Xác định điều kiện biểu hiện thích hợp trong escherichia coli cho bacteriocin dlazu6 có tiềm năng kháng ung thư từ dorea longicatena

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN THÍCH HỢP TRONG Escherichia coli CHO BACTERIOCIN DLAZU6 CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ Dorea longicatena Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS NGUYỄN VĂN DUY ThS NGUYỄN THỊ KIM CÚC Sinh viên thực : LỤC THỊ LUYỄN Mã số sinh viên : 55130975 Khánh Hòa: 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN THÍCH HỢP TRONG Escherichia coli CHO BACTERIOCIN DLAZU6 CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ Dorea longicatena GVHD: PGS.TS Nguyễn Văn Duy ThS Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Lục Thị Luyễn MSSV: 55130975 Khánh Hòa, tháng 6/2017 i LỜI CẢM ƠN Thực tế thành công mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp người khác Trong suốt năm học tập trường, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ thầy cô giáo, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc xin gửi đến quý thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập trường Và đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Văn Duy Ths Nguyễn Thị Kim Cúc với tri thức tâm huyết truyền đạt cho vốn kiến thức quý báu; tận tình hướng dẫn, giúp đỡ chia sẻ ý kiến bổ ích hoàn thành tốt luận văn Với vốn kiến thức tiếp thu trình học không tảng cho trình nghiên cứu khóa luận mà hành trang quý báu để bước vào đời cách vững tự tin Bên cạnh nhận nhiều giúp đỡ nhiệt tình quý thầy cô giáo, nhân viên quản lý phòng thí nghiệm, anh chị bạn bè Tôi vô cảm ơn tình cảm tốt đẹp người thân gia đình, bạn bè ủng hộ, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập hoàn thành khóa luận Nha Trang, tháng năm 2017 Sinh viên Lục Thị Luyễn ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi LỜI MỞ ĐẦU .vii CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan ung thư liệu pháp chống ung thư 1.1.1 Tổng quan ung thư 1.1.2 Nguyên nhân gây ung thư phương pháp điều trị ung thư 1.2 Tổng quan peptide kháng ung thư 1.3 Tình hình nghiên cứu bacteriocin kháng ung thư 1.3.1 Bacteriocin kháng ung thư 1.3.2 Azurin, laz số bacteriocin kháng ung thư khác 10 1.4 Giới thiệu bacteriocin Dlazu6 từ Dorea longicatena 14 1.4.1 Giới thiệu Dorea longicatena 14 1.4.2 Giới thiệu gen mã hóa bacteriocin Dlazu6 15 1.5 Biểu gen Escherichia coli 16 1.5.1 Vi khuẩn biểu E coli BL21 16 1.5.2 Vector biểu E coli 18 1.5.3 Ảnh hưởng yếu tố đến biểu protein 19 1.6 Tinh chế protein tái tổ hợp E coli 21 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 2.2 Vật liệu nghiên cứu 23 2.2.1 Chủng vi khuẩn 23 2.2.2 Hóa chất enzyme 25 2.2.3 Máy móc thiết bị chuyên dụng 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 iii 2.3.1 Kiểm tra biểu protein Dlazu6 E coli Bl21 28 2.3.2 Khảo sát điều kiện biểu protein Dlazu6 từ chủng E coli tái tổ hợp 29 2.3.3 Kỹ thuật điện di biến tính gel polyacrylamide (SDS-PAGE) 30 2.3.4 Phương pháp tăng khả hòa tan protein 35 2.3.5 Tinh chế protein cột Hispur Ni-NTA 39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Kiểm tra biểu gen dlazu6 E coli BL21 41 3.2 Khảo sát điều kiện cảm ứng biểu gen dlazu6 E coli 43 3.3 Khảo sát khả hòa tan protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 phương pháp siêu âm 48 3.4 Bước đầu tinh chế protein mục tiêu cột HisPur Ni-NTA 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu AMP Viết đầy đủ Cationic Antimicrobial Peptides Ghi Peptide kháng khuẩn tích điện dương APS Ammonium persulfate DNA Deoxyribonucleic Acid DTT Dithiothreitol EDTA Disodium ethylenediamine tetraacetate FPLC Fast protein liquid chromatography Chất sắc ký lỏng nhanh HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan siêu vi B HCV Hepatitis B virus Vius viêm gan C HIV Human Immunodeficiency Virus infection Virus gây suy giảm miễn dịch người IMAC Immobilized Metal ion Affinity Chromatography Sắc tố cố định vô hiệu hóa kim loại Chất cảm ứng IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalacctopyranoside kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani Broth Môi trường nuôi cấy mRNA Messenger RNA RNA thông tin PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis Điện di gel Polyacrylamide PEG Polyethylene glycol PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulphate TEMED Tetramethylethylenediamine WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các bacteriocin có hoạt động chống lại dòng tế bào ung thư khác 13 Bảng 1.2 So sánh bacteriocin Dlazu6 mã hóa gen dlazu6 có hai tính chất tương tự với Azurin P28-Azurin 16 Bảng 2.1 Thành phần dung dịch điện di protein 33 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mô hình gắn kết Azurin-p28 protein đích ung thư p53 11 Hình 1.2 Cấu trúc Laz 12 Hình 1.3 Hình ảnh kiểm tra biểu mức độ tan protein GST-6xHis-TEVChazu5 E coli BL21 .14 Hình 1.4 Tinh protein sắc lý lực 22 Hình 1.5 Hình ảnh điện di SDS-PAGE phân đoạn tinh protein NLI-IF 22 Hình 2.1 Plasmid pET42a(+) tái tổ hợp chứa gen dlazu6 24 Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát chung đề tài 27 Hình 2.3 Cấu trúc protein trước sau biến tính bới SDS 32 Hình 2.4 Điện di gel polyacrylamide 34 Hình 3.1 Kết kiểm tra biểu mức độ tan protein GST-6xHis-TEVDlazu6 E coli BL21 .41 Hình 3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IPTG 24°C đến biểu tính tan protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 .44 Hình 3.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IPTG 30°C đến biểu tính tan protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 .45 Hình 3.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IPTG 37°C đến biểu tính tan protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 .46 Hình 3.5 Khảo sát biểu tính tan protein dung hợp Dlazu6 theo nhiệt độ 47 Hình 3.6 Kết khảo sát khả hòa tan protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 theo quy trình 49 Hình 3.7 Kết khảo sát khả hòa tan protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 phương pháp sonication kết hợp với dịch ly giải 51 Hình 3.8 Kết tinh chế protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 .54 vii LỜI MỞ ĐẦU Trong vài năm gần đây, số lượng bệnh nhân phát mắc bệnh ung thư số ca tử vong ung thư tăng đột biến, ung thư xem bệnh xã hội thời đại Các loại hoá chất độc hại từ sản phẩm gia dụng, tia cực tím, khói bụi công nghiệp, môi trường sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt thiếu khoa học, bia rượu, thuốc … đẩy nhanh số ca mắc bệnh ung thư khắp giới Theo dự báo nhà khoa học Anh kỷ 21 ung thư tiếp tục bệnh có tỉ lệ tử vong cao giới Khoa học chưa thể tìm cách điều trị dứt điểm trường hợp khối u ác tính, ung thư xem bệnh nan y khó chữa Theo ước tính Tổ chức ung thư Liên hợp quốc, số người bị tử vong ung thư lên tới khoảng 13,2 triệu người vào năm 2030 Hiệp hội nghiên cứu ung thư quốc tế - IARC cho biết, khoảng 21,4 triệu trường hợp mắc ung thư phát vào năm 2030 tập trung chủ yếu nước nghèo, nơi có mức sống thấp tỉ lệ mắc bệnh cao giới Có nhiều phương pháp điều trị ung thư phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, nội tiết, miễn dịch, … phương pháp có nhược điểm định Phẫu thuật hiệu cho ung thư giai đoạn đầu, khu trú khối ung thư di phẫu trị có hiệu lực tạm thời, hiệu lực chí kích thích di phát triển khối ung thư Khi sử dụng xạ trị hóa trị, ức chế, tiêu diệt tế bào ung thư mà làm tổn thương tế bào xung quanh, điều làm ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người bệnh tượng kháng thuốc tế bào ung thư Và nay, phương pháp điều trị ung thư cách tiếp cận với sản phẩm từ tự nhiên, vi sinh vật sống quan tâm trở lại Protein peptide từ vi khuẩn sản phẩm nghiên cứu nhiều Đặc biệt, peptide bacteriocin, sản phẩm tiết vi khuẩn, chất kháng khuẩn có chất protein hứa hẹn chất chống ung thư an toàn hiệu Trong số peptide kháng khuẩn này, Azurin peptide kháng khuẩn Pseudomonas kháng ung thư nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng Giả thuyết đặt liệu có phải Azurin bacteriocin hệ vi sinh vật đường ruột người có khả kháng ung thư? Nguyen Nguyen (2015) tiến hành sàng lọc gen mã hóa cho bacteriocin tương tự Azurin kháng ung thư từ hệ gen 66 loài vi khuẩn ưu hệ vi sinh vật đường ruột người viii phương pháp tin sinh học Kết cho thấy có 14 bacteriocin giả định tương tự Azurin p28-Azurin, vùng chức sinh học cấu trúc, tỉ lệ axit amin kỵ nước khả gắn kết với protein p53 tế bào ung thư Bacteriocin Dlazu6 mã hóa trình tự gen p1seq11 (Dlazu6) từ Dorea longicatena 14 ứng cử viên Gen dlazu6 tạo dòng thành công plasmid pET42a(+) biến nạp vào vi khuẩn E coli BL21, để kiểm tra khảo sát biểu protein Dlazu6 đề tài: “Xác định điều kiện biểu thích hợp Escherichia coli cho bacteriocin Dlazu6 có tiềm kháng ung thư từ Dorea longicatena” thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Văn Duy  Mục tiêu đề tài: “Xác định điều kiện biểu thích hợp Escherichia coli cho bacteriocin Dlazu6 có tiềm kháng ung thư từ Dorea longicatena bước đầu tinh chế bacteriocin Dlazu6”  Nội dung nghiên cứu - Khảo sát điều kiện thích hợp cho biểu gen dlazu6 từ Dorea longicatena Escherichia coli - Bước đầu tinh chế bacteriocin Dlazu6  Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học - Đây nghiên cứu Việt Nam biểu bacteriocin tương tự Azurin kháng ung thư, peptide protein có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật đường ruột người - Kết nghiên cứu dùng làm sở cho việc thử hoạt tính kháng ung thư động vật người Ý nghĩa thực tiễn - Nghiên cứu làm sở cho việc phát triển thuốc kháng ung thư có tính đặc hiệu cao hiệu ứng phụ thấp có nguồn gốc từ vi sinh vật đường ruột 53 giải protein đệm Elution phân đoạn khác nhau, lần rửa giải (E1) có băng protein mờ kích thước 38,4 kDa, hai lần sau không thấy băng protein mục tiêu Tuy nhiên, sau rửa giải protein liên kết với cột có xuất protein khác vi khuẩn, điều cho thấy protein mục tiêu chứa liên kết đặc hiệu với cột His Cả lần rửa giải kết cho thấy có xuất vài protein tạp, protein lại gắn đặc hiệu với Ni giữ lại không bị trôi sau lần rửa Như vậy, protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 không gắn đặc hiệu với cột Ni-NTA mà có vài protein khác vi khuẩn E coli lại gắn đặc hiệu với cột, hiệu tinh chế không cao Đuôi dung hợp GST giúp cho protein Dlazu6 biểu dễ dàng hơn, đồng thời làm tăng tính tan protein mục tiêu protein dung hợp với đuôi GST tăng kích thước, giúp dễ dàng phát điện di gel polyacrylamide Đuôi His-TEV giúp dễ dàng tinh chế loại bỏ đuôi dung hợp khỏi protein mục tiêu His liên kết chọn lọc cao với Ni2+ kim loại chuyển tiếp khác bất động phối tử, protein có gắn đuôi lực rửa giải chọn lọc imidazole Protein gắn đuôi GST liên kết với glutathione phối tử, rửa giải với dung dịch glutathione Ngoài ra, trình tự MSC nằm ngày sau trình tự mã hóa GST-6xHis-TEV giúp cho trình cài gắn gen dễ dàng Tuy nhiên, theo kết hình 3.8 protein dung hợp GST6xHis-TEV-Dlazu6 lại không gắn đặc hiệu với Ni2+ dẫn đến protein khỏi cột qua trình ly tâm giai đoạn gắn cột Ngược lại protein vi khuẩn E coli lại gắn đặc hiệu với cột Ni-NTA nhờ liên kết nên giai đoạn gắn cột protein phân đoạn 30 kDa, 35 kDa vài protein khác không bị loại bỏ, gắn trực tiếp lên cột không bị đệm rửa giải loại bỏ Sau giai đoạn rửa giải protein xuất nhiều, băng protein đậm, protein mục tiêu xuất băng mờ lần rửa giải (E1) 54 Hình 3.8 Kết tinh chế protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 Giếng M: thang protein chuẩn (kDa); giếng S0: protein chưa tinh chế; giếng S1: protein thu giai đoạn gắn cột (lần 1); giếng S2: protein thu giai đoạn gắn cột (lần 2); giếng W1: protein thu lần rửa cột đầu tiên; giếng W5: protein thu lần rửa cột thứ 5; giếng E1, E2, E3: protein thu lần rửa giải protein liên kết với cột His-tag So sánh với kết tinh chế protein tái tổ hợp NLI-IF (Gen mã nhân tố phiên mã - Nuclear LIM Interactor-Interacting Factor) Nguyễn Duy Phương (2012) gen dlazu6 mã hóa cho bacteriocin Dlazu6 biểu E coli không tinh chế thành công, độ tinh không cao Lý do lượng protein hòa tan không nhiều, protein Dlazu6 protein ngoại lai khó hòa tan E coli, liên kết chặt chẽ với màng tế bào Tác dụng trình phá tế bào sóng siêu âm kết hợp với đệm có nồng độ muối thích hợp không làm hòa tan lượng protein không tan Bên cạnh vi khuẩn E coli lại vi khuẩn Gram âm, cấu tạo lớp phospholipit nên việc hòa tan protein khó khăn Một số protein vi khuẩn E coli lại gắn đặc hiệu với cột His, điều chứng tỏ protein có lực với cột cao so với protein mục tiêu 55 Như vậy, bước đầu tinh chế protein tái tổ hợp Dlazu6 không gắn đặc hiệu lên cột Ni-NTA, điều kiện thời gian gặp số khó khăn khác nên chưa tiến hành khảo sát nồng độ muối đệm trình tinh chế 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã biểu thành công bacteriocin Dlazu6 từ Dorea longicatena dạng protein dung hợp GST-6xHis-TEV-Dlazu6 E coli BL21 Kết biểu kiểm tra phương pháp SDS-PAGE Đã khảo sát điều kiện phù hợp để biểu gen dlazu6 chủng E coli BL21 tái tổ hợp quy mô phòng thí nghiệm Đó là: nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM; nhiệt độ biểu 37°C Đã tăng khả hòa tan protein Dlazu6 phương pháp siêu âm giai đoạn phá màng tế bào Kết tinh chế bước đầu cho thấy protein tái tổ hợp Dlazu6 gắn không đặc hiệu lên cột Ni-NTA Kiến nghị Để tiếp tục hướng nghiên cứu trên, có số kiến nghị sau: Nghiên cứu nâng cao hiệu suất biểu protein tái tổ hợp Dlazu6 dạng hòa tan Tiếp tục tinh chế thu hồi protein tái tổ hợp Dlazu6 đặc hiệu từ tế bào E coli từ vật chủ khác 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Trần Thị Bảo Châu, Nguyễn Việt Anh, Trần Văn Hiếu (2016) Tạo dòng, biểu tinh protein tái tổ hợp FliC Salmonella enteritidis Tạp chí phát triển Khoa học Công nghệ, Vol 19 Nguyễn Văn Duy (2016) Tách dòng biểu bacteriocin Chazu5 tương tự Azurin kháng ung thư Escherichia coli Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Quốc Gia lân thứ Đà Nẵng nghiên cứu giảng dạy sinh học Việt Nam, 20/5/2016 NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, pp 956–961 Nguyễn Bá Đức (2001), Bài giảng ung thư học, NXB Y học, Hà Nội Hoàng Anh Hà (2016) Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu lựa chọn điều kiện biểu protein dung hợp sumo_il-11 chủng escherichia coli Viện Đại học mở Hà Nội Phan Thị Kim Hừng (2016) Tạo dòng biểu gen dlazu6 (p1seq11) mã hóa cho bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ Dorea longicatena Escherichia coli Trường Đại học Nha trang Mai Trọng Khoa (2009) Tình hình mắc bệnh ung thư giới Việt Nam Trung tâm Y học Hạt nhân ưng bướu bệnh viện Bạch Mai Nguyễn Thị Lang (2002) Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học NXB Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh Nguyễn Hoàng Lộc (2007) Nhập môn Công nghệ sinh học NXB Đại học Huế Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2007) Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Nghiêm Luật (2015) Ung thư: cập nhật thực trạng, nguyên nhân, chuẩn đoán điều trị Bệnh viên đa khoa Medlatec 11 Nguyễn Duy Phương, Najaren Tuteja, Lê Huy Hàm, Phạm Xuân Hội (2012) Biểu tinh protein tái tổ hợp NLI-IF từ tế bào Escherichia coli Tạp chí sinh học, 34(3): 347-353 12 Lê Đình Sáng (2010) Bệnh học ung thư, Đại học Y khoa Hà Nội 58 13 Nguyễn Hồng Vân, Nguyễn Trọng Tuệ (2008) Nghiên cứu số điều kiện tối ưu biểu proinsulin người tái tổ hợp hệ E.coli – BL21 (DE3) với vector pET - 28a(+) Trường Đại học Y Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh 14 Blattner F R, Plunkett G, Bloch C A, Perna N T, Burland V, Riley M, Collado-Vides J, Glasner J D, Rode C K, Mayhew G F, Gregor J, Davis N W, Kirkpatrick H A, Goeden M A, Rose D J, Mau B, Shao Y (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science, 277 (5331): 1453–1462 15 Chaudhari A, Mahfouz M, Fialho A M, Yamada T, Granja A T, Zhu Y, Hashimoto W, Schlarb-Ridley B, Cho W, Das Gupta T K, Chakrabarty A M (2007) Cupredoxin-cancer interrelationship: Azurin binding with EphB2, interference in EphB2 tyrosine phosphorylation, and inhibition of cancer growth Biochemistry, 46(7): 1799–810 16 Davitt K, Babcock B D, Fenelus M, Poon C K, Sarkar A, Trivigno V, Zolkind P A, Matthew S M, Grin'kina N, Orynbayeva Z, Shaikh M F, Adler V, Michl J, Sarafraz-Yazdi E, Pincus M R, Bowne W B (2014) The Anti-Cancer Peptidee, PNC-27, Induces Tumor Cell Necrosis of a Poorly Differentiated Non-Solid Tissue Human Leukemia Cell Line that Depends on Expression of HDM-2 in the Plasma Membrane of these Cells, Ann Clin Lab Sc, 44: 241-248 17 Dennison S R, Whittaker M, Harris F and Phoenix D A (2006) Anticancer AlphaHelical Peptides and Structure/Function Relationships Underpinning Their Interactions with Tumour Cell Membranes Curr Protein Pept Sci, 7:487-499 18 E-kobon T, Thongararm P, Roytrakul S, Meesuk L, Chumnanpuen P (2016) Prediction of anticancer peptides against MCF-7 breast cancer cells from the peptidomes of Achatina fulica mucus fractions Computational and Structural Biotechnology Journal, Pages 49-57 19 Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin D M, Forman D, Bray F (2015) Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012 Int J Cancer, 136(5):E359-86 20 Gaspar D, Veiga A S, Castanho M A R B (2013) From antimicrobial to anticancer peptides Front Microbiol 4: 294 59 21 Godon B and petit l (1968) Action des ultra-sons sur les proprieties physicochimiques du gluten II Treatment du gluten de farine normale Ann Technol Agric, 17:103-114 22 Hilchie A L, Doucette C D, Pinto D M, Patrzykat A, Douglas S, Hoskin D W (2011) Pleurocidin-family cationic antimicrobial peptides are cytolytic for breast carcinoma cells and prevent growth of tumor xenografts Breast Cancer Res, 13(5): R102 23 Huebner F R, and Rothfus J A (1971) Evidence for glutenin in wheat: stability toward dissociating forces Cereal Chem, 48:469- 478 24 Jennings A C (1978) Gel formation in acidified aqueous suspensions of cereal flours J Sci Food Agric 29:963-974 25 Jennsen H, Hamill P, Hancock R E W (2006) Peptide antimicrobial agents Clin Microbiol Rev 19:491–511 26 Jia L, Gorman G S, Coward L U, Noker P E, Mccormick D, Horn T L, Harder J B, Muzzio M (2011), Preclinical pharmacokinetics, metabolism, and toxicity of Azurin-p28 (NSC745104) a peptide inhibitor of p53 ubiquitination Cancer Chemoth Pharm, 28: 513-524 27 Joo N E, Ritchie K, Kamarajan P, Miao D, Kapila Y L (2012) Nisin, an apoptogenic bacteriocin and food preservative, attenuates HNSCC tumorigensis via CHAC1 Cancer Medicine, 1(3): 295-305 28 Jyothi T (2012) Cancer trearment using peptides: Current therapies and future prospects Journal of Amino Acids, Vol 2012, Article ID 967347 29 Karpinski T M, Szkaradkiewicz (2013) Anticancer peptide from bacteria Bangladesh J Pharmacol, vol 8:3 30 Kaur S and Kaur S (2015) Bacteriocin as potential anticancer agent Front Pharmacol, 6: 272 31 Lee S J, Lee S Y (2002) Efficient high-level production of spider silk protein by fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli and its purification Theories and Applications of Chem Eng, 8: 246–359 32 Lim K J, Sung B H, Shin J R, Lee Y W, Kim D J, Yang K S, Kim S C (2013) A cencer specific cell-penetrating peptide, BR2, for the efficient delivery of an scFv into cancer cells PloS One, 8(6): e66084 60 33 Liu Z, Deng M, Xiang J, Ma H, Hu W, Zhao Y, Li D W, Liang S (2012) A novel spider peptide toxin suppresses tumor growth through dual signaling pathways Curr Mol Med, 12(10): 1350-60 34 Macritchie F (1975) Mechanical degradation of gluten proteins during high-speed mixing of doughs J Polym Sci Symp, 49:85-90 35 Makrides S C (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli Microbiol Rev, 60(3): 512–538 36 Mehta N, Lyon J G, Patil K, Mokarram N, Kim C, Bellamkonda R V (2016) Bacterial carriers for Glioblastoma therapy Mol Ther Oncolytics, 17,4:1-17 37 Micewicz Ewa D, Chun-Ling J, Schaue D, Luong H, McBride H W, Ruchala P (2011) Small Azurin Derived Peptide Targets Ephrin Receptors for Radiotherapy Int J Pept Ther, 17:247–257 38 Nelson D L, Cox M M (2008) Lehninger Principles of Biochemistry (Fifth ed.) New York: W H Freeman and Company 39 Nguyen C, Nguyen V D (2016) Discovery of azurin-like anticancer bacteriocins from human gut microbiome through homology modeling and molecular docking against the tumor suppressor p53 Biomed Research International 2016, Article ID 8490482 40 Nguyen V D, Nguyen H C (2015) Molecular screening of Azurin-like anticancer bacteriocins from human gut microfora using bioinformatics Advances in Intelligent Systems and Computing, 358: 219-229 41 Piserchio A, Ghose R, Cowburn D (2009) Optimized bacterial expression and purification of the c-Src catalytic domain for solution NMR studies J Biomol NMR, 44(2):87–93 42 Punj V, Bhattacharyya S, Saint-Dic D, Vasu C (2004) Bacterial cupredoxin Azurin as an inducer of apoptosis and regression in human breast cancer Oncogene 23(13):2367-78 43 Raguz S, Yagüe E (2008) Resistance to chemotherapy: new treatments and novel insights into an old problem Br J Cancer, 99(3):387-91 44 Rozek T, Kate L Wegener, John H Bowie, Ian N Olver, John A Carver, John C Wallace, Michael J Tyler (2000), The antibiotic and anticancer active aurein 61 peptides from the Australian Bell Frogs Litoria aurea and Litoria raniformis the FESB Journal, 267 (17), 5330–5341 45 Sahdev S, Khattar S K, Saini K S (2008) Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies Mol Cell Biochem, 307(1–2):249–264 46 Shi D, Hou X, Wang L, Gao Y, Wu D, Xi X, Zhou M, Kwok H F, Duan J, Chen T, Shaw C (2016) Two Novel Dermaseptin-Like Antimicrobial Peptidees with Anticancer Activities from the Skin Secretion of Pachymedusa dacnicolor Toxins (Basel), 1-16 47 Shin C S, Hong M S, Bae C S, Lee J (1997) Enhanced production of human mini-proinsulin in fed-batch cultures at high cell density of Escherichia coli BL21(DE3) [pET-3aT2M2] Biotechnology Progress, 13(3):249–257 48 Singh N K and Hepherd K W (1985) The structure and genetic control of a new class of disulphide-linked proteins in wheat endosperm Theor Appl Genet, 71:7992 49 Smibert R M, Krieg N R (1994) Phenotypic characterization In: Methods for General and Molecular Bacteriology Gerhardt P, Murray RGE, Wood WA, Krieg NR Eds American Society for Microbiology, pp 607-654 50 Tagg J R, Dajani A S, Wannamaker L W (1976) Bacteriocins of Gram- Positive Bacteria American Society for Microbiolog, 40(3): 722-756 51 Taranta M, Bizzarri A R, Cannistraro (2009) Modeling the interaction between the N-terminal domain of the tumor suppressor p53 and Azurin, Journal Molecular Recognition, 22(3): 215-222 52 Volontè F, Marinelli F, Gastaldo L, Sacchi S, Pilone M S, Pollegioni L, Molla G (2008) Optimization of glutary l-7-aminocephalosporanic acid acylase expression in E coli Protein Expr Purif, 61(2):131–137 53 Hashimoto W, Ochiai A, Hong C S, Murata K, Chakrabarty A M (2015) Structural studies on Laz, a promiscuous anticancer Neisserial protein Bioengineered, 6(3):141-148 54 Won H S, Seo M D, Jung S J, Lee S J, Kang S J, Son W S, Kim HJ, Park T K, Park S J, Lee B J (2006), Structural determinants for the membrane interaction of novel 62 bioactive undecapeptidees derived from gaegurin 5, Journal of Medicianl Chemítry, 49 (16): 4886-4895 55 Yamada T, Goto M, Punj V, Zaborina O, Kimbara K, Das Gupta T K, and Chakrabarty A M (2002) The Bacterial Redox Protein Azurin Induces Apoptosis in J774 Macrophages through Complex Formation and Stabilization of the Tumor Suppressor Protein p53 Infection and Immunity, 7054–7062 56 Yamada T, Hiraoka Y, Ikehata M, Kimbara K, Avner B S, Das G T K, Chakrabarty (2004) Apoptosis or growth arrest: Modulation of tumor suppressor p53's specificity by bacterial redox protein azurin Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101 (14): 4770-4775 57 Yin J, Li G, Ren X, Herrler G (2007) Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes J Biotechnol, 127(3):335–347 58 Zakuan M, Noraina (2011) Potential Anti-Cancer Properties of Bacteriocin UL4 from Lactobacillus Plantarum in Rats Induced with Colon Cancer Masters thesis, Universiti Putra Malaysia 59 Zhou J, Zhou M, Tang Y, Wang J, Wei C, Gu F, Lei T, Chen Z Q Y (2016) The milk derived fusion peptidee, ACFP, suppresses the growth of primary human ovarian cancer cells by regulating apoptotic gene expression and signaling pathways, BMC Cancer (16) PHỤ LỤC Phụ lục Môi trường nuôi cấy Môi trường LB Cách pha 100 ml môi trường: cân 3,5 gram môi trường LB cho 100 ml nước cất, hòa tan hoàn toàn hấp khử trùng 121°C 15 phút Sau chờ nhiệt độ môi trường khoảng 40°C -50°C bổ sung kháng sinh kanamycine để đạt nồng độ 30 µg/ml Phụ lục Hóa chất điện di SDS - PAGE Monomere solution (40%) Acrylamide (FW 71,08) 10 g Bis-acrylamide (FW 154,2) 0,2 g Nước cất 25 ml Giữ tháng tối 4°C (Acrylamide chất độc thần kinh, thao tác phải cẩn thận) Resolving gel buffer 4X (0,5 M Tris-HCl, pH 8,8) Tris base (FW 121,1) 1,815 g Nước cất thêm 7,5 ml Chỉnh pH 8,8 với HCl đậm đặc Thêm nước cất đến 10 ml Giữ tháng tối 4°C Stacking gel buffer 4X (0,5 Tris HCl, pH 6,8) Tris base (FW 121,1) 1,5 g Nước cất thêm 20 ml Chỉnh pH 6,8 với HCl đậm đặc Thêm nước cất đến 25 ml Giữ tháng tối 4°C SDS 10% SDS 2,5 g Nước cất 25 ml Giữ tháng nhiệt độ phòng Ammonium persulfate Ammonium persulfate 0,2 g Nước cất ml Pha để dùng không để lại Treatment buffer 2X 4X Stacking gel buffer 2,5 ml SDS 10% ml Glycerol ml Dithiothreitol (DTT) ( FW 154,2) 0,31 g Bromophenol Blue 0,002 g Thêm nước cất 10 ml Chia nhỏ thành thể tích 0,5 ml giữ tháng -20°C Tank buffer (0,025 M Tris-HCl; 0,192 M Glycine; 0,1% SDS; pH 8,3) Tris (FW 121,1) 3,028 g Glycine 14,413 g SDS 1g Nước cất lít Giữ tháng nhiệt độ phòng Resolving gel 15% Monomere 40% 3,8 ml 4X Resolving gel 2,5 ml SDS 10% 0,1 ml Nước cất 3,6 ml APS 10% 100 µl TEMED 10 µl Stacking gel 5% Monomere 40% 1,3 ml 4X Stacking gel 2,5 ml SDS 10% 0,1 ml Nước cất 6,2 ml APS 10% 50 µl TEMED 10 µl 10 Dung dịch nhuộm gel (Staining solution) Coomassie Brilliant Blue G - 250 0,025 g Methanol 40 ml Acid acetic 10 ml Bổ sung nước cất vừa đủ 100 ml 11 Dung dịch rửa màu Methanol 40 ml Acid acetic 10 ml Nước cất vừa đủ 100 ml 12 Thuốc thử Bradford Hòa tan 0,01 g Coomassive Brilliant Blue G-250 vào ml ethanol 96%, sau thêm 10 ml H3PO4 85% định mức lên đến 100 ml nước cất Phụ lục Đệm ly giải Cách pha 100 ml đệm ly giải màng tế bào (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM NaCl; mM mercaptoethanol; sau thêm lysozyme với nồng độ đạt mg/ml) Pha stock: Tris-Cl pha nồng độ 0,5 M, NaCl pha nồng độ M, lysozyme pha nồng độ 10 mg/ml + Tris HCl 0,5 M: cân 0,6 g Tris thêm 10 ml nước cất lần, hòa tan, khử trùng 121°C 20 phút + NaCl M: Cân 0,585g thêm 10 ml nước cất lần, hòa tan, khử trùng 121°C 20 phút Pha lyzozyme 10 mg/ml: Cân 50 mg lysozym hòa tan ml nước cất lần, lọc vô trùng màng lọc vô khuẩn Phụ lục Kháng sinh Cách pha kháng sinh Stock gốc 50 mg/m1muốn pha thành 30 µg/ml (1X) ta tiến hành pha stock 100 X mg/ml cách pha 60 µg/ml Kanamycine bổ sung thêm 940 µg/ml H2O, vừa đủ ml Phụ lục Hóa chất làm tăng khả hòa tan protein Lysis buffer Nước cất 400 ml NaH2PO4 50 mM 2,4 g NaCl 500 mM 11,7 g Imidazol 10 mM 0,27232 g Triton X – 100 pH 7,8 0,8 g Lysis buffer Nước cất 400 ml NaH2PO4 50 mM 2,4 g NaCl 300 mM 7,02 g Imidazol 10 mM 0,27232 g Triton X – 100 pH 7,8 0,8 g Pha PMSF 100 mM (pha 50 𝜇l) PMSF 0,87095 g Nước cất 50 𝜇l Đệm sonication 1: (50 mM NaH2PO4.H2O; 300 mM NaCl; 10 mM imidazole; pH 8) - Cách pha 20 ml sonication NaH2PO4.H2O 0,138 g NaCl 0,351 g Imidazole 0,2 ml imidazole M Thêm 15 ml nước cất 2X, điều chỉnh pH đến 8, thêm nước vào vừa đủ 20 ml Đệm sonication 2: (NaCl 500 mM; glycerol 5%; Tris HCl 30 mM; pH 8) - Cách pha 10 ml sonication buffer NaCl 0,2925 g Glycerol 5% Tris HCl 1M 0,3 ml Đệm sonication 3: (50 mM NaH2PO4.H2O; 500 mM NaCl; pH 8) - Cách pha: 10 ml NaH2PO4 0,069 g NaCl 0,2925 g Đệm sonication 4: (PBS + DTT: pH 7,2) - Cách pha 50 ml PBS pH 7,2 NaH2PO4.H2O 0,8073 g + 11,7 ml H2O Na2HPO4.12H2O 7,4308 g + 38,3 ml H2O  PBS pH 7.2 - Pha ml DTT 100 mM: Cân 0,0154 g DTT + ml H2O 2X  Lưu ý: DTT sử dụng thêm vào với thể tích sử dụng Tất sonication buffer giữ tủ 4°C, phòng thiết bị nhiệt Phụ lục Hóa chất tinh chế protein tái tổ hợp Cách pha đệm PBS Cách pha lít 1X PBS, chuẩn bị sau: Nước cất 800 ml NaCl 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,24 g Điều chỉnh pH đến 7,4 HCl Thêm nước cất để tổng khối lượng lít Hấp khử trùng (20 phút, 121°C) Bảo quản nhiệt độ phòng Wash buffer (pha 10 ml) Imidazol 25 mM 0,25 ml PBS pH 7,4 10 ml Elution buffer: Imidazol 250 mM Imidazol 2,5 ml PBS pH 7,4 10 ml Sodium phosphate M (NaH2PO4.H2O) Equilibration buffer Sodium phosphate 20 mM Sodium chloride 300 mM ... Xác định điều kiện biểu thích hợp Escherichia coli cho bacteriocin Dlazu6 có tiềm kháng ung thư từ Dorea longicatena bước đầu tinh chế bacteriocin Dlazu6  Nội dung nghiên cứu - Khảo sát điều. .. -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN THÍCH HỢP TRONG Escherichia coli CHO BACTERIOCIN DLAZU6 CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ Dorea longicatena GVHD: PGS.TS Nguyễn Văn... coli BL21, để kiểm tra khảo sát biểu protein Dlazu6 đề tài: Xác định điều kiện biểu thích hợp Escherichia coli cho bacteriocin Dlazu6 có tiềm kháng ung thư từ Dorea longicatena thực hướng dẫn PGS.TS