Nghiên cứu biểu hiện gen p24 của HIV và kiểm tra phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân

Hiện nay, bệnh dịch AIDS là một trong những mối nguy hiểm lớn nhất của thế giới. Ước tính đã có khoảng 20 triệu người chết vì AIDS, và hiện đang có 39 triệu người trên thế giới đang mang HIV và hàng triệu ca nhiễm mới mỗi ngày (theo UNAIDS, 2007). Bệnh dịch làm tăng nhanh sự nghèo đói và hủy hoại tương lai của những người mắc bệnh do đó là mối đe dọa lớn đến tình hình kinh tế, xã hội và chính trị đối với rất nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam 1. Trong những năm gần đây, tình hình lây nhiễm HIVAIDS ở Việt Nam diễn biết rất phức tạp, số người phát hiện nhiễm tiếp tục tăng. Hầu hết những người nhiễm HIV là do tiêm chính ma tuý và đang ở độ tuổi thanh thiếu niên. Tính đến ngày 1672007, cả nước đã phát hiện được 129.110 người nhiễm HIV; trong đó 25.470 người chuyển sang AIDS, 14.195 người đã tử vong do HIVAIDS. Theo các chuyên gia y tế, số người được phát hiện nhiễm HIVAIDS là thấp hơn nhiều so với thực tế. Theo dự đoán, đến năm 2010 Việt Nam sẽ có khoảng 350.970 trường hợp nhiễm HIV, 112.227 trường hợp chuyển sang giai đoạn AIDS, 101.701 trường hợp tử vong vì HIVAIDS; trung bình mỗi năm sẽ có khoảng 2030 ngàn trường hợp nhiễm mới. Đây sẽ là thách thức lớn đối với công tác phòng, chống HIVAIDS ở nước ta 2,3,5. Hiện chưa có biện pháp nào có thể tiêu diệt hoàn toàn được HIV. Các loại vắcxin phòng chống HIV chưa thực sự có hiệu lực cộng với sự kháng các loại thuốc kháng virut và những hoạt động tiêm chích, mại dâm làm cho sự lây lan dịch bệnh này càng ngày càng nhanh chóng và trở nên khó kiểm soát Phương pháp hay được sử dụng để điều trị HIVAIDS hiện nay là phương pháp HAART (highly active antiretroviral therapy) có tác dụng kéo dài tuổi thọ của những người nhiễm HIV. Tuy nhiên, để sử dụng các phác đồ trị liệu một cách có hiệu quả nhất thì việc chẩn đoán sớm và chính xác là một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu. Các phương pháp chẩn đoán HIV rất đa dạng, nhưng việc tạo ra các kít chẩn đoán HIV sớm, nhanh và có độ nhạy cao vẫn thu hút được nhiều mối quan tâm của các nhà nghiên cứu. Một trong các phương pháp chẩn đoán sớm và có độ chính xác cao là dựa vào việc phát hiện kháng nguyên lõi P24 của HIV và sự có mặt của kháng thể kháng kháng nguyên này trong huyết thanh bệnh nhân. Trên thị trường Việt Nam đã xuất hiện nhiều loại kit chẩn đoán HIV sớm nhập ngoại dựa vào kháng nguyên P24 và kháng thể của nó. Tuy nhiên, những khó khăn trong việc bảo quản cộng với giá thành cao của các loại kit này làm hạn chế việc phổ biến hóa việc xét nghiệm đối với các đối tượng có nguy cơ lây nhiễm cao. Trước tình hình đó, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: ‘Nghiên cứu biểu hiện gen p24 của HIV và kiểm tra phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân” với mục đích:  Tách dòng và đọc trình tự gen p24 của HIV  Bước đầu nghiên cứu sự biểu hiện gen p24 trong E. coli  Kiểm tra phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV tự nhiên trong huyết thanh bệnh nhân HIV Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học phân tử Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Đinh Duy Kháng.

Luận văn cao học Hoàng Anh MỞ ĐẦU Hiện nay, bệnh dịch AIDS mối nguy hiểm lớn giới Ước tính có khoảng 20 triệu người chết AIDS, có 39 triệu người giới mang HIV hàng triệu ca nhiễm ngày (theo UNAIDS, 2007) Bệnh dịch làm tăng nhanh nghèo đói hủy hoại tương lai người mắc bệnh mối đe dọa lớn đến tình hình kinh tế, xã hội trị nhiều quốc gia giới, có Việt Nam [1] Trong năm gần đây, tình hình lây nhiễm HIV/AIDS Việt Nam diễn biết phức tạp, số người phát nhiễm tiếp tục tăng Hầu hết người nhiễm HIV tiêm ma tuý độ tuổi thiếu niên Tính đến ngày 16/7/2007, nước phát 129.110 người nhiễm HIV; 25.470 người chuyển sang AIDS, 14.195 người tử vong HIV/AIDS Theo chuyên gia y tế, số người phát nhiễm HIV/AIDS thấp nhiều so với thực tế Theo dự đoán, đến năm 2010 Việt Nam có khoảng 350.970 trường hợp nhiễm HIV, 112.227 trường hợp chuyển sang giai đoạn AIDS, 101.701 trường hợp tử vong HIV/AIDS; trung bình năm có khoảng 20-30 ngàn trường hợp nhiễm Đây thách thức lớn công tác phòng, chống HIV/AIDS nước ta [2,3,5] Hiện chưa có biện pháp tiêu diệt hoàn toàn HIV Các loại vắcxin phòng chống HIV chưa thực có hiệu lực cộng với kháng loại thuốc kháng virut hoạt động tiêm chích, mại dâm làm cho lây lan dịch bệnh ngày nhanh chóng trở nên khó kiểm soát Phương pháp hay sử dụng để điều trị HIV/AIDS phương pháp HAART (highly active antiretroviral therapy) có tác dụng kéo dài tuổi thọ người nhiễm HIV Tuy nhiên, để sử dụng phác đồ trị liệu cách có hiệu việc chẩn đoán sớm xác yếu tố quan trọng hàng đầu Các phương pháp chẩn đoán HIV đa dạng, việc tạo kít chẩn đoán HIV sớm, nhanh có độ nhạy cao thu hút nhiều mối quan tâm nhà nghiên cứu Một phương pháp chẩn đoán sớm có độ xác cao dựa vào việc phát kháng nguyên lõi P24 HIV có mặt kháng thể kháng kháng nguyên huyết bệnh nhân Trên thị trường Luận văn cao học Hoàng Anh Việt Nam xuất nhiều loại kit chẩn đoán HIV sớm nhập ngoại dựa vào kháng nguyên P24 kháng thể Tuy nhiên, khó khăn việc bảo quản cộng với giá thành cao loại kit làm hạn chế việc phổ biến hóa việc xét nghiệm đối tượng có nguy lây nhiễm cao Trước tình hình đó, thực đề tài nghiên cứu: ‘Nghiên cứu biểu gen p24 HIV kiểm tra phản ứng protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân” với mục đích:  Tách dòng đọc trình tự gen p24 HIV  Bước đầu nghiên cứu biểu gen p24 E coli  Kiểm tra phản ứng protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV tự nhiên huyết bệnh nhân HIV Đề tài thực phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, hướng dẫn khoa học PGS.TS Đinh Duy Kháng Luận văn cao học Hoàng Anh Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HIV 1.1.1 Khái niệm HIV Virut gây suy giảm miễn dịch người, viết tắt theo tiếng Anh HIV (Human Immunodeficiency Virus) loại virut xâm nhập vào thể gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS), trạng thái mà đó, hệ thống miễn dịch người bị suy yếu, dẫn đến nguy nhiễm bệnh hội làm cho bệnh nhân dễ mắc bệnh ung thư phải chịu tổn thương HIV gây Sự nhiễm HIV thông qua việc chuyển chất dịch máu, dịch âm đạo, tinh dịch sữa từ người bệnh Trong thể người bệnh, HIV tồn dạng hạt virut tự lẫn dạng virut bị nhiễm vào tế bào hệ thống miễn dịch [13, 14, 55] 1.1.2 Đặc điểm HIV 1.1.2.1 Đặc điểm phân loại HIV HIV thành viên chi Lentivirus thuộc họ Retroviridae [23,24] Retrovirus loại virut có genom ARN sợi đơn dương chu trình sống có giai đoạn tồn dạng ADN kép có enzym phiên mã ngược mà chất ADN polymeraza phụ thuộc ARN ADN tạo có đoạn trình tự lặp lại có kích thước khác đầu gọi đoạn lặp lại đầu cuối (LTR), nhờ đoạn mà ADN virut gắn ổn định nhiễm sắc thể tế bào nhiễm trở thành dạng tiền virut (provirus) [24] Các Lentivirrus có đặc điểm hình thái sinh học giống Chúng virut ARN sợi đơn dương có vỏ Rất nhiều động vật bị gây nhiễm lentivirus, Đặc tính có thời gian mắc bệnh ủ bệnh dài [23] HIV gồm loại HIV-1 HIV-2, loại bắt nguồn từ vùng phía Nam Camerun sau truyền từ tinh tinh sang người kỉ 20 Trước đây, HIV gọi human T-lymphotropic virus-III (HTLV-III) lymphadenopathy-associated virus (LAV), AIDS-associated retrovirus (ARV) Luận văn cao học Hoàng Anh HIV- phát năm 1983, gọi LAV HIV -1 có độc tính mạnh dễ dàng lan truyền cộng đồng, nguyên nhân đại địch HIV bùng phát khắp giới [18, 25] HIV-2 phát năm 1985, có độc lực yếu khả truyền nhiễm hơn, điều giải thích loại virut lưu hành Tây Phi Trong giới hạn luận văn này, tập trung nghiên cứu HIV-1 loại virut gây đại dịch giới loại chủ yếu thường gặp Việt Nam 1.1.2.2 Đặc điểm hình thái HIV Virut HIV có cấu trúc hình cầu, đường kính 80-120nm Hạt virion có dạng hình khối đa diện với cấu trúc đối xứng gồm 20 mặt tam giác [12, 20, 46] Hình 1: Hình thái hạt virion virut HIV 1.1.2.3 Đặc điểm cấu trúc HIV Từ vào có lớp [55, 57] Lớp vỏ: Lớp áo virut, gọi vỏ virut, bao gồm lớp, lấy từ màng tế bào người hạt virut nảy chồi từ tế bào Các nghiên cứu gần HIV vào khỏi tế bào thông qua vùng đặc biệt màng tế bào gọi thảm lipid (Lipid raft) Thảm có hàm lượng cholesterol glycolipid cao điểm đích việc nghiên cứu loại thuốc kháng virut HIV Luận văn cao học Hoàng Anh Bao quanh lớp vỏ virut khoảng 72 copy phức hệ protein gai HIV (thường gọi spickes) Phức hệ cấu tạo từ protein vỏ virut gọi protein Env, bao gồm mũ tạo thành từ phân tử glycoprotein có độ dài 9-10 nm chiều rộng 14 nm có trọng lượng phân tử 120 kDa gắn gốc gồm phân tử glycoprotein GP41 xuyên màng có lượng phân tử 41 kDa neo vào cấu trúc vỏ virut Rất nhiều nghiên cứu để phát triển vacxin HIV tập trung vào protein vỏ [21, 54, 55] Hình 2: Cấu trúc phân tử HIV Protein (matrix protein) Ngay sát lớp vỏ có lớp protein tạo thành từ phân tử protein P17 Bên cạnh việc làm ổn định cấu trúc lõi virut bên trong, nghiên cứu gần cho thấy protein có vai trò quan trọng tạo thành hạt virut [16] Lõi virut: Bên lớp vỏ HIV trưởng thành có lõi hình viên đạn gọi capsit, tạo thành 2000 copy protein P24 Lõi capsit bao quanh chuỗi ARN đơn dương có gắn enzym phiêm mã ngược Ngoài có enzym tích hợp integraza, enzym proteaza phân tử ARN thông tin 1.1.2.4 Cấu trúc gen HIV Luận văn cao học Hoàng Anh Hình 3: Sơ đồ cấu trúc gen HIV Vật chất di truyền HIV sợi ARN đơn dương, sợi có khoảng 9200 cặp bazơ mang copy gen, chia thành nhóm gen chính: nhóm gen cấu trúc nhóm gen điều hòa sinh trưởng [37, 39, 57] • Nhóm gen cấu trúc: chứa thông tin cần thiết để tạo nên protein cấu trúc cho hạt virut - Gag: gen mã hóa cho kháng nguyên đặc hiệu nhóm, gồm gen P17, P24, P7 P6 - Pol: mã hóa cho enzym ADN polymeraza phụ thuộc ARN hay gọi enzym phiên mã ngược enzym khác integraza proteaza - Env: mã hoá cho protein vỏ gp120 gp41 • Nhóm gen điều hòa: chứa thông tin cần thiết cho protein điều khiển xâm nhập HIV vào tế bào vật chủ, tạo virut gây bệnh - Tat (transactivator) gen khởi động hoạt động gen virut khác - Rev: (trans-regulator protein) có chức điểu hòa, tạo protein Rev có đầu, đầu làm nhiệm vụ ức chế (CRS), đầu làm nhiệm vụ giải ức chế (CAR) - Nef: (negative regulator factor) chịu trách nhiệm làm chậm chu trình sống virut trạng thái tiềm tan - Vif: (virion infectivity factor) mã hóa cho protein kích thích xâm nhập virut vào tế bào cảm nhiễm Luận văn cao học Hoàng Anh - Vpu: mã hóa cho protein điều khiển trình giải phóng hạt virut từ tế bào bị nhiễm - Vpr: cần thiết cho nhân lên virut tế bào không phân chia đại thực bào Cuối chuỗi ARN HIV có trật tự ARN gọi đoạn lặp lại dài cuối (LTR) Các vùng LTR hoạt động công tắc để khởi động trình tạo thành virut khởi động nhờ protein virut protein vật chủ Luận văn cao học Hoàng Anh 1.1.3 Gen p24 protein P24 1.1.3.1 Gen mã hóa cho protein p24 Gen mã hóa cho protein nucleocapsit có kích thước khoảng 660 bp, nằm vị trí trung tâm hệ thống gen cấu trúc gag Nó mã hóa cho protein có chiều dài 231 axit amin, có trọng lượng phân tử xấp xỉ 24 kDa, gọi tắt gen p24 protein tạo protein P24 [57] 1.1.3.2 Protein P24 vai trò chu trình sống HIV Khi tổng hợp, P24 nằm vùng trung tâm polyprotein Gag hay gọi P55 dài 55 kDa, Trong trình trưởng thành hạt virut mới, polyprotein P55 bị enzym proteaza virut cắt thành protein có kích thước khác P24, P17, P6 P7 (Hình 3) Hình Cấu trúc không gian phân tử protein p24 [9] Hình 5: Cấu trúc không gian đầu C – 146-231 protein p24 [17] Protein p24 có dạng dime bị photphoryl hóa Trong đơn phân tử có xoắn α, số xếp tạo thành cấu trúc dạng ống [9, 29] (hình 4) Xoắn dài lõi ống tách biệt đoạn peptit dài có tính kháng nguyên cao, vị trí liên kết phân đoạn kháng thể với tinh thể Capsit (CA) Vùng đầu C protein capsit nằm vị trí từ axit amin thứ 146 đến 231 gồm đoạn chứa 20 axit amin, gọi vùng tương đồng (MHR- major homology region) (Hình 5) Đây vùng bảo thủ retrovirut khác cần thiết cho đóng gói, trưởng thành gây nhiễm virut [17] Vùng đầu N p24 có cấu trúc kẹp tóc beta N-terminal beta-hairpin Sự săp xếp dime CA (146-231) với cấu trúc vùng đầu N hình Luận văn cao học Hoàng Anh thành cấu trúc không gian protein capsit tạo điều kiện liên kết kéo phía protein để tạo thành lõi hình viên đạn HIV-1 Vai trò protein P24 HIV muốn nhân lên tế bào chủ phải trải qua bước khác Protein nucleocapsit có vai trò quan trọng giai đoạn khác chu trình sống virut Trước tiên, P24 tham gia vào trình cởi áo sau virut xâm nhập vào tế bào Sau HIV xâm nhập vào tế bào chất tế bào chủ, protein lõi capsit tự động tách ra, làm tan rã cấu trúc lõi capsit, giải phóng ARN genom vào tế bào chất [13] Sau đó, P24 tham gia vào trình chép ngược virut chỗ có ảnh hưởng đến mối liên kết ARN ADN giai đoạn đầu trình nhiễm hoạt động cofactor cho enzym phiên mã ngược Protein P24 tham gia vào trình đóng gói ARN genom với thành phần khác virut Nó có vai trò đặc biệt viêc nhận dấu hiệu đóng gói HIV làm nhiệm vụ trung gian cho kết hợp phân tử ARN khác để hình thành genom hạt virion HIV-1 Dấu hiệu đóng gói bao gồm cấu trúc gồm phần loop định vị gần đầu 5  ARN genom virut NC liên kết với dấu hiệu đóng gói thông qua liên kết trung gian motif mang Zn Qua nghiên cứu, người ta thấy với domain liên kết với Zn chưa đủ để đóng gói ARN HIV mà phụ thuộc vào protein (matrix) [15] 1.1.4 Chu trình sống virut HIV Sự xâm nhập nhân lên virut HIV chia lam ba giai đoạn quan trọng: giai đoạn xâm nhiễm cởi áo, giai đoạn chép dịch mã, giai đoạn lắp ráp tạo thành virut hoàn chỉnh [6, 13,14, 53, 55, 56] 1.1.4.1 Sự xâm nhập cởi áo HIV Quá trình xâm nhiễm bắt đầu hạt HIV mang copy ARN HIV tiếp xúc với tế bào thông qua phân tử CD4 bề mặt tế bào chủ (cluster designation 4) Các tế bào mang phân tử gọi tế bào CD4+(CD4 posititve) Một nhiều phân tử gp120 liên kết lỏng lẻo với phân tử CD4 bề Luận văn cao học Hoàng Anh mặt tế bào Sự liên kết CD4 gp120 làm biến đổi cấu trúc gp120 cho phép liên kết với phân tử thứ bề mặt tế bào gọi đồng thụ thể (coreceptor) Gp41 vỏ tạo điều kiện cho trình dung nạp Vỏ virut màng tế bào sau dung nạp với nhau, đẩy virut vào bên tế bào Các thuốc điều trị HIV/AIDS làm cản trở trình liên kết trình dung nạp nghiên cứu kiểm tra để có tác dụng từ giai đoạn lâm sàng Hình 6: Chu trình nhân lên HIV Các nghiên cứu xác định nhiều đồng thụ thể khác cho chủng HIV khác Ở giai đoạn trình nhiễm, hầu hết HIV sử dụng thụ thể CD4 đồng thụ thể CCR5 để xâm nhập vào tế bào đích Khi bệnh phát triển, xấp xỉ 50% bệnh nhân mở rộng sử dụng đồng thụ thể, đáng kể thụ thể CXCR4 Virut sử dụng đồng thụ thể CCR5 gọi R5 HIV virut sử dụng đồng thụ thể CXCR4 gọi X4 HIV [45] Mặc dù tế bào TCD4+ đích HIV, tế bào khác hệ miễn dịch có CD4 bề mặt bị nhiễm Trong số này, tế bào có đời sống dài tế bào đơn nhân (monocyte) đại thực bào (Macrophage) mang lượng lớn HIV mà không bị tiêu diệt Vì vậy, coi chỗ trú ẩn an toàn HIV Các tế bào T CD4 + có chức chứa HIV, lượng nhỏ tế bào lưu giữ HIV dạng tiềm tan, không hoạt dộng 10 Luận văn cao học Hoàng Anh Quá trình xác định trình tự thực máy xác định trình tự tự động theo quy trình sau: Thành phần phản ứng Chu trình nhiệt : µl Big bye Bước : 960C / phút Bước : 960C / 10 giây Nồng độ mồi : 3,2 pmol (xuôi ngược) Buffer 2,5 X : µl Bước : 500C / giây DNA plasmid : µl Bước : 600C / phút H2O khử ion vô trùng : 4,725 µl Bước : Lặp lại từ bước 2, 25 chu kì Bước : 0C / vô Tổng thể tích : 15 µl Sau xác định trình tự, gen mã hoá protein P24 HIV phân tích phần mềm PC-GEN Kết phân tích trình tự gen phần mềm PC /Gene thể hình 14 ID HIVP24C PRELIMINARY; DNA; 609 BP SQ SEQUENCE 609 BP; 120 A; 141 C; 124 G; 224 T; GTAGCTGCTG GTCCCAATGC TTTTAAAATT GTCCCACAAT CTGGGTTCGC ATTTTGGACC AACAAGGTTT CTGTCATCCA ATTTTTTACC TCTTGTGAAG CTTGCTCGGC TCTCAGAGTT TTATAGAATC GGTCTACATA GTCTCTAAAG GGTTCCTTTG GTCCTTGTCT TATGTCCAGA ATGCTGGTAG GGCTATACAT TCTTACTATT TTATTTAATC CCAGGACTAT CCATCTTCTA TAGATTTCTC CTACTGGGAT AGGTGGATTA TGTGTCATCC ATCCTGTTTG TTCCTGAAGG GTACTAGTAG TTCCTGCTAT GTCACTTCCC CTTGGTTCTC TCATCTGGCC TGGTGCAATA GGCCCTGCAT GCACTGGATG CAATCTATCC CATTCTGCAG CTTCCTCATT GATGGTCTCT TTTAACATTT GCATGGCTGC TTGATGTCCC CCCACTGTGT TTAGCATGGT ATTTAGATCT TGTGGGGTGG CTCCTTCTGA TAATGCTGAA AACATGGGGT ATTACTTCTG GGCTGAAAGC CTTCTCTTCT ACTACTTTTA CCCATGCATT TAAAGTTCTA GGTGATATGG CTTGATGTAC CATTTGCCC Hình 14: Trình tự đoạn gen p24 HIV phân lập Việt Nam Sau giải trình tự gen mã hoá protein P24 HIV phân lập Việt Nam tiến hành so sánh với trình tự gen mã hoá protein P24 HIV Ngân hàng Dữ liệu gen Quốc tế chương trình Fasta 33 với độ tương đồng cao đạt 98,03% Kết trình bày bảng 48 Luận văn cao học Hoàng Anh Bảng 4: Kết so sánh trình tự đoạn gen p24 HIV phân lập Việt Nam giới TT Mã số ngân hàng gen EM_VI:REHIVNL4 EM_VI:AF070521 EM_VI:HIVNY5CG EM_VI:HI1U26942 EM_VI:AY835771 EM_VI:AY835772 EM_VI:DQ097744 EM_VI:AY835773 EM_VI:AY835770 10 EM_VI:AF075719 Nguồn 9709 98.030 % tương đồng 98.030 9699 98.030 98.030 9022 98.030 98.030 9000 97.865 97.865 9733 97.537 97.537 9724 97.373 97.373 3073 97.209 97.373 HIV-1 isolate 9754 5082-94 HIV-1 isolate 9730 5082-83 HIV-1 isolate MN 9493 clone 97.209 97.209 7.5e132 7.5e132 7.7e132 2.1e131 1.4e130 3.8e130 8.9e130 1e-129 97.209 97.209 1e-129 97.209 97.209 1e-129 Human immunodeficiency HIV-1 E9 from the USA, c Human immunodeficiency Human immunodeficiency HIV-1 isolate 5082-86 HIV-1 isolate 5082-97 HIV-1 clone P2-1 Đô dài %xác định 3.5 Khuyếch đại gen p24 cặp mồi biểu Gen mã hoá kháng nguyên lõi p24 (nucleocapsit gene) tạo dòng xác định trình tự sử dụng làm khuôn để khuếch đại kỹ thuật PCR với cặp mồi biểu p24Bam P24Xho P24- Bam 5- CGGATCCGGGCAAATGGTAACTCA AC -3 Tm:63,4oC Vị trí cắt BamHI P24- XhO – G CTCGAGAGCTGCTGGTCCCAATG CT – Tm: 65,9 oC Vị trí cắt XhoI Thành phần Thể tích phản ứng Thà nh phần phản ứng 49 Thể tích E() Luận văn cao học Hoàng Anh H2O 12 µl dNTP (2.5mM) 2,5 µl Buffer for Takara (10X) 2,5 µl ADN template µl P24-Bam P24- Xho (10pM) µl Taq Takara (1U) µl Quy trình phản ứng: 95 C phút 72 C phút 20 giây(30 chu kỳ 94 C phút 72 C phút 60 C 50 giây 0C Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% Hình 15: Sản phẩm PCR gen p24 cặp mồi biểu Đường chạy 1: Sản phẩm PCR gen p24 khuếch đại bầng cặp mồi biểu Đường chạy 3: ADN chuẩn (ADN λ cắt HindIII EcoR I) Sản phẩm PCR băng đặc hiệu có kích thước 600 bp, tương ứng với thích thước lý thuyết đoạn gen p24 Chúng sử dụng sản phẩm PCR cho nghên cứu 3.6 Thiết kế vectơ biểu pVFT2S- p24 50 Luận văn cao học Hoàng Anh 3.6.1 Thu nhận đoạn ADN gen p24 Sản phẩm PCR gen p24 gắn vào vector pCR2.1 enzym gắn ligaza Sau biến nạp vào tế bào khả biến E coli chủng DH5αT’ nuôi môi trường có bổ xung Ampicillin X- gal với nồng độ 1/1000 Chọn khuẩn lạc xanh 13 khuẩn lạc trắng để tách plasmid theo quy trình nêu Sản phẩm tách kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết trình bày hình 15 X 10 11 12 13 Hình 16: Kết tách chiết plasmid PC2.1 – p24 từ E.coli chủng DH5αT’ Đường chạy đến 13: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng Đường chạy X: ADN plasmid tách từ khuẩn lạc xanh Dựa vào kết trên, chọn dòng plasmid tái tổ hợp pCR 2.1p24 số 3, 4, 5, để tiến hành thí nghiệm Để biết chắn gen p24 có gắn vào hay không, tinh plasmid thu sử dụng enzym giới hạn BamH1 XhoI để cắt kiểm tra vectơ tái tổ hợp Kết trình bày hình 17 18 Hình 17: Kết tinh plasmid pCR 2.1-p24 Đường chạy đến 4: Các vector PC2.1 dòng 3,4, sau tinh X 51 M Luận văn cao học Hoàng Anh Hình 18: Kết cắt kiểm tra vector PC2.1 tái tổ hợp enzym BamHI XhoI Kênh 4: Vector pCR2.1 dòng cắt enzym BamHI Kênh 5: Vector pCR2.1 dòng cắt enzymXhoI Kênh 3, - 8: Vector pCR2.1 dòng cắt enzym BamH1 XhO1 Kênh M: Maker ADN chuẩn Kết cho thấy plasmid tái tổ hợp PC2.1 – p24 dòng 3, 4, bi cắt hỗn hợp enzym văng đoạn ADN có kích thước 600 bp Chúng tiến hành cắt lượng lớn plasmit dòng enzym BamHI XhoI, thu nhận đoạn ADN có kích thước 600bp với đầu lồi, vị trí cắt enzym BamHI vị trí cắt XhoI 3.6.2 Thiết kế vector biểu pVFT2S – p24 Đoạn gen p24 thu gắn vào vector pVFT2S xử lý BamHI XhoI Sản phẩm gắn biến nạp vào tế bào E coli chủng DH5αT’ nuôi môi trường LB có bổ xung kanamycin với nồng độ cuối 1/2000 16-24h 37oC Chúng tách plasmid 13 khuẩn lạc mọc môi trường LB có bổ xung kanamycin với nồng độ 1/2000 chạy kiểm tra với plasmid gốc tren gel agarose 1% Kết trình bày hình 19 52 Luận văn cao học Hoàng Anh M X 101112 13 Hình 19: Kết tinh plasmid tái tổ hợp pVFT2S Kênh M: ADN chuẩn (ADN λ cắt Hind III vµ EcoRI) Kênh đến 13: Các dòng plasmid tách từ dòng tế bào khác Kênh X: Plasmit pVFT2S gốc Dựa vào kết trên, chọn mẫu 4, 6, 9, 12 để kiểm tra gắn gen vào vector Các plasmid tinh cắt enzym giới hạn BamHI XhoI Kết trình bày hình sau: M 600bp Hình 20: Kết cắt plasmid pVFT2S – p24 enzym BamHI XhoI Kênh 1: Vector pVFT2S tái tổ hợp dòng cắt enzym BamHI Kênh 5: Vector pVFT2S tái tổ hợp dòng cắt enzym XhoI Kênh 3, 4, 5, 6: Vector pVFT2S tái tổ hợp dòng 4,6 ,9,12 cắt hỗn hợp enzym BamHI XhoI Kênh M: Maker chuẩn (ADN λ cắt HindIII EcoRI) Kết cho thấy dòng plasmid tái tổ hợp pVFT2S - p24 bị cắt hỗn hợp enzym BamHI XhoI văng đoạn ADN có kích thước 53 Luận văn cao học Hoàng Anh khoảng 600 bp Vì vậy, chọn dòng thành công vector biểu pVFT2S có gắn gen p24 virut HIV 3.7 Biểu protein P24 tái tổ hợp Sau chọn dòng thành công vector tái tổ hợp pVFT2S- p24, tiến hành biến nạp vector vào tế bào E coli chủng biểu BL21DE3 -Star, khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp mọc môi trường LB có kháng sinh kanamicin với nồng độ ức chế tối thiểu Để thu nhận protein tái tổ hợp tiến hành nuôi dòng khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp cảm ứng IPTG nồng độ cuối 1mM, nuôi lắc nhiệt độ 25oC, 30oC, 37oC thời gian 24, 8, Kết điện di gel polyacrylamide 12% cho thấy, sau cảm ứng, protein tái tổ hợp tạo nhiều nhiệt độ khác (hình 21) M Hình 21: Kết biểu protein tái tổ hợp p24 nhiệt độ khác M: Maker protein; Dòng : mẫu trước cảm ứng Dòng 2, 4, 6: mẫu không cảm ứng IPTG nuôi 25, 37, 300C Dòng 3,5,7: mẫu sau cảm ứng IPTG 1mM 25, 37, 300C Hình 22: Trình tự axit amin phân tử protein tái tổ hợp P24 biểu vector pVFT2S theo tính toán lý thuyết 54 Luận văn cao học Hoàng Anh Vector tái tổ hợp pVFT2S - p24 hình thành kết nối đoạn protein với nhau: P24 với khoảng 200 axit amin; đuôi His-tag với axit amin, GST - tag 200 axit amin, tổng cộng 406 axit amin ( hình 22) Trọng lượng phân tử tính theo lý thuyết khoảng 45 kDa Protein tái tổ hợp sau biểu cần tinh để kiểm tra phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể 3.8 Tinh protein tái tổ hợp Protein tái tổ hợp có gắn đuôi 6-Histidin, sử dụng cột Nikel Resin để tinh Sau đẩy protein tái tổ hợp khỏi cột, phân đoạn khác chứa protein tái tổ hợp kiểm tra độ điện di gel polyacrylamide 12% Kết trình bày hình 23 M Hình 23: Kết tinh protein p24 cột Ni2+ - Resin Dòng 8: Dịch trước tinh sạch; Dòng 7: Dịch sau đưa qua cột; Dòng 6: Dịch thu sau rửa cột; Dòng 5, 4, 3, 2, 1: Phân đoạn 5, 4, 3, 2, sau chiết NWB; M: Marker protein 3.9 Kiểm tra phản ứng đặc hiệu protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV tự nhiên kỹ thuật Western Blot Chúng kiểm tra mức độ phản ứng protein tái tổ hợp p24 với kháng thể kháng virus HIV tự nhiên kỹ thuật Western blot Kết cho thấy protein P24 virus HIV phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus HIV tự nhiên huyết bệnh nhân HIV (hình 24) M 55 Luận văn cao học Hoàng Anh Hình 24: Kháng thể kháng virut HIV tự nhiên phản ứng với protein tái tổ hợp P24 M: Marker protein; đến 5: Protein tái tổ hợp phân đoạn từ đến 3.10 Kết xác định nồng độ protein thu phương pháp Bradford Các phân đoạn protein thu được đem đông khô máy đông khô thời gian 6h Mẫu sau đông khô hòa lại 200µl nước cất Lấy phân đoạn 20 cho vào Ependorf, lắc đều, thu 100µl dịch Hút 40µl dịch hòa với 860 µl nước cất 300 µl Comasie 25%, lắc đều, để phút đo OD bước sóng 595nm Kết đo OD mẫu là: 1,2577 Dựa vào đồ thị chuẩn dựa nồng độ BSA biết, xác định nồng độ protein mẫu Bảng 5: Kết đo OD dựng đồ thị chuẩn dựa nồng độ BSA Stt Nồng độ BSA (µl) OD 595 Stt Nồng độ BSA (µl) OD 595 1.058 20 1.281 1.066 25 1.322 1.102 30 1.372 1.126 35 1.38 10 1.177 10 40 1.421 Từ kết này, có phương trình thể mối liên quan giá trị OD 595 nồng độ protein mẫu Y= 0,009971 X + 1,05102 Trong đó: Y : giá trị OD đo bước sóng 595 X: nồng độ protein có mẫu Suy ra::X= (Y-1,051)/0,009971 Kết đo OD mẫu là: 1,2577 Suy ra, nồng độ protein dịch pha loãng là: 20,8 µg Do đó, nồng độ protein 100ml dịch nuôi là: 20,8 : 40 × 1000 = 520 µg 56 Luận văn cao học Hoàng Anh KẾT LUẬN Đã tách dòng xác định trình tự gen mã hóa cho protein P24 HIV lấy từ mẫu máu bệnh nhân So sánh với trình tự gen mã hoá protein P24 HIV Ngân hàng Dữ liệu gen Quốc Tế có độ tương đồng cao đạt 98,03% Đã thiết kế thành công vector biểu pVFT2S - p24 mang gen mã hóa cho nucleocapsit HIV – Đã biểu thành công protein p24 tái tổ hợp hệ thống biểu E.coli BL21D3star nhiệt độ khác 25oC, 30oC, 37oC Kết cho thấy, nhiệt độ, lượng protein thu cao Đã kiểm tra phản ứng đặc hiệu protein tái tổ hợp với kháng thể kháng P24 tự nhiên huyết bệnh nhân kỹ thuật Western blot Đã xác định lượng protein biểu nhiệt độ 37 oC lượng protein thu 100 ml môi trường 520 µg 57 Luận văn cao học Hoàng Anh KIẾN NGHỊ Dựa vào kết nghiên cứu này, phát triển nghiên cứu để tạo kit test nhanh HIV dựa vào việc xác định kháng thể kháng P24 huyết Mặt khác, dùng kháng nguyên tái tổ hợp để tạo kháng thể để phát kháng nguyên P24 kỹ thuật ELISA tóm bắt kháng nguyên 58 Luận văn cao học Hoàng Anh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hà Nội 21/5/2007, “HIV/AIDS xếp hàng thứ ba nguyên nhân gây tử vong”, Hà Nội Mới, Hà Nội Mạng thông tin phòng chống AIDS – TP HCM (2002), “Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng văcxin phòng chống AIDS” Bản tin "AIDS Cộng đồng" - số 7, 2002 Mạng thông tin phòng chống AIDS – TP HCM, Xét nghiệm tìm kháng thể HIV, http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/AIDS/ttyh.asp Thông xã Việt Nam (2007), “Trên 12.000 người nhiễm HIV điều trị thuốc ARV ”, Sức khỏe- Y tế, 1/08/2007 Trọng Đạt (2007), “Dịch HIV/AIDS Việt Nam diễn biến phức tạp”, Báo điện tử - Đảng Cộng sản Việt Nam, ngày 1/8/2007 Tiếng Anh Andrea Rubbert, Mario Ostrowski (2005), Pathogenesis of Hiv-1 Infection 2005, HIV Medicine Barletta et al (2004), Lowering the detection limits of HIV-1 viral load using real-time immuno-PCR for HIV-1 p24 antigen, American Journal Clin.Pathol 122:20 Bernard Weber, 1,2 EL Hadji Mbargane Fall, Annemaria Berger, , Hands Wolheel Doerr2 (1998), Reduction of Diagnostic Window by New FourthGeneration, Journal of clinical Microbiology, American Society for Microbiology Bioafrica, HIV bioinformatic in Africa (2004), CA (Core antigen capsid protein), Information Systems for Biotechnology, 1/4/2004 10 Celum CL, Coombs RW, Lafferty W, Inui TS, Louie PH, Gates CA, McCreedy BJ, Egan R, Grove T, Alexander S, et al (1991) "Indeterminate human immunodeficiency virus type western blots: seroconversion risk, specificity of supplemental tests, and an algorithm for evaluation" Journal Infect Disease 164 (4), p: 656-664 11 Centers for Disease Control and Prevention (2001) "Revised guidelines for HIV counseling, testing, and referral" MMWR Recomm Rep 50 (RR-19), p: 1-57 12 Charless a Janeway, Paul Travers Mark Walport, Mark Shlomchik (2001), Acquired immune deficiency syndrome, Immunobiology pathV, Garland Science 13 Chan D, Kim P (1998) "HIV entry and its inhibition" Cell 93 (5), p 681-4 59 Luận văn cao học Hoàng Anh 14 Daniel R Kuritzkes, “Common question”, HIV infection, Laboratory Tests for Monitoring HIV-1 Infection, AIDS Research, Brigham and Women's Hospital Associate Professor of Medicine, Harvard Medical School 15 Dexter T K Poon, Guangde Li, and Anna Aldovini (3-1998), Nucleocapsid and Matrix Protein Contributions to Selective Human Immunodeficiency Virus Type Genomic RNA Packaging, Journal of Virology 1998 March; 72(3): 1983–1993, 16 Eleni Papadopulos-Eleopulos, Valendar F Turner and John M Papadimitriou (1999), “Is a Positive Western Blot Proof of HIV Infection?”, Natture, 1999 Feb 4;397(6718):436-41 17 Gamble, T.R., Yoo, S., Vajdos, F.F., von Schwedler, U.K., Worthylake, D.K., Wang, H., McCutcheon, J.P., Sundquist, W.I., Hill, C.P.(1997), Structure of the carboxyl-terminal dimerization domain of the HIV-1 capsid protein, Department of Biochemistry, University of Utah, Salt Lake City, UT 84132, USA, Science v278 p: 849-53, 1997 18 Gao, F., Bailes, E., Robertson, D L., Chen, Y., Rodenburg, C M., Michael, S F., Cummins, L B., Arthur, L O., Peeters, M., Shaw, G M., Sharp, P M., and Hahn, B H (1999) "Origin of HIV-1 in the Chimpanzee Pan troglodytes troglodytes" Nature 397 (6718), 436-441 19 Guo Junqing Jin Ningyi Mao Chunsheng Guo Zhiru Yin Fengge Yin Zhen (1997), High level expression of P24 protein of Human immunodeficiency Virus type in E.coli, The Veterinary Institute,ChangchuUniversity ofAgriculture and Animal Sciences,Changchun 130062 20 Haseltine, William A., and Flossie Wong-Staal "The Molecular Biology of the AIDS Virus." Scientific American October 1988: 52-60 21 Hiscott J, Kwon H, Genin P (2001) "Hostile takeovers: viral appropriation of the NF-kappaB pathway" J Clin Invest 107(2): 143-151 22 HIV and Hepatitis (2001), Diagnosing HIV Infection 23 International Committee on Taxonomy of Viruses (28-02-2006), Lentivirus National Institutes of Health (61.0.6) 24 International Committee on Taxonomy of Viruses Retroviridae National Institutes of Health (61.0.6) (28-2-2006) 25 Keele, B F., van Heuverswyn, F., Li, Y Y., Bailes, E., Takehisa, J., Santiago, M L., Bibollet-Ruche, F., Chen, Y., Wain, L V., Liegois, F., Loul, S., Mpoudi Ngole, E., Bienvenue, Y., Delaporte, E., Brookfield, J F Y., Sharp, P M., Shaw, G M., Peeters, M., and Hahn, B H (2006) "Chimpanzee Reservoirs of Pandemic and Nonpandemic HIV-1" Science Online 2006-05-25 26 Lévy, J A (1993) "HIV pathogenesis and long-term survival" AIDS (11): 1401-1410 27 Masaru Kanekiyo, Kazuhiro Matsuo, Makiko Hamatake, Takaichi Hamano, Takeaki Ohsu, Sohkichi Matsumoto, Takeshi Yamada, Shudo Yamazaki, 60 Luận văn cao học Hoàng Anh Atsuhiko Hasegawa, Naoki Yamamoto, Mitsuo Honda (2005), Mycobacterial Codon Optimization Enhances Antigen Expression and VirusSpecific Immune Responses in Recombinant Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin Expressing Human Immunodeficiency Virus Type Gag, AIDS Research Center, National Institute of Infectious Diseases, Shinjuku, Tokyo 162-8640 28 Michael P Busch, M.D., Ph.D, HIV p24 Rabbit Monoclonal Antibody, Epitomics, Inc., 863 Mitten Road, Suite 103 Burlingame, University of California, San Francisco, California 94010-1303 29 Monaco-Malbet, S., Berthet-Colominas, C., Novelli, A., Battai, N., Piga, N., Cheynet, V., Mallet, F., Cusack, S (2000), Crystal structure of dimeric HIV1 capsid protein, European Molecular Laboratory Biology Grenoble Outstation B.P 156X F-38042 Cedex 9, Grenoble, France, Structure v8 p 1069-77 30 Patricia Obregon (9-1-2007), Production of Recombinant HIV-1 Antigen in Transgenic Tobacco, Dept Of Cellular and Molecular Medicine, St Georges Hospital University of London, London SW17 0RE 31 Pope M, Haase A (2003) "Transmission, acute HIV-1 infection and the quest for strategies to prevent infection" Nat Med (7): 847-52 32 Prasanta K Ghosh(2006), Recombinant HIV-1 p24 protein: cloning,expression, purification and use in the development of ELISA kits, Division of Biotechnology, Cadila Pharmaceuticals Limited, Sarkhej-Dholka Road, Bhat, Ahmedabad 382 210, India 33 PubMed and National Institutes of Health.(9-1-2006), Guidelines for using antiretroviral agents among HIV-infected adults and adolescents, Panel on Clinical Practices for Treatment of HIV 34 Schochetman, Gerald and George, Richard J (1992), Aids Testing Methodology and Management Issues Springer-Verlag, New York, ISBN 3540-97534-9 35 Teacher's Guide (2002), HIV Testing ELISA, Museum of Science and Industry, Chicago 36 Thoai Duong ly, Lynn Martin, David Daghf AL Arnold Snagdridge, Daniel West, Richard Bristow, Laurence Chalouas, Xiaxing Qui, Sheng C Lou, Jefferey C, Hunt, Gerald Schochetman, Sushill G.Devare (2001), Seven Human Immunodeficiency Virus (HIV) Antigen- Antibody Combination Assays: Evaluation of HIV Seroconversion Sensitivity and Subtype Detection, 0095-1137/01/$04.00_0 DOI: 10.1128/JCM.39.9.3122–3128.2001 37 Thomas J Hope, PhD, Didier Trono, MD, The Salk Institute (11/2000), Structure, Expression, and Regulation of the HIV Genome, HIV InSite Knowledge, Base Chapter 38 UNAIDS (12/2006), AIDS epidemic update, unaids.com 39 WainHobson, S., 1989 HIV genome variability in vivo AIDS 3: supp 1; 139 61 Luận văn cao học Hoàng Anh 40 Weber J, Kennedy A, Callow D, Zigmond A, Cheingsong-Popov R, Martin S, Vyakarnam A, Gotch F, McMichael A, Adams S 1992 Jul, “A phase study of the safety & immunogenicity of Ty.p24.VLP in healthy volunteers”, Int Conf AIDS 19-24; 8: A43, St Mary's Hospital Medical School, London 41 Wolfgang Preiser (2005), HIV ELISAs and Western Blots, HIV Medicine 2005, 42 Working Group on Antiretroviral Therapy and Medical Management of HIV-Infected Children (17-1-2006) Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection, Department of Health and Human Services 43 www.jenabioscience.com, Human Immunodeficiency Virus-1, Recombinant nucleocapsid protein in E coli, measurement, and characterization of antibodies and their use as research and diagnostic tools, Appendix I Immunologist Toolbox 44 XpressBio Life Science Product, “HIV-1 p24 Elisa Assay”, Catalog XB- 1000, www.expressbiotech.com 45 Zheng, Y H., Lovsin, N and Peterlin, B M (2005) "Newly identified host factors modulate HIV replication" Immunol Lett 97 (2): 225-234 46 http://www BBCnews.com, 3D Structure of HIV Revealed 47 http://www.cureresearch.com/index.html.Causes of HIV/AIDS 48 http://www.fda.gov/cber/products/testkits.htm 49 http://www.mcld.co.uk/hiv/ Western blot 50 http://www.unaids.org/en/in+focus/topic+areas/hiv+diagnostic+tests.asp 51 http://www.who.int/bct/Main_areas_of_work/BTS/HIV_Diagnostics/HIV_D iagnostics.htm 52 http://www.who.int/bct/Main_areas_of_work/BTS/HIV_Diagnostics/Overvie w_of_HIV_Diagnostic_Tech.htm 53 http://www OpenChemist.net (06-03-2006), The HIV Life Cycle 54 Wikipedia, the free encyclopedia, AIDS 55 Wikipedia, the free encyclopedia, HIV 56 Wikipedia, the free encyclopedia, HIV disease progression rates 57 Wikipedia, the free encyclopedia, HIV structure and genome 62 [...]... mặt của kháng thể Giai đoạn chuyển từ kết quả âm tính kháng thể sang dương tính được gọi là giai đoạn chuyển đổi huyết thanh [36, 49] Ở giai đoạn đầu của sự biến đổi huyết thanh, kháng thể kháng protein p24 xuất hiện đầu tiên Sự có mặt của kháng thể kháng p24 đánh dấu sự giảm sự lưu hành kháng nguyên p24 trong cơ thể bệnh nhân Kháng thể kháng p24 vẫn tiếp tục hạn chế lưu hành của p24 cho đến khi kháng. .. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein P24 tái tổ hợp Trước vai trò to lớn của việc sử dụng kháng nguyên P24 trong chẩn đoán và chế tạo vacxin, việc nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp P24 đang thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học và cũng thu được những thành tựu đáng kể [28, 32, 43, 48] Các nhà khoa học đã nghiên cứu sản xuất protein P24 tái tổ hợp để dùng trong chẩn đoán HIV bằng... những người tình nguyện khỏe mạnh [40] Ngoài ra, protein P24 tái tổ hợp còn được ứng dụng trong việc chế tạo kháng thể đơn dòng để dùng trong việc chế tạo các kit chẩn đoán HIV [36] Trong giới hạn luận văn này, chúng tôi bước đầu nghiên cứu việc sản xuất protein P24 tái tổ hợp dùng trong mục địch phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân 1.5 Vectơ Một vectơ được sử dụng cho mục đích... để kiểm tra sự nhiễm HIV như kit HIV- 1 P24 Extended Range Kit của hãng Gentaur [44], Bio Rad Thành công từ việc tối ưu hóa sản xuất protein tải tổ hợp P24 trong Mycobacterium bovis [27] và trong E coli [19] Việc chuyển gen p24 vào trong cây thuốc là một trong những thành tựu quan trong để hướng tới việc chế tạo vacxin cho người nhiễm HIV [30] Có nghiên cứu đã tạo được gen p24 tái tổ hợp từ nấm men và. .. trị có hiệu quả tốt nhất cho bệnh nhân phụ thuộc rất nhiều vào sự xét nghiệm phát hiện bệnh sớm và theo dõi tiến triển của bệnh thông qua các phương pháp xét nghiệm phù hợp với từng giai đoạn Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các loại kit phát hiện nhanh HIV, trong đó việc phát hiện HIV dựa vào kháng nguyên và kháng thể kháng P24 đang được rất nhiều các nhà nghiên cứu và các hãng sản xuất quan tâm... Các kháng nguyên của HIV thường được xác định bằng các phương pháp như phương pháp enzym liên kết miễn dịch (ELISA hoặc EIA) Các phiến plastic được phủ bằng protein của virut (kháng nguyên) Huyết thanh bệnh nhân được đưa vào giếng Nếu trong huyếtt thanhh có kháng thể kháng HIV, các kháng nguyên HIV sẽ liên kết với các kháng thể đặc hiệu trong các phiến Sau khi rửa huyết thanh, các kháng thể gắn kết được... Sơ đồ cấu trúc và vị trí vắt giới hạn của vector pVFT2S 25 Luận văn cao học Hoàng Anh Để có thể thu nhận protein tái tổ hợp thì gen mã hoá cho protein phải đựơc gắn vào vector biểu hiện Có rất nhiều hệ vectơ biểu hiện tương ứng với nhiều loại tế bào biểu hiện khác nhau ở đây, để biểu hiện gen p24 mã hoá một phần kháng nguyên lõi của HIV, chúng tôi chọn vector pVFT2S làm vector biểu hiện Vectơ pVFT2S... và 2001) [33, 34] Trong tình trạng hiểu biết hiện nay, nhiễm HIV coi như là suốt đời mang HIV Phát hiện HIV dựa trên 3 nguyên tắc [50, 51, 52] • Nuôi cấy và phân lập virut • Phát hiện kháng thể kháng HIV • Phát hiện trực tiếp kháng nguyên, acid nucleic hoặc protein của virut 1.3.1.1 Phương pháp phân lập và nuôi cấy virut HIV HIV- 1 có thể được cấy từ huyết tương hoặc từ tiểu cầu đơn nhân của bệnh nhân. .. kết được xác định bằng kháng thể thứ 2, kháng thể này liên kết với một enzym như alkalin phophataza, hoặc peroxidaza Sự liên kết giữa kháng thể thứ 2 với kháng thể kháng HIV có thể xác định được bằng phản ứng của đĩa với cơ chất của alkalin phophataza hoặc peroxidaza làm chuyển màu khi được phân cắt bằng enzym [35] 1.3.1.4 Phương pháp xác định kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật ELISA... dịch của bệnh nhân chống lại HIV bằng các tế bào Lympho T gây độc (cytotoxic T hoặc T CD8+) và kháng thể của tế bào Lympho B tạo ra Kháng thể đầu tiên do HIV kích thích sinh ra là kháng thể kháng protein p24 Quá trình này làm giảm một lượng đáng kể HIV Lượng tế bào T CD4+ có thể được tái tạo lại một lượng nào đó hoặc thậm chí bằng lượng tế bào ban đầu Sau đó, bệnh nhân không thể hiện một triệu chứng ... tài nghiên cứu: Nghiên cứu biểu gen p24 HIV kiểm tra phản ứng protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân với mục đích:  Tách dòng đọc trình tự gen p24 HIV  Bước đầu nghiên cứu. .. trình tự gen p24 HIV  Bước đầu nghiên cứu biểu gen p24 E coli  Kiểm tra phản ứng protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV tự nhiên huyết bệnh nhân HIV Đề tài thực phòng Vi sinh vật học phân... nhân đưa vào giếng Nếu huyếtt thanhh có kháng thể kháng HIV, kháng nguyên HIV liên kết với kháng thể đặc hiệu phiến Sau rửa huyết thanh, kháng thể gắn kết xác định kháng thể thứ 2, kháng thể liên