.1 Ung thư Ung thƣ từ lúc bắt đầu hình thành đến lúc xuất trải qua nhiều bƣớc, nhiều chu trình trao đổi chất hoạt động bất thƣờng Các khối u ác tính hay cịn gọi ung thƣ đƣợc biểu thị đặc tính: phát triển khơng ngừng, khơng theo mục đích, khơng theo mong muốn, khơng kiểm sốt phá hoại, ức chế q trình sinh trƣởng tế bào thƣờng17[17] Tất sinh vật đƣợc tạo từ tế bào sống, tế bào cần phải đƣợc phân chia tăng sinh số lƣợng thời kỳ sinh trƣởng phát triển nhƣ để thay tế bào chết bị phá hủy Q trình ngƣời ta gọi chu trình tế bào (hay cịn gọi phân chia tế bào sinh trƣởng tế bào) Quá trình thƣờng đƣợc điểu khiển gene nằm DNA nhân tế bào Những gene đƣợc di truyền từ bố mẹ tế bào đƣợc thừa hƣởng đặc tính riêng biệt bao gồm kích thƣớc, màu sắc, trọng lƣợng kiểu hình Khi trạng thái bình thƣờng q trình phát triển tế bào mơ đƣợc kiểm soát cân Dạng ung thƣ đƣợc tạo thành kiểm soát di truyền bị bị phá hủy nhiều tế bào, từ tế bào dạng ung thƣ tiếp tục phân chia nhiều lần phát triển Lƣợng lớn tế bào phân chia khơng theo chu trình gây hại đến tế bào mơ bình thƣờng thể, kiểm soát dừng phân chia, ung thƣ Ngun nhân gây ung thƣ mà biết đến bao gồm nguyên nhân trực tiếp gián tiếp ảnh hƣởng đến gene điểu khiển trình phân chia tế bào37[37] Những tế bào bình thƣờng có chế giúp dừng q trình phân chia Tế bào mơ nhƣ mơ da, máu dịng tế bào miệng, cổ họng hay dày có thời gian sống ngắn nên việc phân chia xảy thƣờng xuyên luôn phải đƣợc thay Tƣơng tự nhƣ vậy, sau bị chấn thƣơng, hay bệnh tật có số tế bào bị chết, tế bào xung quanh chỗ bị Số hóa Trung tâm Học lieäu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ kết trên, IL-2 đƣợc biểu tốt giá trị nhƣ sau: nhiệt độ sau cảm ứng 42°C, nồng độ IPTG 1,5 mM, thời gian thu mẫu: Nhiệt độ °C 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Nồng độ chất cảm ứng IPTG 3147 1310 30°C 1218 37°C 1400 1200 1000 800 600 400 200 42°C 986 1066 1106 1086 1231 ng/mL Thời gian thu mẫu (giờ-h) 3000 2488 2764 2500 2000 2026 1617 1218 1500 1000 500 1h 0,1 mM 0,5 mM mM 1,2 mM 1,5 mM 2h 3h 4h Hình 3.4: Sơ đồ biểu thị kết khảo sát ảnh hƣởng nhân tố riêng rẽ (nhiệt độ biểu hiện, thời gian biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng IPTG) dòng tế bào tái tổ hợp E coli Bl21 mang vector biểu pET22b-IL-2 b Tối ƣu phần mềm Để sử dụng phần mềm Design expert cho việc tối ƣu nuôi cấy sản xuất lƣợng lớn IL-2, phải xác định yếu ảnh hƣởng đến tạo thành IL-2 Các yếu tố phải đƣợc xác định điểm trung tâm (0) (thƣờng điểm cho hàm lƣợng cao nhất), điểm dƣới (-1) điểm (+1) đƣợc chọn cho điểm (0) nằm yếu tố có giá trị thấp điểm (-1) cao điểm (+1) khơng cịn ảnh hƣởng tới tạo thành IL-2 Chính yếu tố xác định điểm nhƣ sau: Yếu tố Điểm trung tâm (0) Phạm vi nghiên cứu (-1;+1) Nhiệt độ (°C) 42 34-50 Nồng độ IPTG (mM) 0,5-1,5 Thời gian biểu (giờ) 1-5 41 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 5h Nhập giá trị xác định vào phần mềm nhƣ phần phƣơng pháp 2.2.5 (trang 28) Phần mềm thiết kế 20 thí nghiệm cần thực nghiệm, sau nhập kết vào phần mềm (phần respone) nhƣ Hình 5: Hình 5: Chi tiết thiết kế hàm lƣợng IL-2 sau thực 20 thí nghiệm Để đánh giá tƣơng quan kết xác định hàm lƣợng ELISA tiến hành điện di SDS-PAGE nhuộm comassie để kiểm tra protein 20 thí nghiệm đối chứng âm (khơng cảm ứng IPTG đƣợc gọi thí nghiệm số 21) Kết thu đƣợc nhƣ sau: 42 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ng/mL ng/mL 5000 5000 4000 4000 4000 3000 3000 3000 2000 2000 2000 1000 1000 1000 ng/mL 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 IL-2 Hình 6: Kết tiến hành 20 thí nghiệm đánh giá phƣơng pháp ELISA điện di SDS– PAGE Nhìn Hình thấy mẫu số 21 (đối chứng âm, không cảm ứng IPTG) không xuất băng IL-2 có kích thƣớc khoảng 15 kDa, kết tƣơng ứng với hàm lƣợng IL-2 thấp dƣới 1000 ng/mL Tƣơng tự thí nghiệm số 1,3,8, 11,12,13 có hàm lƣợng IL-2 thấp (thấp 1000 ng/mL) vị trí 15 kDa băng nhỏ khơng rõ nét Trong thí nghiệm cịn lại có hàm lƣợng IL-2 cao 1000 ng/mL nhìn thấy băng đậm vị trí 15 kDa trùng với vị trí IL-2 chuẩn (Trung Quốc) Sau tính tốn phân tích kết quả, phần mềm đƣa số kết nhƣ sau: Phƣơng trình hồi quy tuyến tính để tính tốn hàm lƣợng IL-2: Y=3234.26+224.94*A+482.81*B+174.80*C-6.20*A*B+54.65*A*C+140.10* B*C - 655.89 *A2 -886.59 *B2 +205.86 *C2 (Trong Y hàm lƣợng IL-2 (ng/mL); A,B,C lần lƣợt thời gian cảm ứng (giờ ), nhiệt độ cảm ứng (°C) nồng độ chất cảm ứng (mM) 43 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Hình 7: Mặt đáp ứng hàm lƣợng IL-2 Hệ số xác định R2 tính đƣợc 0,79 chứng tỏ có 79% số liệu thực nghiệm phù hợp với số liệu tiên đốn mơ hình Giá trị R2 phải lớn 0,75 mơ hình có ý nghĩa Giá trị âm hệ số R2 dự đoán 0,3167 chứng tỏ điểm tối ƣu cho hàm lƣợng IL-2 cao 20 thí nghiệm tiến hành, phù hợp với R2 hiệu chỉnh 0,5871 Giá trị tín hiệu gây nhiễu 7,551; lớn chứng tỏ thí nghiệm đầy đủ Phần mềm sau phân tích kết chọn điểm tối ƣu Vì IPTG hóa chất đắt tiền nên để giảm thiểu giá thành sản phẩm đƣa giải pháp:  Giải pháp thứ tìm điểm mà hàm lƣợng IL-2 đạt đƣợc cao  Giải pháp thứ hai tìm điểm mà hàm lƣợng IL-2 cao khoảng IPTG từ 0,5 đến mM  Cùng với chúng tơi chọn điều kiện điểm trung tâm (Nhiệt độ 42°C, thời gian thu mẫu giờ, nồng độ IPTG 1mM) để lên men làm đối chứng 44 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Bảng 1: Điều kiện biểu giải pháp mà phần mềm đƣa nhằm tìm điều kiện tối ƣu cho lên men Ký Nhiệt Nồng độ Thời gian Hàm lƣợng IL-2 hiệu độ(°C) IPTG(mM) thu (ng/mL) mẫu(giờ) Giải pháp S1 44,8 1,5 3,4 6273,0 Giải pháp S2 43,0 1,0 3,1 5908,1 Đối chứng C 42 4019,4 Tiến hành làm thêm thí nghiệm xác định giải pháp đƣa phần mềm, biểu điều kiện nhƣ Bảng 1, kết đƣợc xác định phƣơng pháp điện di SDS-PAGE, Western blot đo hàm lƣợng IL-2 phƣơng pháp ELISA ng/mL 7000 6273 6000 5000 4000 3000 2000 1000 S1 5908 4019 IL-2 S2 IL-2 C (A) (B) Hình 8: Kết biểu dự đoán mà phầm mềm đƣa A) Hàm lƣợng IL-2 biểu giải pháp; B) Kết kiểm tra IL-2 phƣơng pháp SDS-PAGE Western blot giải pháp Kết Hình cho thấy giải pháp giải pháp mà phần mềm đƣa protein IL-2 đƣợc biểu tốt cao so với đối chứng C lần lƣợt 56% 46% Nhƣ muốn sản lƣợng IL-2 thu đƣợc cao chủng vi khuẩn tái tổ hợp phải đƣợc lên men theo quy trình phần phƣơng pháp 2.2.3 trang 45 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 27, với yếu tố thay đổi nhƣ sau: nhiệt độ bắt đầu cảm ứng 44,8°C; nồng độ IPTG 1,5 mM thời gian thu mẫu 24 phút (3,4 giờ) Vì hàm lƣợng IL-2 giải pháp 6,1 % so với giải pháp 2, mà lƣợng IPTG cần dùng giải pháp gấp 50% so với giải pháp hai.Chính để giúp giảm chi phí sản xuất chúng tơi chọn giải pháp với điều kiện nhiệt độ lên men 43°C, nồng độ IPTG mM, thời gian thu mẫu phút 3.4 Tinh IL-2 từ dòng tế bào E coli Dịch tế bào sau lên men đƣợc thu lại cách ly tâm đƣa OD 100 đệm Tris HCl 0,1M để chuẩn bị cho bƣớc tinh chế Quy trình tinh chế IL-2 đƣợc tóm tắt nhƣ sơ đồ sau: Phá tế bào vi khuẩn E coli Tinh chế hệ thống HPLC Xử lý protein thô Bảo quản mẫu IL-2 ngƣời tái tổ hợp biểu vi khuẩn thƣờng tồn dạng không tan (Inclusion body) trƣớc đƣa mẫu lên hệ thống HPLC tiến hành tinh chế, IL-2 thô sinh khối tế bào E coli phải đƣợc trải qua hai trình: Quá trình phá tế bào trình xử lý biến tính IL-2 tái tổ hợp dạng thơ Qua q trình tối ƣu phá tế bào, tế bào đƣợc phá với lần siêu âm, đồng thời xử lý protein tổng số dung dịch chứa đƣờng sucrose Quá trình làm tan IL-2 dạng inclusion body nhờ hóa chất Guanidine 7M đƣa IL-2 trở dạng không tan cách hạ thấp nồng độ Gnd xuống 4M Cả hai trình nhằm loại bỏ tối đa tạp chất khơng mong muốn khác có dung dịch chứa mẫu IL-2 thô, đồng thời thu đƣợc lƣợng IL-2 nhiều 46 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ IL-2 Hình 9: Kết tiền xử lý tinh chế phá tế bào thu dịch thô IL-2 Đƣờng chạy M: thang protein chuẩn (Fermentas) Đƣờng chạy (+): IL-2 chuẩn Trung Quốc Đƣờng chạy 1: IL-2 sau tiền tinh chế phá tế bào thu dịch thô Đƣờng chạy 2: Protein tổng số tế bào sản xuất IL-2 trƣớc tiền tinh chế Kết Hình cho thấy đƣơng chạy IL-2 sau tiền tinh chế dịch IL-2 thơ sạch, băng vị trí 15 kDa nhiều so với đƣờng chạy số dịch protein tổng số trƣớc tiền tinh chế Nhƣ dịch IL-2 thô sau tiền tinh chế đƣợc xử lý đƣa lên cột tinh chế HPLC Dịch IL-2 thô sau tiền tinh chế đƣợc đƣa lên cột tiến hành tinh chế nhƣ quy trình 2.2.9 trang 33 luận văn Kết trình tinh chế đƣợc thể sắc ký đồ HPLC Hình 10) 47 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ B A IL-2 Hình 10: Kết tinh chế IL-2 hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC A) Sắc ký đồ tinh chế IL-2 B) Kết kiểm tra IL-2 sau tiền tinh chế phá tế bào thu dịch thô (đƣờng chạy 1) IL-2 sau tinh chế (đƣờng chạy 2) Kết hình Hình 10 cho thấy sắc ký đồ xuất đỉnh hẹp, nhọn cao đƣợc lấy đem điện di kiểm tra phƣơng pháp nhuộm bạc xác định đƣợc IL-2 Nhìn Hình 10B nhận IL-2 tồn trạng thái băng nhất, đƣờng chạy dịch IL-2 sau tiền tinh chế nhiều băng vị trí khác nhau, chứng tỏ IL-2 phân đoạn đƣợc tinh sạch, không xuất băng protein tạp khác Phân đoạn sau đƣợc đem xác định độ tinh phần mềm chuyên dụng 3.5 Xác định độ mẫu IL-2 sau tinh chế phần mềm Quantity One Sau tinh IL-2 hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao HPLC, tiến hành kiểm tra độ sản phẩm phần mềm chuyên dụng Quantity One Bio-rad Để kiểm chứng cho phƣơng pháp sử dụng mẫu IL-2 thô sau tinh chế IL-2 Trung Quốc làm đối chứng dƣơng Kết Hình 11 cho thấy mẫu IL-2 Trung Quốc (TQ), sản phẩm đƣợc kiểm tra chất lƣợng độ tinh khiết đạt 95% Sản phẩm IL- 48 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ TQ tồn băng kích thƣớc 15 kDa băng cao khoảng 30 kDa, dạng IL-2 kép dimer (kiểm tra western blot kháng thể đặc hiệu IL-2 phát đƣợc băng này) Do băng protein 30 kDa sản phẩm IL-2 không ảnh hƣởng đến độ tinh khiết sản phẩm Từ Bảng độ thang protein chuẩn (fermentas) 99%, mẫu IL-2 TQ cho tỷ lệ IL-2 đạt 95%, mẫu IL-2 sau tinh chế chúng tơi đạt đến 98% Đây giá trị độ tinh khiết dịch protein IL-2 sau tinh chế Với kết này, sản phẩm IL-2 tinh chế thu đƣợc tiếp tục xây dựng cơng thức bán thành phẩm thử hoạt tính dòng tế bào đặc hiệu CTLL2 để xác định hoạt tính sinh học mong muốn Maker IL-2 TQ Mẫu sau tinh chế Hình 11: Xác định thành phần độ tinh khiết protein Bảng 2: Thông số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết sản phẩm phần mềm Quantity One (tính theo % độ tinh khiết băng protein) STT băng Maker Trung Quốc Mẫu 13.37838 94.14868 98.021 19.20191 2.351318 16.52623 17.1558 11.64706 21.09062 13.37838 Tổng số 99 96.5 49 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã biểu thành công gene il2 cải biến so với trình tự il2 đề tài pha trƣớc (mất alanine đầu N, thay Cystein Serine vị trí 125) Trình tự amino acid dịch mã từ trình tự gene il2 cải biến giống với trình tự interleukin thƣơng phẩm giới đƣợc FDA công nhận Proleukin (Aldesleukin) hãng Chiron-Mỹ Tối ƣu đƣợc điều kiện lên men quy mơ bình tam giác nhiệt độ biểu 43°C, nồng độ IPTG cảm ứng 1mM, thời gian thu mẫu phút Sau tối ƣu, hàm lƣợng IL-2 thu đƣợc cao biểu ban đầu 46% Tiền xử lý tinh chế IL-2 hệ thống sắc ký HPLC thu đƣợc IL-2 có độ tới 98% (sạch so với mẫu đối chứng IL-2 Trung Quốc- đạt 96,5%) KIẾN NGHỊ Từ kết đạt đƣợc xin đƣa số kiến nghị nhƣ sau: Nghiên cứu nâng quy mô sản xuất IL-2 lên quy mô công nghiệp, tối ƣu lên men quy mô công nghiệp nhằm thu đƣợc lƣợng IL-2 lớn để sản xuất Xác định hoạt tính sinh học IL-2 tế bào CTLL2 Sản xuất thử nghiệm loạt IL-2 tái tổ hợp dòng tế bào E coli đạt tiêu chuẩn sản phẩm dạng tiêm Kiểm định tiêu an toàn chất lƣợng IL-2 thành phẩm 50 Số hóa Trung tâm Học lieäu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Chấn Hùng N Hiểu biết bệnh ung thƣ Y học TP Hồ Chí Minh 2005;9(1):115–122 Bùi Hồng Q, Nguyễn Đức L Tối ƣu hóa sinh tổng hợp LIPASE từ PICHIA ANOMALA VTCC Y0787 sử dụng ma trận PLACKETT-BURMAN phƣơng pháp đáp ứng bề mặt - phƣơng án cấu trúc có tâm 2009 Available at: http://elib.hou.edu.vn/handle/123456789/2758 Tiếng Anh Amron DM, Moy RL Stratospheric ozone depletion and its relationship to skin cancer J Dermatol Surg Oncol 1991;17(4):370–372 Baba AI, Câtoi C Comparative Oncology Bucharest: The Publishing House of the Romanian Academy; 2007 Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9557/ Bhagwat AS, Sohail A, Roberts RJ Cloning and characterization of the dcm locus of Escherichia coli K-12 J Bacteriol 1986;166(3):751–755 Biles WE, Swain JJ Optimization and industrial experimentation New York: Wiley; 1980 Box GEP, Draper NR Empirical model-building and response surfaces New York: Wiley; 1987 Boyle P, Levin B, Cancer IA for R on World cancer report 2008 IARC Press; 2008 Boyman O, Sprent J The role of interleukin-2 during homeostasis and activation of the immune system Nat Rev Immunol 2012;12(3):180–190 10 Cooper GM Oncogenes http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9840/ 2000 Available at: 11 Deepak V, Kalishwaralal K, Ramkumarpandian S, et al Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology Bioresour Technol 2008;99(17):8170–8174 12 DrugBank ed Aldesleukin (DB00041) DrugBank 2012 Available at: http://www.drugbank.ca/drugs/DB00041 51 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 13 Francis DM, Page R Strategies to optimize protein expression in E coli Curr Protoc Protein Sci 2010;Chapter 5:Unit 5.24.1–29 14 Grimm EA Cytokines: Biology and Applications in Cancer Medicine 2000 Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20931/ 15 Grodberg J, Dunn JJ ompT encodes the Escherichia coli outer membrane protease that cleaves T7 RNA polymerase during purification J Bacteriol 1988;170(3):1245–1253 16 Haacke A, Fendrich G, Ramage P, Geiser M Chaperone over-expression in Escherichia coli: apparent increased yields of soluble recombinant protein kinases are due mainly to soluble aggregates Protein Expr Purif 2009;64(2):185–193 17 Hanahan D, Weinberg RA The hallmarks of cancer Cell 2000;100(1):57–70 18 Hora MCCC Preparing aldesleukin for pharmaceutical use 2006 19 Kammula US, White DE, Rosenberg SA Trends in the safety of high dose bolus interleukin-2 administration in patients with metastatic cancer Cancer 1998;83(4):797–805 20 Lee DS, White DE, Hurst R, Rosenberg SA, Yang JC Patterns of relapse and response to retreatment in patients with metastatic melanoma or renal cell carcinoma who responded to interleukin-2-based immunotherapy Cancer J Sci Am 1998;4(2):86–93 21 Liang SM, Thatcher DR, Liang CM, Allet B Studies of structure-activity relationships of human interleukin-2 J Biol Chem 1986;261(1):334–337 22 Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al Proto-Oncogenes and Tumor-Suppressor Genes 2000 Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21662/ 23 MacWilliams MP, Bickle TA Generation of new DNA binding specificity by truncation of the type IC EcoDXXI hsdS gene EMBO J 1996;15(17):4775–4783 24 Mauro FR, Gentile M, Foa R Erythropoietin and chronic lymphocytic leukemia Rev Clin Exp Hematol 2002;Suppl 1:21–31 25 Moan J, Dahlback A The relationship between skin cancers, solar radiation and ozone depletion Br J Cancer 1992;65(6):916–921 26 Moffatt BA, Dunn JJ, Studier FW Nucleotide sequence of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase J Mol Biol 1984;173(2):265–269 52 Soá hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 27 Ngoan LT, Lua NT, Hang LTM Cancer mortality pattern in Viet Nam Asian Pac J Cancer Prev 2007;8(4):535–538 28 Oudard S, George D, Medioni J, Motzer R Treatment options in renal cell carcinoma: past, present and future Ann Oncol 2007;18(suppl 10):x25–x31 Available at: [Accessed October 26, 2013] 30 Regnier FE High-performance liquid chromatography of biopolymers Science 1983;222(4621):245–252 31 Rishabha Malviya VB HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY: A SHORT REVIEW Journal of Global Pharma Technology 2010;2(5):22–26 32 Safar M, Junghans RP Interleukin maintains biologic stability and sterility over prolonged time Immunopharmacology 2000;49(3):419–423 33 Schnaitman CA, Austin EA Efficient incorporation of galactose into lipopolysaccharide by Escherichia coli K-12 strains with polar galE mutations J Bacteriol 1990;172(9):5511–5513 34 Schwartzentruber DJ Guidelines for the safe administration of high-dose interleukin-2 J Immunother 2001;24(4):287–293 35 Schwertschlag US, Trepicchio WL, Dykstra KH, et al Hematopoietic, immunomodulatory and epithelial effects of interleukin-11 Leukemia 1999;13(9):1307–1315 36 Sim M, Seok H-S, Kim J A Next-generation Sequence Clustering Method for E Coli through Proteomics-genomics Data Mapping Procedia Computer Science 2013;23:96–101 37 Stephens FO, Aigner K Basics of Oncology Springer; 2009 38 Thomson AW, Lotze MT The Cytokine Handbook, Two-Volume Set Gulf Professional Publishing; 2003 39 Titov KS, Kiselevskii MV, Demidov LV, et al Use of recombinant interleukin2 for intrapleural therapy of tumor-associated pleurisy Bull Exp Biol Med 2009;148(5):794–796 40 UK CR Cancer Worldwide - the global picture 2013 Available at: http://www.cancerresearchuk.org/cancer-info/cancerstats/world/the-global-picture/ 41 Vydac The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-phase HPLC Vydac; 1995 53 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 42 Weinberg RA How cancer arises Sci Am 1996;275(3):62–70 43 Yin J, Li G, Ren X, Herrler G Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes J Biotechnol 2007;127(3):335–347 44 Zhang C, Wang B, Wang M GM-CSF and IL-2 as adjuvant enhance the immune effect of protein vaccine against foot-and-mouth disease Virol J 2011;8:7 Internet 45 http://www.who.int/en/ 46 http://www.cancer.org 47 http://www.uspto.gov/ 48 http://www.fda.gov/ 54 Số hóa Trung tâm Học liệu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Lê Phuơng Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Nguyễn Hồng Thanh, Phùng Thu Nguyệt, Trƣơng Nam Hải (2013) Nghiên cứu loại bỏ nội độc tố khỏi sản phẩm interleukin-2 nguời tái tổ hợp phương pháp siêu lọc sắc ký đảo pha (RP-HPLC) Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 1, 268 – 272 Lê Thị Lan Anh, Lê Phuơng Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Lê Thị Thu Hồng, Phùng Thu Nguyệt, Đoàn Thị Thủy, Lƣu Anh Chiến, Trƣơng Nam Hải (2013) Nghiên cứu tối ưu biểu gen mã hóa interleukin-2 nguời Escherichia coli Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 1, 19 – 23 Lê Thi Lan Anh, Lê Phƣơng Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Lê Thị Thu Hằng, Phùng Thu Nguyệt, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Hằng, Trƣơng Nam Hải (2013) Biểu gen mã hóa IL-2 người với chaperon groesl thioredoxin tế bào Escherichia coli BL21 (DE3) Tạp chí Khoa học Phát triển, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội 11(6), 777-783 55 Số hóa Trung tâm Học lieäu ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ... quyền 3 .2 Biểu gene il2 chủng vi khuẩn tái tổ hợp E coli BL21 Sau biến nạp vào tế bào biểu E coli BL21 (DE3) số dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp pET 22- IL -2 đƣợc biểu để kiểm tra khả tổng hợp protein... .25 2. 2 Phƣơng pháp 25 2. 2.1 Tách chiết DNA plasmid từ E coli .26 2. 2 .2 Điện di DNA gel agarose 27 2. 2.3 Lên men tạo sản phẩm IL -2 với dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp. .. Agarose…………………………………………………………………………… 37 Hình 2: Kết kiểm tra khả biểu IL -2 số dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang plasmid pET 22- IL -2 39 Hình 3: Sơ đồ tối ƣu lên men vi khuẩn tái E coli tái tổ hợp sản xuất IL -2 .40 Hình

Ngày đăng: 25/03/2021, 11:08

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w