TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN và TINH CHẾ HFGF 2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR 2) tái tổ hợp từ ESCHERICHIA COLI 3

Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 Để khẳng định các thể biến nạp thu đƣợc chứa plasmid tái tổ hợp pET-fgf2, chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc các thể

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN

3.1 Cấu trúc chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2

3.1.1 Thu nhận gen fgf2 bằng phản ứng PCR

Gen fgf2 được thu nhận bằng phương pháp PCR với khuôn là plasmid pIDT-fgf2

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% với thang chuẩn,

kết quả được trình bày trong hình 3.1

Hình 3.1 Sản phẩm PCR thu nhận gen fgf2; giếng 1, thang DNA 1kb plus;

giếng 2, sản phẩm PCR đoạn gene fgf2 với cặp mồi FGF2-F và FGF2-R

Trong hình 3.1, ở giếng 2 xuất hiện một vạch DNA có kích thước khoảng 450bp

khi so sánh với thang chuẩn 1kb plus (giếng 1), bằng với kích thước dự đoán của gen

fgf2 Như vậy, chúng tôi có thể đã khuếch đại được đúng đoạn gen mục tiêu cần dùng

Sau đó, đoạn gen fgf2 thu được từ phản ứng PCR sẽ được xử lý với cặp enzyme BamHI

và NdeI để chuẩn bị cho phản ứng nối với plasmid pET-His đã cắt mở vòng để tạo

plasmid tái tổ hợp

3.1.2 Thu nhận và xử lý plasmid pET-His bằng 2 enzyme BamHI và NdeI

Để chuẩn bị một lượng lớn vector cho phản ứng nối, chúng tôi tiến hành cấy

E.coli DH5α mang plasmid pET-His vào ống nghiệm chứa môi trường LB lỏng, nuôi

cấy lắc qua đêm ở 37oC, tách chiết và xử lý plasmid thu nhận được bằng hai enzyme

cắt hạn chế BamHI và NdeI nhằm chuẩn bị cho chiến lược tạo dòng đầu dính Kết quả thu nhận plasmid được trình bày trong hình 3.2

Hình 3.2 Kết quả thu nhận và cắt mở vòng plasmid pET-His; giếng

1, thang DNA 1kb; giếng 2, Plasmid pET-His; giếng 3, plasmid

pET-His cắt bằng enzyme BamHI và NdeI

Plasmid pET-His có kích thước 4636bp, mang trình tự nhận biết của hai enzyme

BamHI (4122) và NdeI (4088) Trước khi xử lý, plasmid pET-His tách chiết cho 2 vạch

tương ứng với hai trạng thái tự nhiên khác nhau của plasmid (giếng 2) Sau khi xử lý với hai enzyme BamHI (4122) và NdeI (4088), plasmid trở về dạng thẳng có kích thước khoảng 4602bp (giếng 3) nằm giữa hai vạch 4000bp và 5000bp của thang 1kb

Như vậy, chúng tôi đã tách chiết được plasmid pET-His và cắt mở vòng thành công plasmid này

3.1.3 Biến nạp sản phẩm nối vào E coli DH5α

Sau khi xử lý và tinh sạch plasmid pET-His bằng 2 enzyme BamHI và NdeI, chúng tôi thực hiện phản ứng nối trực tiếp plasmid này với gen fgf2 Hỗn hợp sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào khả nạp E coli DH5α Thực hiện đối chứng âm là

tế bào DH5α không được biến nạp sản phẩm nối Kết quả được trình bày trên hình 3.3

Hình 3.3 Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào E coli DH5α

1, Đĩa đối chứng;2, Đĩa biến nạp

Ở đĩa đối chứng, các tế bào E coli DH5α không được biến nạp sản phẩm nối pET-fgf2 nên không mang gen kháng kháng sinh Do đó, các tế bào này không tăng

trưởng được trên đĩa môi trường LB-Amp100

Ở đĩa biến nạp, các tế bào E coli DH5α được biến nạp với hỗn hợp sản phẩm nối chứa pET-fgf2 có mang gen kháng kháng sinh Do đó, các tế bào này tăng trưởng được

trên đĩa môi trường LB Amp100 Các khuẩn lạc mọc được trên môi trường LB-Amp100 sẽ được tiếp tục kiểm tra để chọn lọc dòng mang vector tái tổ hợp

3.1.4 Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2

Để khẳng định các thể biến nạp thu đƣợc chứa plasmid tái tổ hợp pET-fgf2, chúng

tôi tiến hành sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc các thể biến nạp bằng cặp mồi đặc hiệu FGF2-F/FGF2-R và cặp mồi T7 promoter/T7 terminator Kết quả đƣợc trình bày ở

hình 3.4

Hình 3.4 Kết quả sàng lọc thể biến nạp E coli DH5α bằng PCR khuẩn lạc

giếng 1, thang DNA 1kb; giếng 2, PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi

F/R; giếng 3, PCR plasmid pIDT-fgf2 bằng cặp mồi

FGF2-F/FGF2-R; giếng 4, PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi FGF2-FGF2-F/FGF2-R; giếng 5, PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi T7promoter/T7terminator; giếng 6,7,

PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi T7promoter/T7terminator

Cặp mồi FGF2-F/FGF2-R sẽ bắt cặp đặc hiệu với trình tự ở hai đầu gen nên đoạn

khuếch đại sẽ có kích thước 438bp Cặp mồi T7promoter/T7terminator bắt cặp đặc

hiệu với vùng T7promoter và T7terminator trên plasmid nên sản phẩm khuếch đại sẽ

có kích thước dự đoán sẽ là 618bp bao gồm gen fgf2 và một đoạn DNA trên plasmid

pET-His

Kết quả điện di cho thấy ở giếng 4 xuất hiện một vạch PCR có kích thước nằm giữa hai vạch thang 250bp và 500bp, ngang với vạch PCR của mẫu chứng dương

(giếng 3) Trong khi đó, với đối chứng âm là plasmid pET-His không mang gen fgf-2

nên không xuất hiện vạch (giếng 2, hình 3.4)

Bên cạnh đó, ở giếng 6, sản phẩm PCR khuẩn lạc bằng mồi T7promoter

/T7terminator cho sản phẩm PCR là một vạch nằm ở khoảng giữa vạch 500bp và 750bp của thang chuẩn, phù hợp với kích thước đoạn mang gen giữa hai mồi theo dự

đoán là 618bp Đây là kích thước của gen fgf2 (438bp) và một phần trình tự giữa hai

mồi trên vector Trong khi đó, sản phẩm PCR plasmid pET-His làm khuôn chỉ cho một

vạch có kích thước 180bp (giếng 5, hình 3.4) Như vậy, bước đầu chúng tôi đã sàng lọc được những khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 Những khuẩn lạc cho kết quả dương tính được tách plasmid, tiếp tục kiểm tra sự hiện diện của gen fgf2 bằng phương

pháp PCR plasmid và enzyme cắt hạn chế

3.1.5 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 bằng phương pháp PCR và

enzyme cắt giới hạn

Các thể biến nạp cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính được tiếp tục tách chiết thu nhận plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp SDS-kiềm Sau đó, các plasmid tái tổ

hợp pET-fgf2 được phân tích bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu

FGF2-F/FGF2-R, cặp mồi T7promoter/T7terminator và bằng enzyme cắt hạn chế Kết quả

kiểm tra được trình bày ở hình 3.5

Ở giếng thứ 3 (hình 3.5), xuất hiện một vạch có kích thước nằm giữa hai vạch thang 250bp và 500bp, tương ứng với kích thước gen fgf-2 được khuếch đại bằng mồi

đặc hiệu (438bp) Bên cạnh đó, sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp bằng cặp mồi

T7promoter/T7terminator cho một vạch có kích thước nằm giữa khoảng 500-700bp

tương ứng với tổng kích thước của gen fgf-2 (438bp) và một phần trình tự giữa hai mồi trên plasmid (giếng 5)

Hình 3.5 Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 bằng phương pháp

PCR và cắt hạn chế; giếng 1, Thang DNA 1kb; giếng 2, PCR plasmid pET-His với cặp mồi F/R; giếng 3, PCR plasmid pET-fgf2 bằng mồi

FGF2-F/FGF2-R; giếng 4, PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi MCS

T7promoter/T7terminator; giếng 5, PCR plasmid pET-fgf2 bằng cặp mồi

T7promoter/T7terminator; giếng 6, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2; giếng 7, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 cắt bằng enzyme EcoRI; giếng 8, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2

cắt bằng hai enzyme BamHI và NdeI

Đồng thời, plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 khi được cắt bằng EcoRI cho một vạch có

kích thước ngang với vạch thang 5000bp của thang chuẩn, chứng tỏ plasmid này đã

được chèn thêm một đoạn gen Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 khi được cắt bằng BamHI

và NdeI cho hai vạch tương ứng với kích thước plasmid pET-His (4636bp) và đoạn gen

fgf2 (438bp) được nối vào (giếng 8)

Các kết quả phân tích bằng phương pháp PCR và enzyme cắt giới hạn cho phép

kết luận chúng tôi có thể đã nối thành công gen fgf2 vào plasmid pET-His

3.1.6 Kiểm tra giải trình tự gen fgf2

Nhằm khẳng định độ chính xác về trình tự so với thiết kế ban đầu cũng như sự đồng khung dịch mã, các plasmid tái tổ hợp dự tuyển sau khi đã kiểm tra sự hiện diện

của gen fgf2 được tách chiết và gửi đi giải trình tự theo phương pháp Sanger cải tiến

trên máy Big DyeTM terminator (Macrogen, Hàn Quốc)

Kết quả giải trình tự gen fgf2 trên plasmid pET-fgf2 được so sánh với trình tự lý

thuyết bằng phần mềm Jellyfish Kết quả so sánh cho thấy gen đã được tạo dòng có độ tương đồng 100%với trình tự thiết kế và đồng khung dịch mã với bộ ba khởi đầu trên

vector Ngoài ra, khi so sánh với vector tái tổ hợp mang gen fgf2 trước đây [2] cho thấy

có sự thay thế các cystein thành các acid amin khác, đúng với kết quả thiết kế ban đầu Tuy nhiên, do kết quả của luận văn sẽ được tiếp tục sử dụng cho các nghiên cứu sắp công bố tiếp theo nên các thông tin cụ thể về quá trình biến đổi không được trình bày trong khuôn khổ luận văn này

Như vậy, chúng tôi đã cấu trúc thành công plasmid pET-fgf2

3.2 Cấu trúc chủng E coli BL21(DE3) biểu hiện protein fgf-2

3.2.1 Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3)

Plasmid pET-fgf2 được tách chiết bằng phương pháp SDS-kiềm từ chủng E coli DH5α/pET-fgf2 được biến nạp vào chủng BL21(DE3) và sàng lọc trên môi trường

LB-Amp100

Hình 3.6 Kết quả biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3)

1, Đĩa đối chứng; 2, Đĩa biến nạp

Trên đĩa đối chứng (1), chúng tôi tiến hành trải những tế bào không mang

plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 Những tế bào này không có khả năng kháng kháng sinh,

nên không phát triển được trên môi trường LB-Amp, vì vậy không thấy xuất hiện khuẩn lạc trên đĩa (1) Ngược lại, trên đĩa biến nạp (2), những thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp nên có khả năng kháng kháng sinh, phát triển và tạo khuẩn lạc Sau đó, các khuẩn lạc này được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu FGF2-F/FGF2-R để sàng lọc những thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp mong muốn

3.2.2 Sàng lọc thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc

Các khuẩn lạc mọc được trên môi trường LB-Amp100 được chọn thực hiện kiểm

tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu FGF2-F/FGF2-R

Hình 3.7 Kết quả PCR khuẩn lạc tế bào E coli BL21(DE3) bằng cặp mồi

FGF2-F/FGF2-R; giếng 1, thang chuẩn 1kb; giếng 2, sản phẩm PCR plasmid pET-His; giếng

3, sản phẩm PCR plasmid pIDT-fgf2; giếng 4, sản phẩm PCR khuẩn lạc E coli BL21(DE3)

Kết quả điện di cho thấy ở giếng 2 không thấy xuất hiện vạch khuếch đại do

khuôn mẫu sử dụng là vector không mang gen fgf2, còn ở giếng 4 xuất hiện một vạch DNA có kích thước bằng với kích thước của mẫu chứng dương (giếng 3) Như vậy, chúng tôi đã biến nạp thành công pET-fgf2 vào chủng E coli BL21(DE3) Những khuẩn lạc cho kết quả dương tính E coli BL21(DE3)/pET-fgf2 này sẽ được sử dụng để

kiểm tra khả năng biểu hiện protein mục tiêu

3.3 Xác nhận sự biểu hiện của protein tái tổ hợp FGF-2 trong chủng BL21(DE3)

/pET-fgf2

Các dòng E coli mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 sẽ được nuôi cấy và cảm ứng

bằng IPTG để kiểm tra khả năng biểu hiện protein FGF-2 Kết quả kiểm tra sự biểu

hiện protein FGF-2 được trình bày trong hình 3.8

Hình 3.8 Kết quả điện di SDS-PAGE (A) và lai Western (B) xác nhận sự biểu hiện

FGF-2; 1, thang protein phân tử lượng thấp; 2, E coli BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(-);

3, E coli fgf2, IPTG(+) protein tổng số; 4, E coli

BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(+) thể vùi; 5, E coli BL21(DE3)/pET-BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(+) thể tan

Dựa vào kết quả điện di ta thấy ở giếng 2 tương ứng mẫu E coli BL21(DE3)/pET-fgf2 không được cảm ứng IPTG thì không xuất hiện vạch protein

mong muốn Giếng 3, 4, 5 là các mẫu protein tương ứng với protein tổng số, protein

trong thể vùi và protein hòa tan của chủng E coli BL21(DE3)/pET-fgf2 được cảm ứng

IPTG 0,3mM trong môi trường LB-Amp Kết quả cho thấy ở giếng 3 xuất hiện một vạch protein được biểu hiện vượt mức nằm giữa hai vạch kích thước của thang chuẩn

là 14,4kDa và 20,1kDa tương ứng với kích thước dự đoán của protein FGF-2 (18kDa) Kết quả phân tích dạng biểu hiện cho thấy, protein này chủ yếu biểu hiện ở dạng thể

tan (giếng 5) Đồng thời, kết quả lai Western cho thấy xuất hiện các vạch tín hiệu

tương ứng ở những vị trí vạch protein FGF-2 trên bản điện di SDS-PAGE Điều này

cho phép khẳng định vạch protein trong kết quả điện di là protein mục tiêu FGF-2

Như vậy có thể kết luận chúng tôi đã biểu hiện thành công protein FGF-2 ở dạng

3.4 Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan

3.4.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng

Quá trình lên men cảm ứng biểu hiện FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong chủng E coli

BL21(DE3)/pET-FGF được tiến hành bằng hệ thống lên men tự động trong vòng 24 giờ với chất cảm ứng là IPTG bổ sung ở giờ thứ 8 Sự tăng trưởng của chủng trong suốt quá trình lên men được theo dõi thông qua việc phân tích trọng lượng khô tế bào sau mỗi 2 giờ lên men Kết quả phân tích trọng lượng khô tế bào được trình bày trong

hình 3.9

Hình 3.9 Kết quả phân tích trọng lượng khô tế bào trong quá trình lên men Hình đại

diện cho ba lần thí nghiệm lặp lại

Dựa vào đồ thị cho thấy trọng lượng khô của tế bào tăng dần trong suốt quá trình lên men và ổn định ở những giờ cuối Điều này phù hợp với đặc trưng tăng trưởng của chủng, chứng tỏ sự xuất hiện của vector tái tổ hợp không làm thay đổi đặc tính sinh lý của chủng Theo kết quả phân tích trọng lượng khô tế bào, lượng tế bào khô thu nhận

được là 5,2 g/lít môi trường lên men Tuy nhiên, kết quả này chỉ mới là bước đầu lên men Do đó, cần có những khảo sát và phân tích sâu hơn để mang lại hiệu quả lên men cao nhất

3.4.2 Khảo sát sự biểu hiện protein FGF-2 theo thời gian cảm ứng

Trong quá trình lên men, chúng tôi tiến hành thu mẫu sau khi cảm ứng IPTG mỗi 2 giờ để theo dõi sự biểu hiện protein FGF-2 của chủng Sau đó, mẫu được xử lý và điện

di SDS-PAGE Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein pha tan trong suốt quá

trình lên men được trình bày trong hình 3.10

Hình 3.10 Hình điện di SDS-PAGE mẫu protein ở pha tan tại các thời điểm lên men

1, Thang protein phân tử lượng thấp; 2-10: lượng protein pha tan tương ứng từ BL21(DE3)/pET-FGF sau 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 giờ lên men

Tại thời điểm giờ lên men thứ 8, chất cảm ứng IPTG được bổ sung và protein mục

tiêu bắt đầu được tạo thành Do đó, ở giờ nuôi cấy thứ 8 (giếng 2) không có sự biểu

hiện của protein mục tiêu Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy bắt đầu từ giờ nuôi cấy

dạng tan trong chủng, chúng tôi tiến hành định lượng bằng phần mềm Quantity One

(Biorad) Kết quả định lượng này được trình bày trong bảng 3.1 và phụ lục 2

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy phần trăm tỉ lệ protein FGF-2 trong pha tan tăng trong

suốt quá trình lên men Tỉ lệ này đạt cao nhất ở giờ thứ 24, lượng FGF-2 chiếm 10,9% lượng protein tổng Tuy nhiên, kết quả cho thấy chủng biểu hiện không ổn định, lượng protein mục tiêu không tăng đều theo thời gian Do đó, cần phải có những khảo sát mở rộng nhằm đánh giá thời điểm dừng lên men để mang lại sản lượng cao nhất và chi phí sản xuất thấp nhất

Bảng 3.1 Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 trong pha

tan (%) sau mỗi 2 giờ lên men

Thời gian lên

men (giờ)

Thời gian sau cảm ứng (giờ)

Tỉ lệ FGF-2 trong pha tan (%)

3.4.3 Khảo sát chu kì phá tế bào bằng áp suất cao

Sau 24 giờ lên men, toàn bộ dịch lên men được ly tâm thu nhận sinh khối E coli

Sinh khối được phá tế bào bằng phương pháp đồng hóa dựa vào áp suất cao Nhằm đảm bảo lượng FGF-2 dạng tan có thể thu nhận được sau quá trình phá tế bào là cao nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát số chu kỳ phá mẫu Mẫu protein thể vùi và thể tan