Tách dòng và biểu hiện gen CNAZU8 (P2SEQ12) mã hóa bacteriocin có tiềm năng kháng ung thư từ clostridium nexile trong escherichia coli

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN CNAZU8 (P2SEQ12) MÃ HÓA BACTERIOCIN CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ Clostridium nexile Escherichia coli GVHD: TS Phạm Thu Thủy SVTH: Trần Thị Châu Loan MSSV: 54130760 Khánh Hòa, 07/2016 i LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học môi trường, Trường Đại học Nha Trang quan tâm bảo giảng dạy nhiệt tình giúp cho có kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Duy TS Phạm Thu Thủy, Viện Công nghệ sinh học môi trường định hướng, dìu dắt, tận tình hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn bạn lớp 54CNSH quan tâm giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, kiến thức suốt năm học Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, người quan tâm, giúp đỡ, động viên chỗ dựa tinh thần lớn giúp hoàn thành tốt công việc giao suốt thời học tập vừa qua Nha Trang, ngày 10 tháng 07 năm 2016 Sinh viên thực Trần Thị Châu Loan ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG .vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ung thư 1.1.1 Bản chất ung thư 1.1.2 Nguyên nhân ung thư 1.1.3 Phương pháp điều trị ung thư 1.2 Tổng quan bacteriocin kháng ung thư azurin 1.2.1 Tổng quan peptit kháng ung thư 1.2.2 Tổng quan bacteriocin kháng ung thư 10 1.2.3 Tổng quan azurin 11 1.3 Giới thiệu gen cnazu8 từ Clostridium nexile mã hóa bacteriocin kháng ung thư tương tự azurin 14 1.3.1 Clostridium nexile 14 1.3.2 Gen cnazu8 (p2seq12) 14 1.4 Tổng quan tách dòng biểu gen 15 1.4.1 Tạo dòng gen 15 1.4.2 Biểu gen 20 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 23 iii 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 23 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23 2.2 Vật liệu 23 2.2.1 Plasmid 23 2.2.2 Chủng vi sinh vật môi trường nuôi cấy 23 2.2.3 Oligonucleotide đoạn gen tổng hợp 25 2.2.4 Enzym hóa chất sinh học phân tử 25 2.2.5 Dụng cụ thiết bị 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Thu đoạn gen đích phương pháp PCR 27 2.3.2 Điện di gel 30 2.3.3 Tinh sản phẩm PCR 33 2.3.4 Thực phản ứng cắt gen plasmid enzym cắt giới hạn 33 2.3.5 Phản ứng nối DNA tạo vector tái tổ hợp 35 2.3.6 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli OmniMAX khả biến 36 2.3.7 Tách chiết plasmid pDT008 37 2.3.9 Kiểm tra biểu protein Cnazu8 E coli BL21 39 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Thu nhận trình tự gen cnazu8 PCR 42 3.2 Thực phản ứng cắt mở vòng vecter pHT7048 44 3.3 Thực phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp 46 3.4 Biến nạp sản phẩm nối vào E coli OmniMAX 47 3.5 Sàng lọc dòng E coli OmniMAX mang vector mục tiêu 48 3.7 Khuếch đại đoạn DNA mang gen cnazu8 từ plasmid pDT008 để chuẩn bị giải trình tự 52 iv 3.8 Kết giải trình tự đoạn DNA mang gen cnazu8 53 3.9 Kiểm tra biểu Cnazu8 E coli BL21 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 65 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc Azurin 12 Hình 1.2 Mô hình gắn kết Azurin-p28 protein đích ung thư p53 13 Hình 1.3 Hình ảnh điện di SDS-PAGE 22 Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pET42a(+) 24 Hình 2.2 Sơ đồ cách tiếp cận tổng quát đề tài 28 Hình 2.3 Sản phẩm khuếch đại gen cnazu8 từ tổ hợp gen 29 Hình 2.4 Plasmid tái tổ hợp pDT008 (pET42a(+) + cnazu8) 37 Hình 2.5 Kết giải trình tự máy tự động 39 Hình 3.1 Sản phẩm khuếch đại gen cnazu8 42 Hình 3.2 Sản phẩm tinh gen cnazu8 44 Hình 3.3 Kết cắt mở vòng plasmid pET42a(+) 46 Hình 3.4 Khuẩn lạc E.coli OmniMAX mang vector tái tổ hợp pDT008 47 Hình 3.5 Sản phẩm khuếch đại gen từ khuẩn lạc E coli OmniMAX mang vector tái tổ hợp pDT008 50 Hình 3.6 Kết tách plasmid pDT008 51 Hình 3.7 Sản phẩm PCR đoạn DNA mang gen cnazu8 plasmid pDT008 53 Hình 3.8 Kết giải trình tự đoạn DNA mang gen cnazu8 plasmid pDT008.3 54 Hình 3.9 Kết khuẩn lạc E.coli BL21 mang plasmid pDT008 56 Hình 3.10 Kết điện di protein tái tổ hợp 56 vi DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Peptit kháng ung thư hoạt tính chống ung thư Bảng 1.2 So sánh đặc điểm protein Cnazu8 với azurin laz 16 Bảng 1.3 Một số loại vector phổ biến 19 Bảng 2.1 Trình tự mồi PCR gen cnazu8 25 Bảng 2.2 Nồng độ gel sử dụng điện di 31 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACP : Anticancer peptides APS : Ammonium Persulphate bp : Base pair (cặp bazơ) Cs : Cộng DNA : Deoxyribonucleic Acid EDTA : Disodium ethylenediamine tetraacetate GEM : Grafts experimental model ICL : Immortal cancer-cell lineage IPTG : Isopropyl-thiogalactoside kDa : Kilodalton LB : Luria Bertani Broth MSC : Multiple cloning site (Vùng cắt đa vị) PAGE : Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di polyacrylamide) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PEG : Polyethylene glycol PYG : Peptone-Yeast Extract-Glucose RE : Restriction enzyme (Enzym giới hạn) SDS : Sodium Dodecyl Sulphate TAE : Tris-acetate-EDTA TEMED : Tetramethylethylenediamine WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) LỜI MỞ ĐẦU Lý thực đề tài Ung thư bệnh nhắc đến nhiều giới gây tỉ lệ tử vong cao cho bệnh nhân mắc ung thư Cho đến ung thư vấn đề thời tính chất nguy hiểm Ước tính từ Cơ quan quốc tế Nghiên cứu Ung thư (IARC) cho thấy 12,7 triệu trường hợp ung thư 7,6 triệu ca tử vong ung thư xảy toàn giới năm 2008 (Ferlay cs, 2010 ) Năm 2012 có khoảng 14 triệu trường hợp 8,2 triệu ca tử vong liên quan đến bệnh ung thư (WHO, 2012) Số lượng ca ung thư tăng lên đến 22 triệu vòng hai thập kỷ Cho đến chưa có phương pháp điều trị ngăn chặn ung thư tái phát Phương pháp điều trị thường phẫu thuật để loại bỏ khối u sau xạ trị để tiêu diệt tế bào ung thư sót lại hóa trị liệu lâu dài nhằm ngăn chặn tế bào ung thư phát triển trở lại Trong biện pháp điều trị, hóa trị liệu gây tác động phụ tế bào bình thường dẫn tới tượng kháng thuốc tế bào ung thư cách sử dụng đường sinh trưởng khác bơm ngược để bơm thuốc Vì vậy, việc tìm kiếm liệu pháp điều trị cấp thiết Nhiều nghiên cứu trước rõ tiềm ứng dụng vi khuẩn nhiều lĩnh vực khác nông nghiệp, công nghiệp, thực phẩm… y học Gần đây, mô hình điều trị ung thư sử dụng vi khuẩn sống sản phẩm tinh từ chúng quan tâm trở lại Điều mở hướng điều trị bệnh hiểm nghèo Trong số sản phẩm từ vi khuẩn protein peptit quan tâm nhiều Bacteriocin chất kháng khuẩn có chất protein peptit, coi vũ khí vạn vi khuẩn chống lại vi khuẩn khác, hứa hẹn mang đến khả chữa trị ung thư thời điểm Vì hướng dẫn TS Phạm Thu Thủy, thực đề tài: “Tách dòng biểu gen cnazu8 (p2seq12) mã hóa bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ Clostridium nexile Escherichia coli” Các kết nghiên cứu từ đề tài cần thiết góp phần vào việc tìm loại thuốc chống ung thư để bảo vệ sức khỏe người Mục tiêu đề tài - Tách dòng gen cnazu8 (p2seq12) mã hóa bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ Clostridium nexile - Kiểm tra biểu gen cnazu8 (p2seq12) từ Clostridium nexile Escherichia coli Phạm vi nghiên cứu đề tài Gen cnazu8 (p2seq12) mã hóa bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ Clostridium nexile sàng lọc từ hệ vi sinh đường ruột người Ý nghĩa khoa học đề tài - Đây nghiên cứu tạo dòng biểu bacteriocin tương tự azurin có tiềm kháng ung thư - Kết đề tài làm sở cho nghiên cứu bacteriocin tiềm kháng ung thư tinh chế, thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư Ý nghĩa thực tiễn đề tài Nghiên cứu sở cho việc phát triển thuốc kháng ung thư hệ từ peptit vi khuẩn có tính chọn lọc cao hiệu ứng phụ thấp 54 Cnazu8-EcoRI-R GGCCTGTACAGAATTCTTAATCACTAATTCTGATTTGAATTTGGCAGAGAAATTTCTTCT cnazu8 Cnazu8(seq) cnazu8 -AATTCTTAATCACTAATTCTGATTTGAATTTGGCAGAGAAATTTCTTCT mã kết thúc cnazu8 60 49 61 TGTTCGAGACATAATAATAATCCTTCTTTCTGTAGTGTTTACAGTATATCAGATTCATGG 120 Cnazu8(seq) 50 TGTTCGAGACATAATAATAATCCTTCTTTCTGTAGTGTTTACAGTATATCAGATTCATGG 109 cnazu8 121 ATCCCTGGAAGTACAGGTTCTCACCCATGGACCCGCGTCCCTCAATACCGGAGCCACCAC 180 cnazu8 Cnazu8(seq) cnazu8 110 ATCCCTGGAAGTACAGGTTCTCACCCATGGACCCGCGTCCCTCAATACCGGAGCCACCAC 169 cnazu8-BamHI-F 181 CGGTACCCAGATCTGGGCTGTCCATGTGCTGGCGTTCGAATTTAGCAGCAGCGGTTTCTT 240 Cnazu8(seq) cnazu8 170 CGGTACCCAGATCTGGGCTGTCCATGTGCTGGCGTTCGAATTTAGCAGCAGCGGTTTCTT 229 241 TCATACCAATTGCAGTACTACCGCGTGGCACCAGACCCGCGGAGTGATGGTGATGGTGAT 300 Cnazu8(seq) cnazu8 230 TCATACCAATTGCAGTACTACCGCGTGGCACCAGACCCGCGGAGTGATGGTGATGGTGAT 289 301 GACCAGAACCACTAGTTGAACCATCCGATTTTGGAGGATGGTCGCCACCACCAAAC 356 Cnazu8(seq) 290 GACCAGAACCACTAGTTGAACCATCCGATTTTGGAGGATGGTCGCCACCACCAAAC 345 pDT005-F Hình 3.8 Kết giải trình tự đoạn DNA mang gen cnazu8 plasmid pDT008.3 Cnazu8: Trình tự đoạn DNA mang gen cnazu8 lý thuyết Cnazu8 (seq): Trình tự đoạn DNA mang gen cnazu8 plasmid pDT008.3 giải trình tự GGCCTGTA: Mồi để khuếch đại gen Kết xử lý trình tự (hình 3.8) cho thấy tương đồng 345 nu/356 nu trình tự đoạn DNA mang gen cnazu8 khuếch đại plasmid trình tự đoạn DNA mang cnazu8 lý thuyết Trình tự gen đoạn gửi giải trình tương đồng 100% so với trình tự gen cnazu8 lý thuyết Việc giải trình tự cặp mồi gắn đặc hiệu gen plasmid ( giải tình tự chiều) cho độ xác cao giải trình tự với mồi ( giải trình tự chiều) Trong trình tự gen cnazu8 plasmid có ba quy định mã kết thúc mã ba dự đoán lý thuyết Kết giả trình tự bị thiếu 11 nucleotit không ảnh hưởng đến trình biểu protein nucleotit nằm sau mã ba kết thúc Kết cho thấy đầy đủ xác trình tự mồi sử dụng phản ứng khuếch đại gen Mẫu DNA khuếch đại từ plasmid pDT008.1 sau tinh 55 thấy có vạch plasmid nên khó khăn việc giải trình tự Thêm đoạn DNA có nhiều TTT, CCC gây nhiễu tín hiệu huỳnh quang gối tín hiệu nên khó khăn cho việc nhận biết nucleotid Kết giải trình tự cho thấy dòng hóa thành công plasmid pDT008.3 E coli OmniMAX, sau tiến hành biểu protein Cnazu8 E coli BL21 3.9 Kiểm tra biểu Cnazu8 E coli BL21 Sau xử lý khẳng định plasmid pDT008.3 tạo dòng thành công, biến nạp plasmid pDT008.3 vào E coli BL21 để biểu gen Kết biến nạp plasmid pDT008 vào E coli BL21 thể hình 3.9 có khuẩn lạc E coli BL21 mọc môi trường LB có bổ sung kháng sinh kanmycine (30 µg/ml) Có đĩa môi trường lên khuẩn lạc E coli đĩa nuôi cấy Cũng tạo dòng E coli Ominmax plasmid pDT008 có chứa gen kháng lại kháng sinh kanamycine nên nhứng tế bào E coli BL21 biến nạp plasmid có khả phát triển môi trường có kháng sinh Hiệu suất biến nạp thấp so với nghiên cứu có sử dụng E.coli BL21 khả nạp để biểu gen, tế bào E coli BL21 khả nạp có thành tế bào bị biến đổi, mỏng so với tế bào bình thường nên thao tác làm ảnh hưởng đến khả sống tế bào Quá trình sốc nhiệt làm tế bào vi khuẩn bị giảm lượng sống sót, trình biến nạp plasmid không vào tế bào nên nuôi cấy môi trường có kháng sinh vi khuẩn không phát triển Hai khuẩn lạc chuyển qua nuôi tăng sinh môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycine (3mg/ml) qua đêm, sau đo độ đục môi trường nuôi hút 500 µl dịch vi khuẩn chuyển qua nuôi cảm ứng IPTG ml môi trường LB có bổ sung kháng sinh (3mg/ml) Sau chuyển khuẩn lạc qua môi trường LB có bổ sung kháng sinh kanmycine nuôi lắc qua đêm độ đục ống vi khuẩn đạt OD 0,8 chọn ống nuôi vi khuẩn khuẩn lạc số để tiếp tục nuôi cảm ứng IPTG thu protein cho điện di SDS-PAGE 56 Hình 3.9 Kết khuẩn lạc E.coli BL21 mang plasmid pDT008 46 kDa 30 kDa 23 kDa 17 kDa kDa Hình 3.10 Kết điện di protein tái tổ hợp Giếng 1: Marker, giếng 2: mẫu protein đối chứng, giếng 3: Mẫu protein cảm ứng giờ, giếng 4: Mẫu protein cảm ứng giờ, giếng 5: Mẫu protein cảm ứng giờ, giếng 6: Mẫu protein tan, giếng 7: Mẫu protein không tan Kết điện di protein (hình 3.10) cho thấy chưa có xuất protein Cnazu8 đây, kích thước dự đoán protein khoảng 36,7 kDa Trên gel 57 protein vi khuẩn đối chứng, mẫu cảm ứng qua thời gian protein Theo lý thuyết có cảm ứng IPTG trình tạo prorein xảy mạnh mẽ E coli gen Lac represor bị bất hoạt promoter hoạt hóa, trình phiên mã dịch mã tạo protein tái tổ hợp Thêm vào E coli BL21có vùng gen T7 RNA polymerase có khả tổng hợp RNA cao nên trình tạo protein tốt điều kiện nuôi cấy thích hợp Theo nghiên cứu tạo dòng biểu gen chazu5 (Nguyễn Văn Duy, 2016) biểu gen nồng độ IPTG 0,1 mM 37ºC có thấy vạch protein dạng không tan kết biều protein Cnazu8 lại không thấy có Lý lượng tế bào có chứa plasmid tái tổ hợp ít, trình biến nạp chưa thành công nên cảm ứng IPTG protein vi khuẩn E coli BL21 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã dòng hóa thành công plasmid tái tổ hợp pDT008 mang gen cnazu8 E coli OminiMax Kết tách dòng xác nhận phương pháp giải trình tự gen Kết kiểm tra biểu gen cnazu8 tế bào E coli BL21 thu khuẩn lạc nghi mang plasmid tái tổ hợp pDT008 chưa thu băng protein Cnazu8 mong muốn điện di SDS-PAGE Kiến nghị Nghiên cứu nâng cao hiệu suất biến nạp vào vi khuẩn cách kiểm tra mức độ khả biến tế bào E coli thay đổi điều kiện biến nạp nuôi cấy sau Nghiên cứu điều kiện tối ưu để biểu gen cnazu8 E coli BL21 phải thay đổi tế bào vật chủ biểu 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Văn Duy (2016), Tạo dòng biểu bacteriocin Chazu5 tương tự azurin kháng ung thư Escherichia coli, Kỷ yếu hội nghị khoa học nghiên cứu giảng dạy sinh học Việt Nam (2), Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội, 955-962 Nguyễn Thị Thùy Dương, (2008), Sinh học phân tử ( Khái niệm- Phương phápỨng dụng, Nhà xuất giáo dục, Hà Nội Trần Đàn (2015), Xác định số đặc điểm sinh hóa so sánh protein màng chủng vi khuẩn Vibrio spp phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer), Đồ án tốt nghiệp đại học, Trường Đại học Nha Trang, Khánh Hòa Nguyễn Hữu Đống (2002), Di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất nông nghiệp, TP HCM Nguyễn Bá Đức (2001), Bài giảng ung thư học, Nhà xuất y học, Hà Nội Nguyễn Bá Đức (2005), Bài giảng ung thư đại cương, Nhà xuất y học, Hà Nội Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình công nghệ DNA tái tổ hợp, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, TP.HCM Lê Đình Lương, (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội Phan Tuấn Nghĩa (2012), Hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội 10 Phùng Phướng, Nguyễn Văn Cầu, Nguyễn Trần Trúc Huân (2009), Đại cương ung thư, Đại học Y Huế 11 Khuất Hữu Thanh, (2006), Kỹ thuật gen- Nguyên lý ứng dụng, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội, Hà Nội 12 Nguyễn Thị Thanh Trà, (2016) Tuyển chọn bacteriocin tiềm kháng ung thư từ hệ vi sinh đường ruột người kĩ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang, Khánh Hòa 60 II Tài liệu Tiếng Anh 13 Chakrabarty AM (2003), Microorganisms and cancer: quest for a therapy, Journal of Bacteriogyl 185, 2683–2686 14 Chakrabarty AM (2014), Microbial pathogenicity: a new approach to drug development, Advances in Experimental Medicine and Biology 808, 41-49 15 Chaudhari A, Fialho AM, Ratner D, Gupta P, Hong CS, Kahali S, Yamada T, Haldar K, Murphy S, Cho W, Chauhan VS, Das Gupta TK & Chakrabarty (2006), Azurin, Plasmodium falciparum malaria and HIV/AIDS: inhibition of parasitic and viral growth by Azurin, Cell Cycle (15), 1642-1648 16 Choudhary S, Mathew M & Verma RS (2011), Therapeutic potential of anticancer immunotoxins Drug Discov Today 16, 495-503 17 Cornut G, Fortin C & Soulieres D ( 2008), Antineoplastic properties of bacteriocins: revisiting potential active agents, American Journal of Clinical Oncology 31 (4), 399-404 18 Davitt K, Babcock BD, Fenelus M, Poon CK, Sarkar A, Trivigno V, Zolkind PA, Matthew SM, Grin'kina N, Orynbayeva Z, Shaikh MF, Adler V, Michl J, Sarafraz-Yazdi E, Pincus MR, Bowne WB (2014) The Anti-Cancer Peptidee, PNC-27, Induces Tumor Cell Necrosis of a Poorly Differentiated Non-Solid Tissue Human Leukemia Cell Line that Depends on Expression of HDM-2 in the Plasma Membrane of these Cells, Association of Clinical Scientists 44, 241248 19 Gaspar D, Veiga AS, Castanho MA (2013), From antimicrobial to anticancer peptides A review Frontiers of Microbiology 4, 1-16 20 Grandis V, Bizzarri AR & Cannistraro S 2007, Docking study and free energy simulation of the complex between p53 DNA-binding domain and azurin, Journal of Molecular Recognition 20 (4), 215-226 21 Eldor R, Arbit E, Corcos, A & Kidron M (2013), Glucosereducing effect of the ORMD-0801 oral insulin preparation in patients with uncontrolled type diabetes: a pilot study, PLoS One 8: e59524 61 22 Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM (2010), Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008, International Journal of Cancer 127 (12), 2893-2917 23 Hong CS, Yamada T, Hashimoto W, Fialho AM, Das Gupta TK & Chakrabarty AM (2006), Disrupting the entry barrier and attacking brain tumors: the role of the Neisseria H.8 epitope and the Laz protein, Cell Cycle (15), 1633-1641 24 Hernández-Ledesma B, de Lumen BO (2008), Lunasin: a novel cancer preventive seed Peptide, Perspectives in Medicinal Chemistry 2, 75-80 25 Huang YB, Wang XF, Wang HY, Liu Y, Chen Y (2011), Studies on mechanism of action of anticancer peptides by modulation of hydrophobicity within a defined structural framework, Molecular cancer therapeutics 10 (3), 416-426 26 Joo NE, Ritchie K, Kamarajan P, Miao D & Kapila YL (2012), Nisin, an apoptogenic bacteriocin and food preservative, attenuates HNSCC tumorigensis via CHAC1, Cancer Medicine 1(3), 295-305 27 Jia, L, Gorman, GS, Coward, LU, Noker, PE, Mccormick, D, Horn, TL, Harder, JB & Muzzio, M 2011, Preclinical pharmacokinetics, metabolism, and toxicity of azurin-p28 (NSC745104) a peptit inhibitor of p53 ubiquitination Cancer Chemoth Pharm 28, 513-524 28 Kanno S, Maeda N, Tomizawa A, Yomogida S, Katoh T & Ishikawa (2012), Characterization of cells resistant to the potent histone deacetylase inhibitor spiruchostatin B (SP-B) and effect of overexpressed p21waf1/cip1 on the SP-B resistance or susceptibility of human leukemia cells., International Journal of Oncology 40, 1391-1396 29 Kaur S, Kaur S (2015), Bacteriocins as Potential Anticancer Agents Frontiers of Microbiology 6, Published online 30 Lee DG, Hahm K, Park Y, Kim H Lee., W Lim S Seo, Y & Choi (2005), Functional and structural characteristics of anticancer peptit Pep27 analogues, Cancer Cell International 14, 1-14 31 Lorberboum-Galski H (2011), Human toxin-based recombinant 62 immunotoxins/chimeric proteins as a drug delivery system for targeted treatment of human diseases, Expert Opinion on Drug Delivery (5), 605-621 32 Michalska M, Schultze-Seemann S, Bogatyreva L, Hauschke D, Wetterauer U, Wolf P (2016), In vitro and in vivo effects of a recombinant anti-PSMA immunotoxin in combination with docetaxel against prostate cancer, Impact Journals (16), 22531-22542 33 Naguleswaran A, Fialho AM, Chaudhari ,Hong CS, Chakrabarty AM & Sullivan WJ, (2008), Azurin-like protein blocks invasion of Toxoplasma gondii through potential interactions with parasite surface antigen SAG1, Antimicrobial and Agents Chemotherapy 52(2), 402-8 34 Nguyen VD, Nguyen HHC (2015), Molecular screening of Azurin-like anticancer bacteriocins from human gut microfora using bioinformatics, Advances in Intelligent Systems and Computing 358, 219-229 35 Pastan I, Hassan R, FitzGerald DJ & Kreitman RJ (2007), Immunotoxin treatment of cancer, Annual Review of Medicine 58, 221-237 36 Pincus M.R, Fenelus M., Sarafraz-Yazdi E., Adler V., Bowne W., Michl J (2011), Anti-cancer peptidees from ras-p21 and p53 proteins Current Pharmaceutical Design 17 (25), 2677-2698 37 Punj, V, Bhattacharyya, S, Saint-Dic, D, Vasu, C, Cunningham, EA, Graves, J, Yamada, T, Constantinou, AI, Christov, K, White, B, Li, G, Majumdar, D, Chakrabarty, AM & Das Gupta, TK (2004), Bacterial cupredoxin azurin as an inducer of apoptosis and regression in human breast cancer,Oncogen 23 (13), 2367-2378 38 Riley MA (2009), Bacteriocins, Biology, Ecology, and Evolution, Encyclopedia of Microbiology, Oxford: Elsevier, pp 32-44 39 Rozek T, Kate L Wegener, John H Bowie, Ian N Olver, John A Carver, John C Wallace, Michael J Tyler (2000), The antibiotic and anticancer active aurein peptides from the Australian Bell Frogs Litoria aurea and Litoria raniformis, the FESB Journal 267 (17), 5330–5341 63 40 Soleimani M, Mirmohammad-Sadeghi H, Sadeghi-Aliabadi H, JahanianNajafabadi A (2016), Expression and purification of toxic anti-breast cancer p28-NRC chimeric protein, Advanced Biomedial Research, eCollection 2016 41 Shi D, Hou X, Wang L, Gao Y, Wu D, Xi X, Zhou M, Kwok HF, Duan J, Chen T, Shaw C (2016), Two Novel Dermaseptin-Like Antimicrobial Peptidees with Anticancer Activities from the Skin Secretion of Pachymedusa dacnicolor, Toxins (Basel), 1-16 42 Tan H, Luo W, Wei L, Chen B Li W, Xiao L, Manzhos S, Liu Z, Liang S (2016), Quantifying the Distribution of the Stoichiometric Composition of Anticancer Peptide Lycosin-I on the Lipid Membrane with Single Molecule Spectroscopy, the journal of physical chemistry B, 120 (12), 3081-3088 43 Taranta, M, Bizzarri, AR & Cannistraro, S 2009, Modeling the interaction between the N-terminal domain of the tumor suppressor p53 and azurin, Journal Molecular Recognition 22 (3), 215-222 44 Vinodhkumar, R, Song, Y & Devaki, T 2008, Romidepsin (depsipeptit) induced cell cycle arrest, apoptosis and histone hyperacetylation in lung carcinoma cells (A549) are associated with increase in p21 and hypophosphorylated retinoblastoma proteins expression, Biomed Pharmacother 62, 85-93 45 Walenkamp AME, Boer IGJ, Bestebroer J, Rozeveld D, Timmer-Bosscha H, Hemrika W, van Strijp, JAG & de Haas, CJC (2009), Staphylococcal superantigen-like 10 inhibits CXCL12-induced, Neoplasia 11, 333-344 46 Walenkamp AME, Bestebroer J, Boer IGJ & Kruizinga R (2010), Staphylococcal SSL5 binding to human leukemia cells inhibits cell adhesion to endothelial cells and platelets, Analytical Cellular Pathology 32, 1-10 47 Weldon JE, Pastan (2011), A guide to taming a toxin-recombinant immunotoxins constructed from Pseudomonas exotoxin A for the treatment of cancer, The FEBS Journal 278, 4683-4700 48 Won HS, Seo MD, Jung SJ, Lee SJ, Kang SJ, Son WS, Kim HJ, Park TK, Park SJ, Lee BJ (2006), Structural determinants for the membrane interaction of 64 novel bioactive undecapeptidees derived from gaegurin 5, Journal of Medicianl Chemítry, 49 (16), 4886-4895 49 Wood LM, Vafa ZP & Paterson Y (2010), Listeria-derived ActA is an effective adjuvant for primary and metastatic tumor immunotherapy, Cancer Immunology Immunotherapy 59 (7), 1049-1058 50 Zhou J, Zhou M, Tang Y, Wang J, Wei C, Gu F, Lei T, Chen Z QY (2016), The milk derived fusion peptidee, ACFP, suppresses the growth of primary human ovarian cancer cells by regulating apoptotic gene expression and signaling pathways, BMC Cancer (16) 51 Yamada T, Goto M, Punj V, Zaborina O, Chen ML, Kimbara K, Majumdar D, Cunningham E, Das Gupta TK & Chakrabarty AM (2002), Bacterial redox protein azurin, tumor suppressor protein p53, and regression of cancer, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 14098-14103 52 Yamada, T, Hiraoka, Y, Ikehata, M, Kimbara, K, Avner, BS, Das, GTK & Chakrabarty, AM 2004, Apoptosis or growth arrest: Modulation of tumor suppressor p53's specificity by bacterial redox protein azurin, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101 (14), 4770-4775 III Tài liệu internet 53 http://www.tgw1916.net/Clostridium/nexile.html PHỤ LỤC Cách pha cho gel Monomere solution (40%) Acrylamide (FW 71.08) 10g Bis-acrylamide (FW 154.2) 0.2g Nước cất 25ml Giữ tháng tối 4oC 4X Resolving gel buffer (0.5M Tris HCl, pH 8.8) Tris base (FW 121.1) 1.815g Nước cất thêm 7.5ml Chỉnh pH 8.8 với HCl đậm đặc Thêm nước cất đến 10ml Giữ tháng tối 4oC 4X Stacking gel buffer (0.5 Tris HCl, pH 6.8) Tris base (FW 121.1) 1.5g Nước cất thêm 20 ml Chỉnh pH 6.8 với HCl đậm đặc Thêm nước cất đến 25ml Giữ tháng tối 4oC SDS 10% SDS 2.5g Nước cất 25ml Giữ tháng nhiệt độ phòng Ammonium persulfate Ammonium persulfate 0.2g Nước cất 2ml Pha để dùng không để lại 2X Treatment buffer 4X Stacking gel buffer 2.5ml SDS 10% 4ml Glycerol 2ml Dithiothreitol (DTT) ( FW 154,2) 0.31g Bromophenol Blue 0.002g Thêm nước cất 10ml Chia nhỏ thành thể tích 0.5 ml giữ tháng -20oC Tank buffer (0.025M Tris HCl; 0.192M Glycine; 0.1% SDS; pH 8.3) Tris (FW 121.1) 3.028g Glycine 14.413g SDS 1g Nước cất lít Giữ tháng nhiệt độ phòng Resolving gel 15% Monomere 40% 3.8 ml 4X Resolving gel 2.5 ml SDS 10% 0.1 ml Nước cất 3.6 ml APS 10% 100 µl TEMED 10 µl Stacking gel 5% Monomere 40% 1.3 ml 4X Stacking gel 2.5 ml SDS 10% 0.1 ml Nước cất 6.2 ml APS 10% 50 µl TEMED 10 µl 10 Dung dịch nhuộm gel (Staining solution) Coomassie Brilliant Blue G- 250 0.025g Methanol 40 ml Acid acetic 10 ml Bổ sung nước cất vừa đủ 100 ml 11 Dung dịch rửa màu Methanol 40 ml Acid acetic 10 ml Nước cất vừa đủ 100 ml 12.Cách pha lít 1X PBS Nước cất 800 ml NaCl 8g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.24 g chỉnh pH đến 7.4 HCl Thêm nước cất để tổng khối lượng lít Khử trùng 20 phút, 121°C Bảo quản nhiệt độ phòng 13.Cách pha 100ml đệm ly giải màng tế bào ( 20mM Tris-HCl, pH 7.5; 200mM NaCl; 5mM mercaptoethanol; sau thêm Lysozyme với nồng độ đạt 1mg/ml) Pha stock : Tris-Cl pha nồng độ 0.5 M, NaCl pha nồng độ 1M, Lysozyme pha nồng độ 10mg/ml Tris HCl 0.5 M 0.6g Tris Nước cất lần 10ml Hòa tan, khử trùng 121oC 20 phút NaCl 1M 0.585g Nước cất lần 10ml Hòa tan, khử trùng 121oC 20 phút Pha lysozyme 10mg/ml Lysozyme 50mg Nước cất lần 5ml 14 Thành phần đổ gel điện di SDS-PAGE Thành phần dung dịch điện di protein (Trần Đàn, 2015) Gel gom 5% Gel phân tách 15% (Stacking gel) (Resolving gel) Nước cất 6,2 ml 3,6 ml Monomer solution 40% 1,3 ml 3,8 ml 4X Resolving gel buffer (pH 8,8) - 2,5 ml 4X Stacking gel buffer (pH 6,8) 2,5 ml - SDS 10% 0,1 ml 0,1 ml APS 10% 50 µl 100 µl TEMED 10 µl 10 µl Thành phần