Phân lập và tuyển chọn nấm men có khả năng lên men rượu vang dưa hấu và đài hoa bụp giấm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƢỢU VANG DƢA HẤU VÀ ĐÀI HOA BỤP GIẤM NGUYỄN THANH NHẬT AN GIANG, THÁNG NĂM 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƢỢU VANG DƢA HẤU VÀ ĐÀI HOA BỤP GIẤM NGUYỄN THANH NHẬT MÃ SỐ SV: DSH173266 GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN TS ĐOÀN THỊ MINH NGUYỆT AN GIANG, THÁNG NĂM 2021 CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG Chuyên đề “Phân lập tuyển chọn nấm men có khả lên men rượu vang Dưa hấu đài hoa Bụp giấm”, sinh viên Nguyễn Thanh Nhật thực dƣới hƣớng dẫn TS Đoàn Thị Minh Nguyệt Phản biện Phản biện TS HỒ THỊ THU BA Ths NGUYỄN PHÚ THỌ Giáo viên hƣớng dẫn TS ĐOÀN THỊ MINH NGUYỆT i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực chuyên đề “Phân lập tuyển chọn nấm men có khả lên men rƣợu vang Dƣa hấu đài hoa Bụp giấm”, xin chân thành cảm ơn TS Đồn Thị Minh Nguyệt tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ để tơi hồn thành tốt chun đề tốt nghiệp ! Tôi xin gửi lời cảm ơn quý thầy/cô Bộ môn Công nghệ Sinh học – Trƣờng Đại học An Giang cho kiến thức vô quý báu nhƣ kinh nghiệm, kỹ suốt trình học tập trƣờng Cảm ơn bạn sinh viên khóa 19SH bạn sinh viên thực chuyên đề - khóa luận phịng thí nghiệm 410 giúp đỡ tơi suốt thời gian thực chuyên đề Tôi gửi lời cảm ơn đến cán phịng thí nghiệm khu Công nghệ sinh học hỗ trợ dụng cụ, hóa chất đầy đủ q trình thực đề tài Cuối cùng, tơi xin kính chúng quý thầy/cô Bộ môn Công nghệ Sinh học – Trƣờng Đại học An Giang, cán phịng thí nghiệm ln dồi sức khỏe, gặp nhiều may mắn thành công sống ! Xin chân thành cảm ơn ! An Giang, ngày 23 tháng 05 năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Thanh Nhật ii LỜI CAM KẾT Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu cơng trình nghiên cứu có xuất sứ rõ ràng Những kết luận chun đề này, chƣa cơng bố bất kí cơng trình khác An Giang, ngày 23 tháng 05 năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Thanh Nhật iii MỤC LỤC Trang DANH SÁCH HÌNH vii DANH SÁCH BẢNG ix DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT x CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT RƢỢU VANG 2.1.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất rƣợu vang giới 2.1.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất rƣợu vang Việt Nam 2.2 NẤM MEN 2.2.1 Đặc điểm chung nấm men 2.2.2 Dinh dƣỡng nấm men 2.2.3 Nấm men sản xuất rƣợu vang 2.3 NGUYÊN LIỆU DƢA HẤU VÀ BỤP GIẤM 2.3.1 Nguyên liệu Dƣa hấu 2.3.2 Nguyên liệu Bụp giấm 2.4 RƢỢU VANG QUẢ 10 2.4.1 Định nghĩa 10 2.4.2 Thành phần hóa học rƣợu vang 10 2.4.3 Phân loại rƣợu vang 12 2.4.4 Quá trình sản xuất rƣợu vang 13 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 16 3.1.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 16 3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 16 3.1.3 Dụng cụ thí nghiệm 16 iv 3.1.4 Thiết bị 16 3.1.5 Hóa chất 16 3.1.6 Môi trƣờng phân lập nấm men 17 3.2 PHƢƠNG PHÁP 17 3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập định danh sơ dòng nấm men từ dịch Dƣa hấu lên men 17 3.2.2 Thí nghiệm 2: Tuyển chọn dịng nấm men có khả lên men Dƣa hấu đài hoa Bụp giấm 18 3.2.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá khả lên men dòng nấm men đƣợc tuyển chọn 19 3.2.4 Cách xử lý số liệu 22 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀO THẢO LUẬN 23 4.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN TỪ DỊCH DƢA HẤU LÊN MEN 23 4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CỦA CÁC CHỦNG NẤM MEN ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC 28 4.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CỦA CÁC DÒNG NẤM MEN ĐÃ ĐƢỢC TUYỂN CHỌN 30 4.4 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG SẢN PHẨM LÊN TỪ DƢA HẤU KẾT HỢP VỚI BỤP GIẤM 33 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 KẾT LUẬN 36 5.2 KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC A 39 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 39 PHỤ LỤC B 43 CÁC PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 43 Phƣơng pháp nhân giống nấm men, đếm mật số 43 Các phƣơng pháp xác định tiêu lý hóa 43 a Xác định hàm lượng chất khơ hịa tan (oBrix) 43 b Xác định pH 44 c Độ cồn 44 Phƣơng pháp xác định độ cồn 44 a Nguyên lý 44 v b Dụng cụ 44 PHỤ LỤC C 46 PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG SẢN PHẨM 46 PHỤ LỤC D 49 KẾT QUẢ THỐNG KÊ 49 PHỤ CHƢƠNG D.1: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 49 Phụ chƣơng D.1.1: Chiều cao cột khí CO2 sinh sau 49 Phụ chƣơng D.1.2: Chiều cao cột khí CO2 sau 49 Phụ chƣơng D.1.3: Chiều cao cột khí CO2 sau 12 50 Phụ chƣơng D.1.4: Chiều cao cột khí CO2 sau 16 51 Phụ chƣơng D.1.5: Chiều cao cột khí CO2 sau 20 51 Phụ chƣơng D.1.6: Chiều cao cột khí CO2 sau 24 52 Phụ chƣơng D.1.7: Độ cồn sau chƣng cất 53 PHỤ CHƢƠNG D.2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 53 Phụ chƣơng D.2.1: Độ cồn sau chƣng cất tỉ lệ nguyên liệu dòng nấm men tuyển chọn đƣợc 53 Phụ chƣơng D.2.2: Độ pH sau lên men tỉ lệ nguyên liệu dòng nấm men đƣợc tuyển chọn 54 Phụ chƣơng D.2.3: Độ Brix sau lên men tỉ lệ nguyên liệu dòng nấm men đƣợc tuyển chọn 55 Phụ chƣơng D.2.4: Điểm đánh giá cảm quan 55 vi DANH SÁCH HÌNH TÊN HÌNH TRANG Hình Hình ảnh dƣa hấu Hình Hình ảnh bụp giấm Hình Hình dạng tế bào hình dạng khuẩn lạc (X40) dòng nấm men M1 24 Hình Hình dạng tế bào hình dạng khuẩn lạc (X40) dịng nấm men M2 24 Hình Hình dạng tế bào hình dạng khuẩn lạc (X40) dịng nấm men M3 25 Hình Hình dạng tế bào hình dạng khuẩn lạc (X40) dịng nấm men M4 25 Hình Hình dạng tế bào hình dạng khuẩn lạc (X40) dịng nấm men M5 26 Hình Hình dạng tế bào hình dạng khuẩn lạc (X40) dòng nấm men M6 26 Hình Hình dạng tế bào hình dạng khuẩn lạc (X40) dịng nấm men M7 27 Hình 10 Hình dạng tế bào hình dạng khuẩn lạc (X40) dịng nấm men M8 27 Hình 11 Các dịng nấm men cho vào ống nghiệm để đo cột khí CO2 28 Hình 12 Độ cồn sau lên men tỉ lệ nguyên liệu Dƣa hấu : Bụp giấm 30 Hình 13 Độ pH dịng nấm men trƣớc sau lên men với tỉ lệ ngyên liệu Dƣa hấu : Bụp giấm 31 Hình 14 Độ Brix dòng nấm men trƣớc sau lên men với tỉ lệ nguyên liệu Dƣa hấu : Bụp giấm 32 Hình 15 Rƣợu vang Dƣa hấu kết hợp Bụp giấm tỉ lệ 180g : 70g 34 Hình 16 Rƣợu vang Dƣa hấu kết hợp Bụp giấm tỉ lệ 150g : 100g 34 Hình 17 Nấm men sau tăng sinh 39 Hình 18 Mẫu lên men thí nghiệm 39 Hình 19 Mẫu thí nghiệm đo chiều cao cột khí CO2 ống 40 vii Durham Hình 20 Chƣng cất để đo độ cồn 40 Hình 21 Độ Brix trƣớc lên men đƣợc đo Brix kế 41 Hình 22 Chỉnh pH trƣớc lên men 41 Hình 23 Độ cồn sau chƣng cất 42 Hình 24 Các nghiệm thức thí nghiệm 42 viii Hình 23 Độ cồn sau chƣng cất Hình 24 Các nghiệm thức thí nghiệm 42 PHỤ LỤC B CÁC PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Phƣơng pháp nhân giống nấm men, đếm mật số - Môi trƣờng nuôi cấy: Nutrient Broth - Lấy mẫu: + Lấy mẫu có tính đại diện + Lƣợng mẫu lấy vừa phải + Dụng cụ lấy phải vô trùng - Nhân giống nấm men: cho môi trƣờng vào chai nƣớc biển đậy kín nút gịn, nắp giấy, đem khử trùng 121oC 15 phút, để nguội, chủng nấm men vào, đặt lên máy lắc 120 vòng/phút 24 nhiệt độ phòng Sau nhân giống, kiểm tra mật số nấm men phƣơng pháp đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu - Đếm mật số nấm men buồng đếm hồng cầu + Lắc ống nghiệm chứa mẫu pha loãng, dùng ống hút hút giọt vào mặt kính, đậy kính lên lƣới đếm Chú ý khơng để tạo thành bọt khí lƣới đếm tràn dịch mẫu xuống rãnh + Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi, sau tiến hành đếm tế bào lớn góc Trong lớn, đếm lần lƣợt từ ô thứ đến ô thứ 16 Chỉ đếm tế bào nằm ô tế bào nằm cạnh liên tiếp chiều Ghi số lƣợng tế bào đếm đƣợc ô lớn Đếm buồng đếm sau lấy giá trị trung bình Sau dùng xong buồng đếm kính phải đƣợc đem rửa lau khô + Số lƣợng tế bào 1mL mẫu dịch đƣợc tính cơng thức: Số tế bào/mL = (a*4000*103*c)/b Trong đó: a – số tế bào lớn b – số ô ô lớn 103 – chuyển mm3 mL (1000mm3 = 1mL) c – độ pha loãng (100 lần) Các phƣơng pháp xác định tiêu lý hóa a Xác định hàm lượng chất khơ hịa tan (oBrix) Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, lần lặp lại Dùng dung dịch nƣớc cất nhỏ lên mặt kính khúc xạ kế đậy nắp kính lại xem xanh trở vị trí khơng chƣa, chƣa dùng tua vít chỉnh cho khơng 43 Dùng ống nhỏ giọt hút dịch nhỏ - giọt vào mặt kính khúc xạ kế, đậy chắn sáng để dịch phủ lăng kính đƣa lên mắt ngắm điều chỉnh độ phóng đại sau cho xem đƣợc rõ đọc số thang đo đƣợc b Xác định pH Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, lần lặp lại Hiệu chỉnh máy đo dịch chuẩn pH= 3,8 Rửa đầu cực nƣớc cất ngâm ngập đầu cực đo pH dung dịch cần đo, đọc giá trị hiển thị ổn định máy c Độ cồn Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn toàn ngẫu nhiên, lần lặp lại Sử dụng khúc xạ kế đo độ cồn rƣợu để xác định độ cồn dịch lên men Lấy 20 mL dịch lên men, rót dịch vào bình cầu tráng bình 100 mL nƣớc cất Nối bình với hệ thống chƣng cất cồn, tiến hành chƣng cất thu hồi nƣớc ngƣng vào bình định mức 50 mL nƣớc ngƣng đến vạch bình định mức Dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ nƣớc ngƣng sau nguội, lấy - giọt chấm vào mặt kính Đậy nắp kính lại Quan sát đọc độ cồn qua ống kính Phƣơng pháp xác định độ cồn a Nguyên lý Muốn xác định độ cồn phải chƣng cất để tách rƣợu khỏi chất hòa tan b Dụng cụ + Bếp điện + Bình tam giác 100 mL + Bình tam giác 500 mL + Cồn kế + Ống đong c Tiến hành Hình B.1 Hệ thống chƣng cất rƣợu 44 Lấy 100 mL dịch rƣợu cho vào bình A có dung tích khoảng 500 mL, cho tiếp vào bình 100 ml nƣớc cất Sau đó, nối bình với hệ thống chƣng cất tiến hành chƣng cất nƣớc ngƣng tụ bình định mức α cịn 2-3 ml đầy 100 mL kết thúc trình cất rƣợu Cất xong bình α thu đƣợc 100 mL cồn nguyên chất, sau hạ nhiệt độ bình α xuống 20 0C giữ 20 phút Sau cho vào ống đong 100 mL tiến hành xác định độ cồn cồn kế Thao tác xác định độ cồn: cho cồn kế từ từ vào ống đong đựng 100 mL dịch cồn, buông tay để vạch thƣớc cồn kế tự đọc kết Đọc hai đến ba lần để lấy kết trung bình Khi đọc phải đặt mắt ngang tầm mực chất lỏng không đọc phần lồi phần lõm Trong dung dịch chứa chất hoạt động bề mặt Do đó, làm ảnh hƣởng tới sức căng bề mặt, dẫn tới làm tăng giảm nồng độ so với thực tế 45 PHỤ LỤC C PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG SẢN PHẨM Chất lƣợng cảm quan sản phẩm đƣợc đánh giá theo tiêu chuẩn Việt Nam Tiêu chuẩn sử dụng hệ số 20 điểm, xây dựng thang thống có bậc (từ - 5) điểm điểm cao cho tiêu Đối với sản phẩm đồ uống có cồn nói chung sản phẩm nƣớc uống lên men nói riêng tiêu cảm quan quan trọng cần đánh giá gồm: mùi, vị, độ màu sắc Dƣới bảng chuẩn đƣợc xây dựng để tiến hành đánh giá chất lƣợng cảm quan sản phẩm rƣợu vang dƣa hấu Dựa vào bảng để tiến hành lập chọn ngƣời đánh giá cảm quan Khi đánh giá cảm quan tiêu cảm quan sản phẩm, ngƣời đánh giá cảm quan tham gia cho điểm, kết đƣợc trình bày trung bình cộng điểm ngƣời đánh giá Sau bảng đánh giá mùi, vị, độ màu sắc Bàng C.1: Đánh giá mùi sản phẩm lên men từ Dƣa hấu đài hoa Bụp giấm Các tiêu Mùi Hệ số trọng lƣợng Điểm số chất lƣợng Mô tả Có mùi lạ, khó chịu sản phẩm hỏng Mùi lạ rõ rệt, nồng, hăng Khơng có mùi lạ, thoảng mùi nguyên liệu, mùi rƣợu cao, không hài hịa Có mùi thơm ngun liệu, mùi cồn cao, khơng hài hịa Mùi thơm nhẹ, đặc trƣng sản phẩm, thơm mùi rƣợu tƣơng đối hài hòa Mùi thơm dịu, hài hòa, mùi đặc trƣng nguyên liệu, thoảng mùi rƣợu 1,2 (Nguồn: TCVN 7045:2009) 46 Bảng C.2: Đánh giá vị sản phẩm lên men từ Dƣa hấu đài hoa Bụp giấm Các tiêu Vị Hệ số trọng lƣợng Điểm số chất lƣợng Mô tả Vị chua gắt, đắng gắt, vị lạ sản phẩm hỏng Vị chua gắt, đắng mạnh, khơng ngọt, chát có vị lạ Vị chua trội, ngọt, đắng Có mùi thơm nguyên liệu, mùi cồn cao, không hài hịa Rƣợu có vị hài hịa, dễ chịu, đặc trƣng, hậu vừa phải Vị đƣờng, rƣợu, hài hòa với vị chua nhẹ acid, vị đậm đà, êm dịu, hậu kéo dài (Nguồn: TCVN 7045:2009) 2,0 Bảng C.3: Đánh giá độ màu sắc sản phẩm lên men từ Dƣa hấu đài hoa Bụp giấm Các tiêu Độ trong, màu sắc Hệ số trọng lƣợng 0,8 Điểm số chất lƣợng Mô tả Vẩn đục lơ lửng, màu bẩn, cánh gián Đục, nhiều cặn lơ lửng, màu không nâu nhạt Hơi đục, nhiều cặn lơ lửng, màu nâu đỏ nhạt Hơi đục, cặn lơ lửng, màu vàng nâu nhạt Trong, khơng có vẩn đục, màu vàng ngà, rót chảy lỏng Rất trong, khơng vẩn đục, màu vàng đẹp, rót chảy lỏng (Nguồn: TCVN 7045:2009) 47 Bảng C.4: Đánh giá mức độ chất lƣợng sản phẩm lên men từ Dƣa hấu đài hoa Bụp giấm STT Mức chất lƣợng Số điểm chung Yếu cầu tối thiểu điểm trung bình chƣa có trọng lƣợng Loại tốt 18,6 – 20,0 Mùi 4,8 ; Vị 4,8 Loại 15,2 – 18,5 Mùi 3,8 ; Vị 3,8 Loại trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi tiêu 2,8 Loại 7,2 – 11,1 Mỗi tiêu 1,8 Loại 4,0 – 7,1 Mỗi tiêu 1,0 Loại hỏng – 3,9 Mỗi tiêu < 1,0 (Nguồn: TCVN 7045:2009) 48 PHỤ LỤC D KẾT QUẢ THỐNG KÊ PHỤ CHƢƠNG D.1: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Phụ chƣơng D.1.1: Chiều cao cột khí CO2 sinh sau Phụ chƣơng D.1.2: Chiều cao cột khí CO2 sau 49 Phụ chƣơng D.1.3: Chiều cao cột khí CO2 sau 12 50 Phụ chƣơng D.1.4: Chiều cao cột khí CO2 sau 16 Phụ chƣơng D.1.5: Chiều cao cột khí CO2 sau 20 51 Phụ chƣơng D.1.6: Chiều cao cột khí CO2 sau 24 52 Phụ chƣơng D.1.7: Độ cồn sau chƣng cất PHỤ CHƢƠNG D.2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Phụ chƣơng D.2.1: Độ cồn sau chƣng cất tỉ lệ nguyên liệu dòng nấm men tuyển chọn đƣợc 53 Phụ chƣơng D.2.2: Độ pH sau lên men tỉ lệ nguyên liệu dòng nấm men đƣợc tuyển chọn 54 Phụ chƣơng D.2.3: Độ Brix sau lên men tỉ lệ nguyên liệu dòng nấm men đƣợc tuyển chọn Phụ chƣơng D.2.4: Điểm đánh giá cảm quan 55 56