Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế bacteriocin có tiềm năng kháng ung thư từ anaerotruncus colihominis và bacteroides vulgatus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - LƯU VĂN HƯỞNG TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ BACTERIOCIN CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ ANAEROTRUNCUS COLIHOMINIS VÀ BACTEROIDES VULGATUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - LƯU VĂN HƯỞNG TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ BACTERIOCIN CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ ANAEROTRUNCUS COLIHOMINIS VÀ BACTEROIDES VULGATUS LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành đào tạo: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 67/QĐ - ĐHNT ngày 24/01/2017 Quyết định thành lập Hội đồng: Ngày bảo vệ: 01/12/2018 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG PGS TS NGUYỄN VĂN DUY Chủ tịch Hội đồng: TS ĐẶNG THÚY BÌNH Phịng Đào tạo Sau đại học: KHÁNH HÒA - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tôi, thực hướng dẫn, giúp đỡ người hướng dẫn khoa học Các kết quả, số liệu nêu nghiên cứu trung thực, chưa cơng bố cơng trình Kết nghiên cứu luận văn thực khuôn khổ đào tạo sau đại học Đề tài “Sàng lọc phân tử bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ khu hệ vi sinh vật người cách tiếp cận tin sinh học sinh học phân tử” (mã số 106-YS.04-2014.40) PGS TS Nguyễn Văn Duy làm chủ nhiệm Quỹ Phát triển Khoa học Cơng nghệ Quốc gia tài trợ kinh phí Khánh Hòa, tháng 07 năm 2019 Tác giả Lưu Văn Hưởng iii LỜI CẢM ƠN Trước hết xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại học Nha Trang, lãnh đạo phòng Đào tạo Sau đại học kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu Trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc xin dành cho thầy cô PGS TS Phan Thị Phượng Trang, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐH Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh PGS.TS Nguyễn Văn Duy, Trường Đại học Nha Trang tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên tơi suốt trình thực luận văn Đặc biệt, tơi xin ghi tâm tình cảm, giúp đỡ cán Trung tâm Khoa học Công nghệ sinh học thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, gia đình bạn bè thân thiết giúp đỡ, chia sẻ tơi q trình nghiên cứu Khánh Hòa, tháng 07 năm 2019 Tác giả Lưu Văn Hưởng iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN III LỜI CẢM ƠN IV MỤC LỤC V DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT VII DANH MỤC CÁC BẢNG VIII DANH MỤC CÁC HÌNH IX TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .X TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .X MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bacteriocin 1.1.1 Tầm quan trọng ứng dụng bacteriocin .4 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cơ chế tác động bacteriocin 1.1.4 Một số bacteriocin có hoạt tính kháng ung thư .6 1.2 Tình hình nghiên cứu bacteriocin có tiềm kháng ung thư .10 1.2.1 Trên giới 10 1.2.2 Tình hình nghiên cứu bacteriocin Việt Nam 11 1.3 Các peptit kháng ung thư tiềm từ Anaerotruncus colihominis Bacteroides vulgatus 12 1.4 Kỹ thuật protein tái tổ hợp 14 1.4.1 Kỹ thuật tạo dòng 14 1.4.2 Biểu gen tái tổ hợp E.coli 18 1.4.3 Hệ thống biểu protein tái tổ hợp 19 1.2 TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƯ 22 1.2.1 Tổng quan vấn đề ung thư 22 1.2.2 Các tác nhân gây ung thư 23 1.2.3 Các phương pháp điều trị ung thư .28 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu 32 2.1.1 Plasmit trình tự gen .32 2.1.2 Chủng vi sinh vật .33 v 2.1.3 Dụng cụ thiết bị sử dụng .34 2.1.4 Hóa chất mơi trường .35 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu 37 2.3.1 Phương pháp PCR .38 2.3.2 Điện di DNA gel agarose .38 2.3.3 Phương pháp tạo vector tái tổ hợp pAcazu9 pBvazu13 cho phép biểu protein Acazu9, Bvazu13 E.coli BL21 39 2.3.4 Tạo chủng E.coli mang vector pAcazu9 pBvazu13 kiểm tra biểu protein tái tổ hợp .41 2.3.5 Điện di protein SDS-PAGE 41 2.3.6 Tinh chế protein Acazu9 Bvazu13 cột HisTrap 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Tạo vector tái tổ hợp pAcazu9 pBvazu13 cho phép biểu protein Acazu9 Bvazu13 E.coli BL21 46 3.1.1 Thu nhận gen acazu9 bvazu13 kỹ thuật PCR 46 3.1.2 Tạo vector tái tổ hợp pAcazu9, pBvazu13 sàng lọc tế bào chứa gen mục tiêu PCR khuẩn lạc .47 3.1.3 Xác định trình tự gen mục tiêu vector tái tổ hợp phương pháp giải trình tự 52 3.2 Tạo chủng E.coli BL21 mang plasmit pBvazu13 kiểm tra khả biểu protein dung hợp 55 3.3 Biểu tinh chế protein Bvazu13 E.coli BL21 56 3.3.1 Khảo sát điều kiện biểu protein Bvazu13 E.coli BL21 56 3.3.2 Kiểm tra tính tan protein tái tổ hợp Bvazu13 .58 3.3.3 Tinh chế protein Bvazu13 dung hợp chứa đuôi His 59 3.4 Biểu tinh chế protein Acazu9 E.coli BL21 61 3.5 Thu nhận protein mục tiêu TEV protease 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .65 KẾT LUẬN 65 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO .66 PHỤ LỤC vi DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphat bp base pair CS Cộng dH2O distilled water (nước cất) DNA Deoxyribose Nucleic Acid dNTP deoxyNucleotide TriPhosphate DTT Dithiothreitol E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid His Histidine IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactoside kDa kilo Dalton Kan Kanamycin LB Môi trường Luria-Bertani LLO Listeriolysin O LysSN Vùng đầu N protein LysS MCS Multiple Cloning Site mRNA Messenger RNA NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribose Nucleic Acid rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate polyacrymide TEA Tris – Acetate - EDTA tRNA Transfer Ribonucleic Acid vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các bacteriocin có hoạt tính chống lại dòng tế bào ung thư khác Bảng 1.2 Tỷ lệ kỵ nước Acazu9 Bvazu13 giống azurin giả định .12 Bảng 1.3 Trình tự gen, axít amin kích thước Acazu9 Bvazu13 13 Bảng 1.4 Trình tự nhận biết số enzyme cắt giới hạn tiêu biểu .16 Bảng 1.5 Các dạng ví dụ chất gây ung thư người 24 Bảng 1.6 Phân loại các tác nhân gây ung thư người theo WHO/IARC 25 Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng .33 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng cắt protein dung hợp Acazu9/Bvazu13 45 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ gen acazu9 bvazu13 47 Bảng 3.2 Kết đo nồng độ mức độ tinh plasmid tái tổ hợp 52 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế tác động lớp Hình 1.2 Mơ hình tương tác bacteriocin Acazu9 (p2seq05) từ Anaerotruncus colihominis 13 Hình 1.3 Hoạt động phiên mã xảy tế bào chủ tác động chất cảm ứng IPTG 21 Hình 1.4 Cơ chế cảm ứng lac operater IPTG 22 Hình 2.1 Sơ đồ plasmit pET-42a(+) 32 Hình 2.2 Thang chuẩn DNA .35 Hình 2.3 Thang chuẩn protein 36 Hình 2.4 Tóm tắt quy trình thu nhận protein Acazu9/Bvazu16 tinh sau cắt loại bỏ đuôi dung hợp 45 Hình 3.1 Kết thu nhận gen acazu9 bvazu13 phản ứng PCR 46 Hình 3.2 Sơ đồ vector pAcazu9 47 Hình 3.3 Sơ đồ vector pBvazu13 47 Hình 3.4 Kết biến nạp pAcazu9 vào E.coli OmniMAX .48 Hình 3.5 Kết biến nạp pBvazu13 vào E.coli OmniMAX 49 Hình 3.6 Sơ đồ vị trí bám mồi lên gen mục tiêu 49 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc gel agarose 2% 51 Hình 3.8 Kết giải trình tự đoạn gen acazu9 vector pAcazu9 .53 Hình 3.9 Kết giải trình tự đoạn gen bvazu13 vector pBvazu13 54 Hình 3.10 Kết biến nạp plasmit pBvazu13 vào E.coli BL21 (DE3) .55 Hình 3.11 Kết SDS-PAGE kiểm tra khả biểu protein dung hợp mục tiêu chủng E.coli BL21 mang vector pBvazu13 56 Hình 3.12 Kết biểu protein Bvazu13 E.coli BL21 .57 Hình 3.13 Kết kiểm tra tính tan protein Bvazu13 E.coli BL21 .58 Hình 3.14 Kết tinh chế protein tái tổ hợp Bvazu13 cột HisTrap 60 Hình 3.15 Kết biểu protein tái tổ hợp Acazu9 E.coli 61 Hình 3.16 Kết tinh chế protein Acazu9 dung hợp cột HisTrap 62 Hình 3.17 Kết cắt loại dung hợp TEV protease 63 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Ung thư bệnh gây tử vong cao số bệnh không truyền nhiễm Các phương pháp điều trị ung thư chủ yếu phẫu thuật, hóa trị xạ trị, thực tế phương pháp cho thấy hiệu chữa bệnh không cao thường để lại nhiều hậu cho người bệnh Phương pháp tiếp cận điều trị cần nhắm đến mục tiêu tế bào ung thư mà không gây tác động xấu đến tế bào bình thường Một phương pháp điều trị sử dụng bacteriocin Sử dụng bacteriocin điều trị ung thư có ưu điểm là, chúng có khả gây độc làm chết tế bào ung thư cách có chọn lọc, chúng khơng gây ảnh hưởng xấu cho tế bào khỏe mạnh khác thể Điều mở hướng việc chữa bệnh ung thư người Mục tiêu nghiên cứu đặt luận văn tạo dịng, biểu tinh chế bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ Anaerotruncus colihominis Bacteroides vulgatus nhằm cung cấp thêm liệu khoa học phục vụ cho nghiên cứu đánh giá tính kháng lại tế bào ung thư, từ hướng đến điều chế, sản xuất thuốc đặc trị ung thư mang lại hiệu cao, an toàn chữa bệnh người Kết nghiên cứu tạo hai vector tái tổ hợp mang gen acazu9 (p2seq05) từ vi khuẩn Anaerotruncus colihominis DSM 17241 gen bvazu13 (p3seq17) từ Bacteroides vulgatus PC510, biểu protein mục tiêu E.coli BL21 (DE3) sử dụng hệ thống biểu pET- 42 a(+), đồng thời thu nhận thành công protein Acazu9 Bvazu13 dạng dung hợp cột HisTrap Các kết cụ thể sau: Tạo vector pAcazu9 mang gen acazu9 pBvazu13 có chứa gen bvau13 mã hóa cho protein dung hợp Acazu9 Bvazu13 Tạo chủng E.coli BL21 (DE3) mang vector tạo dòng Biểu protein Acazu9 Bvazu13 dung hợp vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) với nồng độ chất cảm ứng sử dụng từ 0,01-1 mM IPTG 30○C, 37○C từ 0,05-1 mM IPTG 23○C Điều kiện thích hợp để protein mục tiêu biểu dạng tan cảm ứng IPTG với nồng độ 0,5 mM 23○C Thu nhận protein Acazu9 Bvazu13 dung hợp cột tinh chế HisTrap Tuy nhiên chưa cắt đuôi dung hợp GST-His khỏi protein mục tiêu Từ khóa: Bacteriocin, kháng ung thư, protein tái tổ hợp, Acazu9, Bvazu13 x phân đoạn dung ly điện di gel SDS – PAGE để kiểm tra khả bám cột Ni2+ protein mục tiêu, tìm nồng độ Imidazole dung dịch dung ly thích hợp cho việc thu nhận lại protein mục tiêu Sau sử dụng phương pháp thẩm tách nhằm giảm nồng độ Imidazole khỏi dịch protein thu Kết thu nhận protein dung hợp Bvazu13 thể Hình 3.14 Bvazu13 Hình 3.14 Kết tinh chế protein tái tổ hợp Bvazu13 cột HisTrap M: Thang protein; Tổng: Protein tổng số trước nạp cột; 50,100, 150: Các phân đoạn dung ly với nồng độ Imidazole 50, 100 150 Mm Từ kết điện di hình 3.14 cho thấy, so sánh với phân đoạn protein trước cột (dịch protein tổng) chứng (-) (dung dịch sau cột) có xuất vạch protein với kích thước 40kDa phù hợp với kích thước protein N-GST-6xHis TEV siteBvazu13-C dịch trước cột sau qua cột vạch protein cịn diện phân đoạn sau cột có phần hơn, chứng tỏ protein có bám lên cột với lượng thấp Đồng thời, có xuất protein phân đoạn dung ly nồng độ Imidazole 50 mM, 100mM 150 mM Tuy nhiên, lượng protein diện không lớn lẫn với protein khác tế bào Có thể cấu 60 trúc bậc làm che lấp phần đuôi lực làm protein bám không tốt cột Sau protein bám lên cột bị biến tính tủa cột Như vậy, protein mục tiêu Bvazu13 thu nhận cột HisTrap Protein qua màng thẩm tách để loại Imidazole đổi buffer cho mục đích lưu trữ đánh giá hoạt tính sau 3.4 Biểu tinh chế protein Acazu9 E.coli BL21 Tương tự phương pháp thu nhận protein Bvazu13, protein dung hợp Acazu9 kiểm tra biểu cảm ứng IPTG chủng vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) với điều kiện tương tự gồm nhiệt độ nuôi cấy 23○C, nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM IPTG thời gian thu mẫu 10 sau cảm ứng Kết kiểm tra biểu protein Acazu9 thể Hình 3.15 cho thấy: so với chứng âm (giếng 1) có xuất vạch đậm có kích thước khoảng 54 kDa (giếng 2) phù hợp với kích thước dự đốn lý thuyết protein Chứng âm chủng E.coli BL21 (DE3) không mang vector tái tổ hợp nên cảm ứng với 0,5 mM IPTG khơng có vạch mục tiêu Như vậy, chủng E.coli BL21 (DE3)/pAcazu9 có biểu protein mục tiêu cảm ứng IPTG Do đó, biểu protein với thể tích lớn (2000 ml) để tinh chế thu nhận protein mục tiêu Acazu9 Hình 3.15 Kết biểu protein tái tổ hợp Acazu9 E.coli M: Thang protein; 1: E.coli BL21 (DE3)/0,5 mM IPTG, 2: E.coli BL21 (DE3)/pAcazu9/0,5 mM IPTG 61 Sinh khối sau cảm ứng biểu IPTG tiến hành bước tương tự Bvazu13 để thu nhận protein mục tiêu Protein dung hợp Acazu9 có trình tự xếp sau: N-GST-6xHis TEV site-Acazu9-C, sử dụng cột HisTrap để tinh chế protein dung hợp Kết điện di gel SDS-PAGE thể Hình 3.16 Hình 3.16 Kết tinh chế protein Acazu9 dung hợp cột HisTrap M: Thang protein; (-): E.coli BL21 (DE3)/0,5 mM IPTG; Tổng: Protein tổng số trước nạp cột; 100, 200: Phân đoạn dung ly với nồng độ Imidazole 100 200 mM Từ kết phân tích Hình 3.16 cho thấy: so với chứng âm giếng khơng cảm ứng IPTG giếng tổng có vạch protein mục tiêu chứng tỏ có biểu protein mục tiêu cảm ứng Protein mục tiêu dung ly khỏi cột với nồng độ Imidazole 100 200 mM (giếng 1, giếng 2) với kích thước khoảng 54 kDa, nhung cịn lẫn protein khác Như vậy, thu nhận protein Acazu9 dung hợp cột HisTrap Các protein Acazu9 Bvazu13 dung hợp sau tinh chế cịn chứa tinh chế nên khơng thuận lợi cho q trình đánh giá hoạt tính chức protein bước Do cần phải tiến hành loại bỏ đuôi tinh chế khỏi protein dung hợp 62 3.5 Thu nhận protein mục tiêu TEV protease Các protein Acazu9 Bvazu13 cịn chứa dung hợp sau tinh chế Các có ưu điểm giúp trình thu nhận protein mục tiêu dễ dàng số protein hoạt tính tinh chế gây ảnh hưởng xấu đến trình đánh giá hoạt tính Do cần loại bỏ đuôi tinh chế khỏi protein mục tiêu để trình đánh giá hoạt tính chức protein xác Protein dung hợp Acazu9 Bvazu13 thiết kế với tinh chế GST-6xHis có chứa vị trí nhận diện enzyme cắt TEV protease nên sử dụng enzyme để loại bỏ đuôi tinh chế khỏi protein mục tiêu Kết sau cắt TEV protease thể Hình 3.17 Phân tích kết cắt TEV protease từ gel SDS-PAGE cho thấy: chứng dương protein chất LysSN-TEVsite-LLO có chứa vị trí nhận diện TEV protease nhằm xác định enzyme TEV sử dụng phản ứng cắt có hoạt tính Kết phân đoạn trước cắt sau cắt chứng dương có khác biệt rõ rệt Cụ thể, so với giếng trước cắt (kích thước khoảng 76 kDa) giếng sau cắt có xuất hai vạch đậm có kích thước nhỏ khoảng 57 kDa (LLO) 19 kDa (LysSN) Điều chứng tỏ TEV protease sử dụng phản ứng cắt có hoạt tính tốt Tuy nhiên sử dụng TEV protease để loại bỏ đuôi tinh chế cho protein Acazu9 Bvazu13 khơng thấy có thay đổi kích thước protein mẫu trước cắt sau cắt Điều có nghĩa TEV protease khơng cắt LysSN-LLO LLO LysSN Hình 3.17 Kết cắt loại đuôi dung hợp TEV protease BC: Phân đoạn trước cắt, AC: Phân đoạn sau cắt, LysSN-LLO protein đối chứng dương có mang trình tự nhận biết TEV 63 Kết lý giải TEV protease khơng nhận diện vị trí gắn lên protein Acazu9, Bvazu13 dung hợp Nguyên nhân khơng bám lên protein chất trình gấp cuộn Acazu9 Bvazu13 dung hợp gấp vị trí nhận diện TEV protease vào làm che khuất vị trí nhận diện enzyme Vì vậy, TEV protease khơng nhận diện gắn lên protein mục tiêu nên khơng có khả cắt Từ kết phân tích cho thấy thu nhận protein Acazu9 Bvazu13 dung hợp từ vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) Tuy nhiên, chưa cắt rời đuôi tinh chế khỏi protein mục tiêu Kết việc biểu hai protein màng Acazu9 Bvazu13 hệ thống biểu pET-42a(+) vi khuẩn E.coliBL21 (DE3) có hiệu khơng cao chủng chủ biểu protein mục tiêu dung hợp điều kiện nhiệt độ thấp biểu khơng nhiều Bên cạnh vi khuẩn tổng hợp hình thành cấu trúc protein dung hợp che khuất vị trí gắn lên TEV protease nên không loại đuôi tinh chế Do đó, cần phải thay đổi hệ thống biểu thay đổi chủng chủ biểu để thu nhận protein mục tiêu tốt loại bỏ đuôi dung hợp nhằm phát triển định hướng cho nghiên cứu 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Kết nghiên cứu tạo hai vector tái tổ hợp mang gen acazu9 (p2seq05) từ vi khuẩn Anaerotruncus colihominis DSM 17241 gen bvazu13 (p3seq17) từ Bacteroides vulgatus PC510, biểu protein mục tiêu E.coli BL21 (DE3) sử dụng hệ thống biểu pET-42a(+), đồng thời thu nhận thành công protein Acazu9 Bvazu13 dạng dung hợp cột HisTrap Các kết cụ thể sau: Tạo vector pAcazu9 mang gen acazu9 pBvazu13 có chứa gen bvau13 mã hóa cho protein dung hợp Acazu9 Bvazu13 Tạo chủng E.coli BL21 (DE3) mang vector tạo dòng Biểu protein Acazu9 Bvazu13 dung hợp vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) với nồng độ chất cảm ứng sử dụng từ 0,01-1 mM IPTG 30○C, 37○C từ 0,05-1 mM IPTG 23○C Điều kiện thích hợp để protein mục tiêu biểu dạng tan cảm ứng IPTG với nồng độ 0,5 mM 23○C Thu nhận protein Acazu9 Bvazu13 dung hợp cột tinh chế HisTrap Tuy nhiên chưa cắt đuôi dung hợp GST-His khỏi protein mục tiêu KIẾN NGHỊ Kết nghiên cứu cho thấy thu nhận protein dung hợp Acazu9 Bvazu13 E.coli BL21(DE3) Tuy nhiên, để tiếp tục phát triển theo định hướng nghiên cứu hoàn thiện kết hơn, cần tiến hành thêm thí nghiệm sau: 1) Khảo sát biểu tính tan protein Acazu9 Bvazu13 từ vector pAcazu9 pBvazu13 hệ thống biểu khác Bacillus subtilis nấm men 2) Hồn thiện quy trình tinh chế để thu nhận lượng protein mục tiêu hiệu 3) Đánh giá hoạt tính protein Acazu9 Bvazu13 tế bào ung thư 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy, 2002 Nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacterioxin lồi Lactobacillus plantarum L24, Tạp chí Di truyền học Ứng dụng, Hội Di truyền học Việt Nam Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An, 2008 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactococcus lactis có hoạt tính bacteriocin cao để kết hợp với màng cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose-BC) ứng dụng bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu Tạp chí KH&CN Trường Đại học Kỹ Thuật Nguyễn Văn Kình, Nguyễn Tuấn Anh, 2015 Sinh học phân tử ung thư áp dụng cho lâm sàng, NXB Y học Hà Nội Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung, 2010 Giáo trình Cơng nghệ DNA tái tổ hợp, NXB ĐHQG TP Hồ Chí Minh Nguyễn Minh Trí, 2016, Nghiên cứu vector biểu sáp nhập vào gen Bacillus subtilis locus amye cảm ứng iptg sử dụng romoter Pgrac Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Lê Thị Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh, 2004 Một số đặc tính bacteriocin sản xuất vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Báo cáo Khoa học, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Tài liệu Tiếng Anh Balbás P., Lorence A 2012, Recombinant Gene Expression: reviews and protocol, 3rd edition, Humana Press Chakrabarty A M., Bernardes N and Fialho A M 2014, “Bacterial proteins and peptits in cancer therapy”, Bioengineered, 5(4), Pp 234–242 Cornut G., Fortin C and Soulieres D 2008, “Antineoplastic properties of bacteriocins: revisiting potential active agents”, Am J Clin Oncol, 31(4), Pp 399-404 Cornut G., Fortin C and Soulieres D 2008 “ Antineoplastic properties of bacteriocins: revisiting potential active agents”, Am J Clin Oncol., 31, Pp 344–404 Cotter P D., Hill C and Ross R P 2005, “Bacteriocins: developing innate immunity for food”, Nat Rev Microbiol., 3, Pp 777–788 Cursino L., Smarda J., Chartone-Souza E and Nascimento A M A (2002), “Recent updated aspects of colicins of Enterobacteriaceae”, Braz J Microbiol., 33, Pp 185–195 66 Farkas-Himsley H and Cheung R 1976, “Bacterial proteinaceous products (bacteriocins) as cytotoxic agents of neoplasia”, Cancer Res., 36, Pp 3561–3567 Grandis V., Bizzarri A R and Cannistraro S 2007, “Docking study and free energy simulation of the complex between p53 DNA-binding domain and azurin”, J Mol Recognit, 20, Pp 215-226 Hanahan D and Weinberg R A 2011, “The hallmarks of cancer: the next Generation”, Cell, 144, Pp 646–673 10 Hetz C., Bono M R., Barros L F and Lagos R 2002, “Microcin E492, a channel-forming bacteriocin from Klebsiella pneumoniae, induces apoptosis in some human cell lines”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(5), Pp 2696-2701 11 Imajoh S., Ohno-Iwashita Y and Imahori K 1982, “The receptor for colicin E3 Isolation and some properties”, J Biol Chem., 257, Pp 6481–6487 12 Jacob F (1954) Biosynthèse induite et mode d’action d’une pyocin, antibiotique de Pseudomonas pyocyanea Annals Inst Pasteur 86, 149–160 13 James R., Kleanthous C and Moore G R 1996, “The biology of E colicins: paradigms and paradoxes”, Microbiology, 142, Pp 1569–1580 14 Kaur, Sumanpreet and Kaur, Sukhraj 2015, “Bacteriocins as Potential Anticancer Agents”, Fronties Pharmacology, 6, Pp 1-11 15 Kawai Y., Kemperman R., Kok J and Saito T 2004, “The circular bacteriocins: gassericin A and circularin A”, Curr Protein Pept Sci., 5, Pp 393–398 16 Kumar B., Kaur B., Balgir P P and Garg N 2011, “Cloning and expression of bacteriocins of Pediococcus spp”, Arch Clin Microbiol., 2, Pp 1–18 17 Lagos R., Wilkens M., Vergara C., Cecchi X and Monasterio O 1993, “Microcin E492 forms ion channels in phospholipid bilayer membranes”, FEBS Lett., 321, Pp 145–148 18 Lorenzo V 1984, “Isolation and characterization of microcin E492 from Klebsiella pneumoniae”, Arch Microbiol, 139, Pp 72–75 19 Lorenzo V and Pugsley A P 1985, “Microcin E492, a low-molecular-weight peptit antibiotic which causes depolarization of the Escherichia coli cytoplasmic membrane Antimicrob”, Agents Chemother, 27, Pp 666–669 20 Michel-Briand Y., Baysse C 2002 The pyocins of Pseudomonas aeruginosa Biochimie 84, 499–510 10.1016/S0300-9084(02)01422-0 67 21 Nguyen C and Nguyen V D 2016, “Discovery of azurin-like anticancer bacteriocins from human gut microbiome through homology modeling and molecular docking against the tumor suppressor p53”, Biomed Research International, 8, Pp 482-490 22 Nguyen V D., Nguyen H H C 2015, “Molecular screening of Azurin-like anticancer bacteriocins from human gut microflora using bioinformatics”, Advances in Intelligent Systems and Computing, 358, Pp 219-229 23 Nguyen V D and Nguyen H H C 2015, “Molecular screening of Azurin-like anticancer bacteriocins from human gut microfora using bioinformatics”, Advances in Intelligent Systems and Computing, 358, Pp 219-229 24 Raguz S and Yagüe E 2008, (Resistance to chemotherapy: new treatments and novel insights into an old problem”, Brit J Cancer, 99, Pp 387–391 25 Gratia, A 1925 Sur un remarquable example d’antagonisme entre deux souches de colibacille Compt Rend Soc Biol 93, 1040-1042 26 Glick B R., Pasternark J J., 2007 Molecular Biotechnology – Principle and Applications og Recombinant DNA 27 Raf Callewaert and Luc De Vuysy, 1999, Expanded bed adsorption as a unique unit operation for the isolation of bacteriocins from fermentation media 28 Riley M A 2009, “Bacteriocins, Biology, Ecology, and Evolution In: Schaechter M (edi.)”, Encyclopedia of Microbiology, Oxford: Elsevier, Pp 32-44 29 Sahl H G and Bierbaum G 1998, “Lantibiotics: biosynthesis and biological activities of uniquely modified peptits from gram-positive bacteria”, Ann Rev Microbiol, 52, Pp 41–79 30 Sand S L., Nissen-Meyer J., Sand O and Haug T M 2013, “Plantaricin, A, a cationic peptit produced by Lactobacillus plantarum, permeabilizes eukaryotic cell membranes by a mechanism dependent on negative surface charge linked to glycosylated membrane proteins”, Biochim Biophys Acta, 1828(2), Pp 249-259 31 .Todorov D S., Vaz-Velho M., Gibbs P 2004, "Comparison of two methods for purification ofplantaricin ST31, a bacteriocinproduced byLactobacillusplantarum ST31", Brazilian Journal of Microbiology, 35(1 - 2), pp 157-160 32 Todorov S D., Dicks L M 2007, "Bacteriocin production by Lactobacillus pentosus ST712BZ isolated from boza", Braz J Microbiol, 38 (1), pp 1678 - 4405 33 Vesterlund S., Paltta J., Lauková A., Karp M and Ouwehand A C 2004, “Rapid screening method for the detection of antimicrobial substances”, J Microbiol Methods, 57(1), Pp 23-31 68 PHỤ LỤC Phục lục Kết giải trình tự gen Acazu9 plasmit pAcazu9 Phục lục 2: Kết giải trình tự gen Bvazu13 plasmit pBvazu13 Phụ lục 3: Thành phần môi trường a Môi trường LB (1000 ml) Thành Phần Khối lượng (g) Trypton 10 NaCl Yeast extract b Dung dịch nạp mẫu 6X Thành phần Thể tích Bromophenol blue 1% 12,5 µl Xylene cyanol FF 1% 12,5 µl Glycerol 15 ml c Dung dịch điện di DNA TAE 50X Thành phần Thể tích Tris base 242 g Glacial acetic axít 57,1 ml EDTA pH 8; 0,5 M 100 ml dH2O đủ 1000 ml d Gel agarose 2% Thành phần Thể tích Agarose 1g TAE 1X 10 ml Đun sơi agarose tan hoàn toàn, chờ nguội đến khoảng 55-60○C thêm 2,5 µl SafeView 10.000X vào Sau đảo đổ vào khay lắp sẵn lược Để nguội gel bóng tối e Dung dịch nạp mẫu SDS-PAGE 5X Thành phần Tỷ lệ, khối lượng Tris-HCl pH 6,8 0,5 M 250 mM SDS 10% Glycerol 30% DTT 500 mM Bromophenol blue 0,02% f Dung dịch điện di SDS-PAGE 1X Thành phần Khối lượng Tris base 25 mM Glycine 192 mM SDS 0,1% g Thành phần gel polyacrylamide cho điện di SDS-PAGE Thành phần Gel gom Gel phân tách Acrylamide/Bis-acrylamide 29:1 4% 12% Tris-HCl pH 6,8 0,5 M 125 mM Tris-HCl pH 8,8 M 375 mM SDS 10% 0,1% 0,1% APS 0,07% 0,07% TEMED 0,1% 0,1% h Dung dịch nhuộm gel SDS-PAGE Thành phần Tỷ lệ Axít acetic 50% Ethanol 25% Coomassie Brilliant Blue 0,5% i Dung dịch EBW (equilibration-lysis-wash) Thành phần Khối lượng Tris-HCl pH 8,0 M 30 mM NaCl M 500 mM Glycerol 100% 5% j Dung dịch dung ly Thành phần Khối lượng Tris-HCl pH 8,0 M 30 mM NaCl M 500 mM Glycerol 100% 5% Imidazole M thêm vào với nồng độ khác k Dung dịch bảo quản protein Thành phần Khối lượng Tris-HCl pH 8,0 M 30 mM NaCl M 300 mM Glycerol 20% l Thành phần phản ứng PCR thu gen Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Buffer (có Mg2+) 10X 10 µl dNTP mix (2 mM) 10 µl ON1461F (100 pmol/µl) 0,3 µl ON1462R (100 pmol/µl) 0,3 µl DNA khn (0,1 µg/µl) 1µl Pfu DNA polymerase µl dH2O 77,4 µl Tổng thể tích 100 m Thành phần phản ứng cắt Thành phần Thể tích (µl) DNA Tương ứng với µg DNA Tango Buffer 10X 20 BamHI (10 U/μl) EcoRI (10 U/μl) Nước cất đủ 100 n Thành phần phản ứng nối Thành phần Thể tích (µl) pET-42a(+) (200 ng/µl) 2,8 DNA mục tiêu (100 ng/µl) T4 buffer 10X T4 DNA ligase Nước cất vừa đủ 20 o Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc Thành phần Thể tích (µl) H2 O 39,2 µl dNTP (2 mM) µl Taq buffer 10X µl ON1793F (100 pmol/µl) 0,15 µl ON1794R (100 pmol/µl) 0,15 µl Taq DNA polymerase 0,5 µl Tổng thể tích 50 µl ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - LƯU VĂN HƯỞNG TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ BACTERIOCIN CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ ANAEROTRUNCUS COLIHOMINIS VÀ BACTEROIDES VULGATUS. .. việc chữa bệnh ung thư người Mục tiêu nghiên cứu đặt luận văn tạo dòng, biểu tinh chế bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ Anaerotruncus colihominis Bacteroides vulgatus nhằm cung cấp thêm liệu... điều trị bệnh ung thư người Từ đó, luận văn ? ?Tạo dịng, biểu tinh chế bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ Anaerotruncus colihominis Bacteroides vulgatus? ?? đặt nhằm cung cấp thêm liệu khoa học phục