Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế hFGF 2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR 2) tái tổ hợp từ escherichia coli

MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG ix LỜI MỞ ĐẦU .1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HỌ NHÂN TỐ TĂNG TRƢỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF (FIBROBLAST GROWTH FACTOR) 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Nhân tố tăng trƣởng FGF-2 .7 1.1.2.1 Cấu trúc nhân tố tăng trƣởng FGF-2 .7 1.1.2.2 Hoạt tính sinh học FGF-2 .12 1.1.2.3 Các hƣớng ứng dụng FGF-2 13 1.2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 16 1.2.1 Giới thiệu chung 16 1.2.2 Các vị trí biểu protein tái tổ hợp .18 1.2.2.1 Biểu tế bào chất 18 1.2.2.2 Biểu chu chất .18 1.2.2.3 Tiết môi trƣờng 19 1.2.3 Một số hệ thống cảm ứng biểu E coli 19 1.2.3.1 Hệ thống cảm ứng IPTG 19 1.2.3.2 Hệ thống cảm ứng L – arabinose .22 1.2.3.3 Hệ thống cảm ứng muối 22 i Luận văn thạc sĩ sinh học 1.3 TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP 23 1.3.1 Tủa muối 23 1.3.2 Sự thẩm tích 23 1.3.3 Sắc ký 23 1.3.3.1 Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography – IEC) 25 1.3.3.2 Sắc ký lực (Affinitive chromatography, AC) .26 VẬT LIỆU-PHƢƠNG PHÁP .28 2.1 VẬT LIỆU 29 2.1.1 Thiết bị – Dụng cụ 29 2.1.2 Hóa chất môi trƣờng .30 2.1.2.1 Hóa chất 30 2.1.2.2 Môi trƣờng .34 2.1.3 Vật liệu sinh học 34 2.1.3.1 Chủng vi sinh vật 34 2.1.3.2 Plasmid 34 2.1.3.3 Thang chuẩn 35 2.2 PHƢƠNG PHÁP 36 2.2.1 Cấu trúc chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 37 2.2.1.1 Thu nhận gen fgf-2 phản ứng PCR 37 2.2.1.2 Tách chiết, thu nhận plasmid pET-His 37 2.2.1.3 Xử lý gen fgf2 plasmid vector pET-His enzyme cắt hạn chế 39 2.2.1.4 Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pET-fgf2 39 2.2.1.5 Biến nạp sản phẩm nối vào E coli DH5α 40 2.2.1.6 Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 41 2.2.2 Cấu trúc chủng E Coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 44 2.2.2.1 Thu nhận plasmid pET-fgf2 44 2.2.2.2 Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3) 44 2.2.2.3 Sàng lọc thể biến nạp phƣơng pháp PCR khuẩn lạc .44 ii Luận văn thạc sĩ sinh học 2.2.3 Biểu protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan E coli BL21(DE3) 44 2.2.3.1 Cảm ứng biểu protein FGF-2 44 2.2.3.2 Thu mẫu xử lý mẫu 45 2.2.4 Bƣớc đầu lên men hệ thống lên men quy mô lít để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan 45 2.2.4.1 Các bƣớc chuẩn bị 45 2.2.4.2 Lên men cảm ứng biểu FGF-2 .47 2.2.4.3 Đánh giá hiệu lên men .47 2.2.5 Tinh chế FGF-2 48 2.2.5.1 Tinh chế sắc ký trao đổi cation 48 2.2.5.2 Tinh chế sắc ký lực heparin .49 2.2.6 Các phƣơng pháp phân tích protein 50 2.2.6.1 Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 50 2.2.6.2 Phƣơng pháp nhuộm gel điện di 51 2.2.6.3 Kiểm tra phƣơng pháp lai Western Blot .51 2.2.6.4 Định lƣợng protein phƣơng pháp Bradford 53 2.2.6.5 Định lƣợng FGF-2 phần mềm xác định đậm độ Quantity One 54 KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN 56 3.1 Cấu trúc chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 .57 3.1.1 Thu nhận gen fgf2 phản ứng PCR 57 3.1.2 Thu nhận xử lý plasmid pET-His enzyme BamHI NdeI .58 3.1.3 Biến nạp sản phẩm nối vào E coli DH5α 59 3.1.4 Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 60 3.1.5 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 phƣơng pháp PCR enzyme cắt giới hạn 61 3.1.6 Kiểm tra giải trình tự gen fgf2 63 3.2 Cấu trúc chủng E coli BL21(DE3) biểu protein fgf-2 63 3.2.1 Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3) 63 iii Luận văn thạc sĩ sinh học 3.2.2 Sàng lọc thể biến nạp phƣơng pháp PCR khuẩn lạc 64 3.3 Xác nhận biểu protein tái tổ hợp FGF-2 chủng BL21(DE3) / pET-fgf2 65 3.4 Bƣớc đầu lên men hệ thống lên men quy mô lít để thu nhận protein FGF -2 tái tổ hợp dạng tan 67 3.4.1 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng 67 3.4.2 Khảo sát biểu protein FGF-2 theo thời gian cảm ứng 68 3.4.3 Khảo sát chu kì phá tế bào áp suất cao .69 3.5 Tinh chế FGF-2 72 3.5.1 Tinh chế sắc ký trao đổi cation .72 3.5.2 Tinh chế sắc ký lực với heparin 73 KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ .76 KẾT LUẬN 77 ĐỀ NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC 82 iv Luận văn thạc sĩ sinh học Ket-noi.com dien dan giao duc LỜI MỞ ĐẦU Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2) protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động nhiều trình thể nhƣ cân nội mô, trì tăng sinh tế bào thần kinh, chữa lành xƣơng bị tổn thƣơng, kích thích hình thành tế bào bạch cầu hình thành mạch máu từ mạch máu sẵn có, kích thích tăng trƣởng tế bào mềm, ngăn chặn trình xơ hóa phổi, chữa lành vết thƣơng sửa chữa mô… Do đa dạng chức năng, FGF-2 đƣợc quan tâm nghiên cứu để ứng dụng nhiều lĩnh vực Nhờ khả kích thích tăng sinh, ức chế biệt hóa, FGF-2 đƣợc sử dụng nhƣ thành phần thiếu nuôi cấy tế bào gốc phôi ngƣời Trong công nghệ mỹ phẩm, số nghiên cứu cho thấy FGF-2 có khả làm đen tóc, ngăn ngừa lão hóa da nên ngày đƣợc hãng mỹ phẩm tin tƣởng bổ sung vào sản phẩm chăm sóc da, tóc Bên cạnh đó, lĩnh vực y học, việc sử dụng FGF-2 đem lại nhiều kết khả quan việc điều trị nhiều bệnh nhƣ bệnh thiếu máu tim cục bộ, điều trị bỏng, ngăn ngừa sẹo lồi phẫu thuật, chữa bệnh viêm nha chu… Trƣớc đây, sản phẩm FGF-2 thƣờng đƣợc thu nhận cách tách chiết từ dòng tế bào động vật Việc sản xuất FGF-2 phƣơng pháp đảm bảo hoạt tính sản phẩm nhƣng sản lƣợng thấp giá thành cao Nhằm khắc phục nhƣợc điểm trên, ngƣời ta tiến đến việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ để sản xuất nhân tố FGF-2 Do đặc điểm FGF-2 cấu nối disulfide nội phân tử không cần biến đổi sau dịch mã cho hoạt tính sinh học nên hệ thống chủng chủ E.coli đảm nhiệm việc sản xuất FGF-2 có hoạt tính thay cho dòng tế bào động vật Ở Việt Nam, FGF-2 chủ yếu đƣợc nhập từ công ty nƣớc nên giá thành cao (1mg protein FGF-2 ngƣời đƣợc sản xuất nhờ kĩ thuật gen có giá khoảng 1260 -1- Luận văn thạc sĩ sinh học USD, hãng ProSpec) gây khó khăn việc ứng dụng Do đó, việc sản xuất FGF-2 nƣớc nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng diện rộng với giá thành thấp cần đƣợc quan tâm đầu tƣ Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, tiến hành đề tài “Tạo dòng, biểu tinh chế hFGF-2 (human fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp từ Escherichia coli” nhƣ bƣớc đầu để nghiên cứu, sản xuất FGF-2 hiệu quả, kinh tế cho ứng dụng nƣớc Tuy nhiên, hạn chế việc sử dụng E coli làm tế bào chủ protein thƣờng đƣợc tạo dƣới dạng thể vùi hoạt tính, cần phải trải qua trình gấp cuộn phức tạp, tốn Do vậy, luận văn đƣợc thực với mục đích xây dựng quy trình sản xuất FGF-2 sử dụng chủng chủ E coli để cảm ứng biểu protein dạng tan tế bào chất Đây hƣớng chiến lƣợc hiệu triển vọng cho phép sản xuất FGF-2 có hoạt tính cách đơn giản với hiệu suất cao, giúp hạ giá thành sản phẩm Với mục tiêu trên, thực luận văn với nội dung sau: - Tạo dòng vi khuẩn E coli DH5α mang vector pET-fgf2 - Tạo dòng vi khuẩn E coli BL21(DE3) mang vector pET-fgf2 có khả biểu rhFGF-2 tế bào chất - Tiến hành lên men thu nhận đƣợc protein rhFGF-2 từ 1L dịch lên men, đánh giá hiệu lên men - Tinh chế protein rhFGF-2 từ dịch lên men sắc ký trao đồi ion sắc kí lực; đánh giá độ tinh hiệu suất trình tinh chế -2- Luận văn thạc sĩ sinh học Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT HOÀNG VĂN QUỐC CHƢƠNG (2004) Kỹ thuật lên men công nghiệp Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trang 3-4, 9-20 NGUYỄN THỊ MỸ TRINH (2011) Nghiên cứu sản xuất protein FGF-2 (Fibroblast growth factors-2) tái tổ hợp vi khuẩn Escherichia coli Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh TRẦN LINH THƢỚC, ĐẶNG THỊ PHƢƠNG THẢO (2010) Thực tập kỹ thuật thao tác gen Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG ANH A BIKFALVI, S KLEIN, G PINTUCCI ET AL., (1997) “Biological Roles of Fibroblast Growth Factor-2,” Endocrine Reviews, vol 18, no 1, pp 26-45 A LOGAN, A BAIRD, (1996) "Fibroblast growth factors," Growth Factors and Cytokines in Health and Disease, L Derek and B Carolyn, eds., pp 147-178: JAI A BEENKEN, M MOHAMMADI (March 2009) The FGF family: biology, pathophysiology and therapy, Nature Reviews Drug Discovery vol 8, 235-253 BAIRD, A., & KLAGSBRUN, M (1991) The Fibroblast growth factor family New York, N.Y., New York Academy of Sciences B ENSOLI, C SGADARI, G BARILLARI ET AL (2003), "Chapter 31 - The fibroblast growth factors," The Cytokine Handbook (Fourth Edition), W T Angus and T L Michael, eds., pp 747-XVII, London: Academic Press CHOI, J., & LEE, S (2004) Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli Applied Microbiology and Biotechnology 64, 625-635 - 78 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tài liệu tham khảo 10 C KINSLAND, (2010) "9.19 - Bacterial Protein Overexpression Systems and Strategies," Comprehensive Natural Products II, M Editors-in-Chief: Lew and L Hung-Wen, eds., pp 695-721, Oxford: Elsevier 11 C RYAN, S ALEXANDER, R GREGORY, ET AL (2011), Cloning and Expression of Human Recombinant FGF-2 Isoforms 12 E F F JOSEPH SAMBROOK, TOM MANIATIS, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 13 ELISSAVET KARDAMI, KAREN A DETILLIEUX, SARAH K JIMENEZ, PETERA CATTINP (2006) Fibroblast Growth factor-2 As a therapeutic agent against heart disease Myocardial ischemia, Basic Science for the Cardiologist 21, 145-166 14 GARKE G, DECKWER WD, & ANSPACH FB (2000) Preparative two-step purification of recombinant human basic fibroblast growth factor from high-celldensity cultivation of Escherichia coli Journal of Chromatography B, Biomedical Sciences and Applications 737, 1-2 15 GE HEALTHCARE (2007) Recombinant Protein Purification Handbook: Principles and Methods Uppsala, GE Healthcare Bio-Sciences AB 16 G HANNIG, S C MAKRIDES, “Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli,” Trends in biotechnology, vol 16, no 2, pp 54-60, 1998 17 I DELRIEU, (2000) “The high molecular weight isoforms of basic fibroblast growth factor (FGF-2): an insight into an intracrine mechanism,” FEBS Letters, vol 468, no 1, pp 6-10 18 J P COOKE, R BHATNAGAR, A SZUBA ET AL., (2000) “Fibroblast growth factor as therapy for critical limb ischemia: a case report,” Vascular Medicine, vol 4, no 2, pp 89-91 - 79 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tài liệu tham khảo 19 L MACFARLANE, P R MURPHY, (2011) “FGF2 (fibroblast growth factor (basic)),” Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology, pp 169182 20 L MACFARLANE, Y GU, A G CASSON ET AL., (2010) “Regulation of Fibroblast Growth Factor-2 by an Endogenous Antisense RNA and by Argonaute-2,” Molecular Endocrinology, vol 24, no 4, pp 800-812 21 MAI OKADA-BAN, JEAN PAUL THIERY, JACQUELINE JOUANNEAU (2000) Molecules in focus Fibroblast growth factor-2 The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 32, 263 – 267 22 MAKRIDES, S C (1996) Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli Microbiological reviews 60, 512-538 23 M OKADA-BAN, J P THIERY, AND J JOUANNEAU, (2000) “Fibroblast growth factor-2,” The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, vol 32, no 3, pp 263-267 24 NOVAGEN (2003) pET System Manual, 10th edition 25 PADERA, R F (2000) Cell signaling by fibroblast growth factor 2: investigations into interactions between fibroblast growth factor 2, fibroblast growth factor receptor and heparin-like glycosaminoglycans Thesis (M.D with honors), Harvard University, MIT Division of Health Sciences and Technology 26 POLNASZEK N, KWABI-ADDO B, PETERSON LE, OZEN M, GREENBERG NM, ORTEGA S, BASILICO C, & ITTMANN M (2003) Fibroblast growth factor promotes tumor progression in an autochthonous mouse model of prostate cancer Cancer Research.63, 5754-60 27 Quantity One User Guide for Version 4, Windows and Macintosh Bio-Rad Technical Service Department 28 ROSENBERG, I M (2004) Protein analysis and purification benchtop techniques Boston, Birkhäuser - 80 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tài liệu tham khảo 29 RUEL M, LAHAM RJ, PARKER JA, POST MJ, WARE JA, SIMONS M, & SELLKE FW (2002) Long-term effects of surgical angiogenic therapy with fibroblast growth factor protein The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 124, 2834 30 SØRENSEN HP, & MORTENSEN KK (2005) Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli Journal of Biotechnology 115, 113-28 31 TERPE K, IBA GmbH (2002) Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production:from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems Appl Microbiol Biotechnol 2006 Sep;72(2):211-22 32 VENKATARAMAN, G R., RAHUL; SASISEKHARAN, V.; SASISEKHARAN, RAM (1970) Molecular characteristics of fibroblast growth factor–fibroblast growth factor receptor–heparin-like glycosaminoglycan complex The National Academy of Sciences 33 WANG, D I K (2000) The effects of fibroblast growth factor on the early stages on in vitro endothelial wound repair Ottawa, National Library of Canada 34 Y.-R YUN, J E WON, E JEON ET AL., (2010) “Fibroblast Growth Factors: Biology, Function, and Application for Tissue Regeneration,” Journal of Tissue Engineering, vol 1, no TÀI LIỆU TỪ INTERNET 35 http://www.molecularstation.com/sds-page-gel-electrophoresis/ 36 http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/bradford.html - 81 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận thấp; 2, mẫu protein trước qua cột; 3, phân đoạn protein không gắn lên cột; 4-8 phân đoạn 20%, 40%, 60%, 80%, 100% dung dịch dung ly B Kết điện di SDS-PAGE đƣợc trình bày hình 3.12 cho thấy phân đoạn 20% dung dịch B xuất vạch protein nằm vạch có kích thƣớc 14,4kDa 20,1kDa thang chuẩn, phù hợp với khối lƣợng FGF-2 (18kDa) cho tín hiệu dƣơng tính lai với kháng thể kháng FGF-2 Do vậy, kết luận vạch FGF-2 mục tiêu Ở phân đoạn dung ly tiếp theo, không thấy xuất vạch protein mục tiêu Nhƣ protein mục tiêu đƣợc dung ly hoàn toàn 20% dung dịch B Protein phân đoạn 20% đƣợc thu nhận, đánh giá độ tinh nhƣ hiệu suất thu hồi tiếp tục đƣợc tinh chế sắc ký lực heparin nhằm thu nhận FGF-2 tinh 95% Hiệu trình tinh chế sắc ký trao đổi cation đƣợc đánh giá phần mềm Quantity One (phụ lục 5) phƣơng pháp Bradford Kết tính toán cho thấy với cột trao đổi cation SP FF 5ml, thu nhận protein tái tổ hợp FGF-2 có độ tinh 78,5% với hiệu suất thu hồi 60,06% (bảng 3.4) Bảng 3.4 Hiệu suất trình tinh chế sắc ký trao đổi cation Nồng độ Tổng protein protein (mg/ml) (mg) 30 3,34 100,20 6,90 6,91 12 0,44 5,28 78,50 4,15 Mẫu Thể tích tinh chế (ml) Trƣớc Sau Hiệu suất Độ tinh (%) Lƣợng FGF-2 (mg) 60,06% 3.5.2 Tinh chế sắc ký lực với heparin Do FGF-2 tƣơng tác đặc hiệu với heparin, nên thí nghiệm sử dụng cột sắc ký Heparin để tinh chế bƣớc hai nhằm tăng độ tinh sản phẩm protein tái tổ hợp FGF-2 lên 95% - 73 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận Kết điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh chế sắc kí lực heparin cho thấy, giếng (hình 3.13) tƣơng ứng với phân đoạn dung ly 60% dung dịch B xuất vạch khoảng 18kDa, ngang với vạch FGF-2 trƣớc tinh chế Đồng thời, kết lai Western Blot với kháng thể đặc hiệu kháng FGF-2, xuất vạch tín hiệu tƣơng ứng với vạch protein gel SDS-PAGE Do đó, khẳng định protein đƣợc thu nhận giếng FGF-2 mục tiêu Hình 3.13 Hình điện di SDS (A) Western Blot (B) với kháng thể kháng FGF-2 sản phẩm tinh chế sắc ký lực với Heparin 1, thang protein phân tử lượng thấp; 2, mẫu trước qua cột; 3, mẫu không bám vào cột Heparin; 4, mẫu tinh chế thu phân đoạn dung ly 60% dung dịch B Sử dụng phần mềm Quantity One (phụ lục 6) phƣơng pháp đo Bradford cho thấy, protein tái tổ hợp FGF-2 thu đƣợc sau tinh chế Heparin có độ tinh 97,10% với hiệu suất thu hồi sản phẩm 76,73% (bảng 3.5) - 74 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận Bảng 3.5 Hiệu suất tinh chế FGF-2 cột Heparin Mẫu tinh Thể tích Nồng độ protein Lƣợng Tổng Độ tinh protein (mg) (%) FGF-2 chế (ml) Trƣớc 30 0,34 10,20 78,50 7,65 Sau 11 0,55 6,05 97,10 5,87 (mg/ml) Hiệu suất (mg) 76,73% Từ kết đạt đƣợc trên, tính toán cho thấy từ lít dịch lên men dòng E.coli BL21(DE3)/pET-FGF, thu nhận đƣợc 106,15 mg FGF-2 dạng tinh sạch, đạt hiệu suất thu hồi khoảng 46,08% (bảng 3.6) Bảng 3.6 Tóm tắt hiệu trình thu nhận FGF-2 từ lít dịch lên men chủng BL21(DE3)/pET-FGF Khối lƣợng Bƣớc thu nhận FGF-2 (mg) Pha tan dịch đồng tế bào Tinh chế trao đổi cation Tinh chế lực heparin Độ tinh (%) Hiệu suất riêng bƣớc (%) Hiệu suất thu hồi (%) 230,33 6,90 100 100 138,34 78,50 60,06 60,06 106,15 97,10 76,73 46,08 - 75 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết luận – Đề nghị KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ - 76 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết luận – Đề nghị KẾT LUẬN Trong thời gian thực luận văn, thu đƣợc kết nhƣ sau: - Đã tạo đƣợc dòng vi khuẩn E coli DH5α mang vectortái tổ hợp pET-fgf2 - Đã tạo đƣợc dòng vi khuẩn E coli BL21(DE3) mang vector pET-fgf2 có khả biểu rhFGF-2 tế bào chất - Đã tiến hành lên men thu nhận đƣợc 0,23g protein rhFGF-2 từ 1L dịch lên men - Đã tinh chế đƣợc protein rhFGF-2 từ dịch lên men sắc ký trao đổi ion sắc kí lực với độ tinh đạt 97,1% hiệu suất thu hồi đạt 46,08% ĐỀ NGHỊ Với kết nêu trên, có số đề nghị nhƣ sau: - Khảo sát điều kiện lên men nhằm nhu nhận lƣợng lớn FGF-2 dạng tan tế bào chất E coli - Khảo sát tối ƣu hóa quy trình tinh chế FGF-2 sắc ký trao đổi cation sắc ký lực heparin - Tiến hành quy trình lên men tinh chế quy mô lớn - Xây dựng quy trình xác định hoạt tính riêng FGF-2 dựa khả kích thích tăng sinh dòng nguyên bào sợi chuột 3T3 - 77 - Luận văn thạc sĩ sinh học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AC Affinity Chromatography Amp Ampicillin Ampr Ampicillin resistance APS Alkaline Phosphatases bp Pase pair CBB Coomassie Brilliant Blue cDNA Complementary Deoxyribose Nucleic Acid DCW Dry cell weight dH2O Distilled water (nƣớc cất) DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMEM/F12 Dulbecco’s Modifed Eagle’s Medium and Ham’s F12 medium DNA Deoxyribose Nucleic Acid dNTP DeoxyNucleotide TriPhosphate DTT Dithioerythritol E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic acid FBS Fetal Bovin Serum fgf Fibroblast Growth Factor Gene FGF Fibroblast Growth Factor FGFR Fibroblast Growth Factor Receptor HIC Hydrophobic Interaction Chromatography HRP Horseradish peroxidase IEX Ion Exchange Chromatograph iFGF Intracellular Fibroblast Growth Factor v Luận văn thạc sĩ sinh học IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactoside Kan Kanamycin Kanr Kanamycin resistance kDa kilo Dalton LB Môi trƣờng Luria-Bertani MCS Multiple Cloning Site mRNA Messenger Ribose Nucleic Acid OD Optical Density PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBS Phosphate Buffered Saline PBST Phosphate Buffered Saline Tween PCA Phenol Chloroform isoamylalcohol PCR Polymerase Chain Reaction PMSF Phenylmethylsulfonyl Fluoride RNA Ribose Nucleic Acid RNase Enzyme thuỷ giải RNA rpm Round Per Minute SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel SP FF Sepharose™ Fast Flow TEMED Tetramethylethylenediamine vi Luận văn thạc sĩ sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ thành phần chuỗi polypeptide FGF Hình 1.2 Cấu trúc gene mã hóa protein FGF-2 Hình 1.3 Cấu trúc ba chiều FGF-2 Hình 1.4 Các dạng FGF-2 tạo thành .9 Hình 1.5 Đơn vị heparin saccharide chuỗi heparin 11 Hình 1.6 Cấu trúc dimer dạng cis (a), dimer dạng trans (b) tetramer (c)của FGF (hình tròn)và chuỗi heparin 12 Hình 1.7 Sự hình thành cầu nối disuldide chu chất E coli 19 Hình 1.8 Cơ chế điều hòa T7 promotor 21 Hình 1.9 Minh họa sắc ký trao đổi ion 26 Hình 1.10 Hình minh họa sắc ký lực .27 Hình 2.1 Plasmid pET-His 35 Hình 2.2 Các thang chuẩn 35 Hình 2.3 Quy trình tạo plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 36 Hình 2.4 Chương trình PCR thu nhận gen fgf2 .37 Hình 2.5 Chương trình PCR khuẩn lạc mồi đặc hiệu 42 Hình 2.6 Chương trình PCR plasmid mồi thương mại 43 Hình 2.7 Các vị trí lắp đặt thiết bị bình lên men .46 Hình 2.8 Hệ thống thiết bị lên men 47 Hình 2.9 Sơ đồ minh họa thứ tự thành phần bước chuyển màng .52 Hình 3.1 Sản phẩm PCR thu nhận gen fgf2 57 Hình 3.2 Kết thu nhận cắt mở vòng plasmid pET-His 58 Hình 3.3 Kết biến nạp sản phẩm nối vào E coli DH5α .59 Hình 3.4 Kết sàng lọc thể biến nạp E coli DH5α PCR khuẩn lạc 60 Hình 3.5 Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 phương pháp PCR cắt hạn chế 62 vii Luận văn thạc sĩ sinh học Hình 3.6 Kết biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3) 64 Hình 3.7 Kết PCR khuẩn lạc tế bào E coli BL21(DE3) cặp mồi FGF2F/FGF2-R 65 Hình 3.8 Kết điện di SDS-PAGE (A) lai Western (B) xác nhận biểu FGF-2 66 Hình 3.9 Kết phân tích trọng lượng khô tế bào trình lên men 67 Hình 3.10 Hình điện di SDS-PAGE mẫu protein pha tan thời điểm lên men .68 Hình 3.11 Kết điện di SDS-PAGE mẫu protein sau chu kì phá tế bào phương pháp đồng hóa dựa vào áp suất cao .70 Hình 3.12 Hình điện di SDS-PAGE (A) Western Blot (B) với kháng thể kháng FGF-2 sản phẩm tinh chế sắc ký trao đổi cation .72 Hình 3.13 Hình điện di SDS (A) Western Blot (B) với kháng thể kháng FGF-2 sản phẩm tinh chế sắc ký lực với Heparin 74 viii Luận văn thạc sĩ sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các chức họ nhân tố FGF Bảng 1.2 Chức FGF-2 hệ quan khác 13 Bảng 1.3 Các chủng E coli thường dùng để biểu protein tái tổ hợp .16 Bảng 2.1 Công thức đổ gel phân tách gel gom điện di SDS-PAGE 32 Bảng 3.1 Kết định lượng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 pha tan (%) sau lên men 69 Bảng 3.2 Kết định lượng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 pha tan (%) sau chu kì phá tế bào 71 Bảng 3.3 Hiệu thu nhận FGF-2 chủng E coli BL21(DE3)/pET-FGF sau trình lên men .71 Bảng 3.4 Hiệu suất trình tinh chế sắc ký trao đổi cation 73 Bảng 3.5 Hiệu suất tinh chế FGF-2 cột Heparin .75 Bảng 3.6 Tóm tắt hiệu trình thu nhận FGF-2 từ lít dịch lên men chủng BL21(DE3)/pET-FGF 75 ix Luận văn thạc sĩ sinh học Phụ lục PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đƣờng chuẩn Bradford Phụ lục Kết phân tích Quantity One: trình lên men 1, Thang protein phân tử lượng thấp; 2-10: lượng protein pha tan tương ứng từ BL21(DE3)/pET-FGF sau 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 lên men - 82 - Luận văn thạc sĩ sinh học Phụ lục Phụ lục Kết phân tích Quantity One: chu kì phá mẫu Kết điện di SDS-PAGE mẫu protein sau chu kì phá tế bào phương pháp đồng hóa dựa vào áp suất cao 1, Thang protein phân tử lượng thấp; 2, dịch protein tổng; 3, 4, Dịch lên men sau chu kì phá tế bào thể vùi (3) thể tan (4); 5, 6, Dịch lên men sau chu kì phá tế bào thể vùi (5) thể tan (6); 7, 8, Dịch lên men sau chu kì phá tế bào thể vùi (7) thể tan (8) Phụ lục Trọng lƣợng khô tế bào thu đƣợc 1ml dịch lên men sau lên men Thời gian Trọng lƣợng khô tế bào (g/ml) 0.0001 0.0015 ± 0.0001 0.0029 ± 0.0001 0.0037 ± 0.0004 0.0041 ± 0.0003 10 0.0042 ± 0.0001 - 83 - Luận văn thạc sĩ sinh học Phụ lục 12 0.0043 ± 0.0003 14 0.0047 ± 0.0006 16 0.0046 ± 0.0002 18 0.0049 ± 0.0002 20 0.0051 ± 0.0005 22 0.0051 ± 0.0003 24 0.0052 ± 0.0005 Phụ lục Kết phân tích Quantity One: hiệu tinh chế FGF-2 sắc ký trao đổi cation Hình điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh chế sắc ký trao đổi cation 1, thang protein phân tử lượng thấp; 2, mẫu protein trước qua cột; 3, phân đoạn protein không gắn lên cột; 4, phân đoạn 20% dung dịch dung ly B - 84 - Luận văn thạc sĩ sinh học Phụ lục Phụ lục Kết phân tích Quantity One: hiệu tinh chế FGF-2 sắc ký lực heparin Hình điện di sản phẩm tinh chế sắc ký lực với Heparin 1, thang protein phân tử lượng thấp; 2, mẫu trước qua cột; 3, mẫu không bám vào cột Heparin; 4, mẫu tinh chế thu phân đoạn dung ly 60% dung dịch B Phụ lục Kết SDS-PAGE mẫu tinh chế không bổ sung MgCl2 - 85 - Luận văn thạc sĩ sinh học Phụ lục Hình điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh chế sắc ký trao đổi cation 1, mẫu protein trước qua cột; 2, phân đoạn protein không gắn lên cột; 3-7,lần lượt phân đoạn 20%, 40%, 60%, 80% dung dịch dung ly B Phụ lục Kết SDS-PAGE mẫu tinh chế cation dung ly 10% 20% dung dịch B Hình điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh chế sắc ký trao đổi cation 11, mẫu protein trước qua cột; 2, phân đoạn protein không gắn lên cột; 3, phân đoạn 10% dung dịch dung ly B; 4, phân đoạn 20% dung dịch dung B - 86 - Luận văn thạc sĩ sinh học [...]... disulfide hay có cơ chế ngăn chặn sự hình thành cầu nối này nên protein mục tiêu có thể không có cầu nối disulfide hay có nhƣng cấu hình sai Hƣớng giải quyết là đồng biểu hiện DsbA và DsbB giúp tăng khả năng hình thành cầu nối disulfide [9, 30] 1 .2. 2 Các vị trí biểu hiện protein tái tổ hợp 1 .2. 2.1 Biểu hiện ở tế bào chất Hầu hết protein đƣợc biểu hiện ở E coli đều đƣợc thiết kế biểu hiện ở tế bào chất... đƣợc sử dụng phổ biến trong biểu hiện protein tái tổ hợp [3, 24 , 31] b Hệ thống vector pET Các vector pET đƣợc xây dựng đầu tiên bởi Studier và cộng sự Những vector pET hiện nay đƣợc bổ sung thêm nhiều đặc tính mới giúp việc tạo dòng, phát hiện và tinh chế protein mục tiêu trở nên dễ dàng hơn Việc lựa chọn một loại vector pET phù hợp để biểu hiện protein mục tiêu phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trong đó,... nhiều chủng đột biến, nhiều vector tạo dòng thích hợp và thao tác di truyền dễ dàng [22 , 30] Bảng 1.3 Các chủng E coli thường được dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp[ 9] Chủng Đặc điểm - 16 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu AD494 Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất BL21(DE3) Bất hoạt protease lon và ompT BL21 trxB Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào... không biểu hiện khi đƣợc tạo dòng vào tế bào chủ không có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase Điều này giúp plasmid tồn tại ổn định trong tế bào chủ do protein tái tổ hợp khi tạo ra có thể gây độc cho tế bào - 20 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Tuy nhiên, việc điều hòa biểu hiện T7 polymerase dựa vào promoter lac có hạn chế là trong một số trƣờng hợp không cảm ứng mà vẫn có sự biểu hiện. .. cho sản xuất vƣợt mức protein tái tổ hợp Hệ thống sử dụng chủng chủ E coli GJ1158 đƣợc thiết kế có promoter proU đƣợc cảm ứng bởi NaCl Để tăng cƣờng biểu hiện, hệ thống - 22 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu cảm ứng muối có nhân tố phiên mã T7 RNA polymerase, do đó protein đƣợc biểu hiện vƣợt mức với lƣợng lớn [31] 1.3 TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP Protein đƣợc tinh sạch dựa trên những đặc... (FGF1–FGF10 and FGF16–FGF23) đƣợc phân vào sáu họ nhỏ dựa vào sự tƣơng đồng trình tự cũng nhƣ sự phát sinh giống loài: FGF1 và FGF2; FGF3, FGF7, FGF10, FGF 22; FGF4, FGF5 và FGF6; FGF8, FGF1 7và FGF18; FGF9, FGF16 và FGF20; FGF19, FGF21 và FGF23 Những nhân tố FGFs không đƣợc xếp vào họ nào (FGF11-FGF14) có sự tƣơng đồng trình tự cao với họ FGF nhƣng không gắn đƣợc lên thụ thể của FGF và vì thế không đƣợc... quá trình tổng hợp collagen, hình thành mạch máu giúp ngăn ngừa và đẩy lùi tiến trình lão hóa của da [4, 34] Nhờ có khả năng ngăn ngừa sự lão hóa da mà hiện nay FGF -2 đƣợc ứng dụng rất nhiều trong công nghệ mỹ phẩm Một số sản phẩm đã đƣợc thƣơng mại chứa FGF -2 đã đƣợc đƣa ra thị trƣờng chăm sóc sắc đẹp và nhận đƣợc những phản hồi tích cực 1 .2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 1 .2. 1 Giới... tế bào chất của tế bào Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E coli gặp nhiều khó khăn nhƣ protein thƣờng đƣợc tạo ra ở dạng không tan, không có hoạt tính sinh học gọi là thể vùi (inclusion body), tế bào chất của E coli không có cơ chế thúc đẩy sự hình thành cầu nối disulfide… Tuy nhiên, hiện nay việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E coli vẫn là phƣơng án đƣợc sử... thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Sự hình thành mạch FGF20 Tế bào gốc khỉ FGF1, FGF2 Tế bào biểu mô 1.1 .2 Nhân tố tăng trƣởng FGF -2 1.1 .2. 1 Cấu trúc của nhân tố tăng trƣởng FGF -2 Hình 1 .2 Cấu trúc gene mã hóa protein FGF -2[ 17] Gen mã hóa FGF -2 ngƣời nằm trên vùng q26 -27 của nhiễm sắc thể số 4 Gen dài khoảng 71kb gồm một vùng không dịch mã 5’UTR (Untranslated Region), 3 exon, 2 intron và vùng không dịch... tử và đặc điểm khác nhau Khi cDNA FGF -2 đƣợc biểu hiện trong tế bào, dạng mở đầu bằng codon AUG có trọng lƣợng phân tử thấp (LMW) là 18kDa Dạng còn lại đƣợc mở đầu bằng codon CUG có trọng lƣợng phân tử cao (HMW) lần lƣợt là 22 ; 22 ,5; 24 ; và 34kDa [23 ] Hình 1.4 Các dạng FGF -2 được tạo thành [23 ] Sự khác biệt về cấu trúc giữa FGF -2 có trọng lƣợng phân tử lớn với FGF -2 có trọng lƣợng 18kDa là sự kéo dài ... pET-fgf2 41 2. 2 .2 Cu trỳc chng E Coli BL21(DE3) mang plasmid tỏi t hp pET-fgf2 44 2. 2 .2. 1 Thu nhn plasmid pET-fgf2 44 2. 2 .2. 2 Bin np plasmid pET-fgf2 vo E coli BL21(DE3) 44 2. 2 .2. 3... 2% agar (gi 4oC) - Mụi trng lờn men: + Trace: ZnSO4.7H2O 0 ,28 8g/l; MnSO4.7H2O 0,142g/l; H3BO3 0,062g/l; NaMoO4.2H2O 0,048g/l; CoCl2.6H2O 0,048g/l; KI 0,083g/l; CaSO4.5H2O 0, 125 g/l; H2SO4 0 ,25 M... protein FGF -2 tỏi t hp dng tan 45 2. 2.4.1 Cỏc bc chun b 45 2. 2.4 .2 Lờn men cm ng biu hin FGF -2 .47 2. 2.4.3 ỏnh giỏ hiu qu lờn men .47 2. 2.5 Tinh ch FGF -2