Xác định điều kiện biểu hiện thích hợp cho bacteriocin cnazu8 có tiềm năng kháng ung thư từ clostridium nexile ttrong escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN THÍCH HỢP CHO BACTERIOCIN CNAZU8 CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ Clostridium nexile TRONG Escherichia coli Giảng viên hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Văn Duy ThS Nguyễn Thị Kim Cúc Sinh viên thực : Trần Thanh Hoàng Mã số sinh viên : 55130646 Khánh Hòa 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN THÍCH HỢP CHO BACTERIOCIN CNAZU8 CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ Clostridium nexile TRONG Escherichia coli GVHD : PGS TS Nguyễn Văn Duy ThS Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH : Trần Thanh Hoàng MSSV : 55130646 Khánh Hòa, tháng 6/2017 i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô giáo Trường Đại học Nha Trang, đặc biệt thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường quan tâm, giảng dạy dìu dắt suốt khóa học 2013 – 2017 Để hoàn thành khóa luận này, nhận giúp đỡ quan tâm của: - PGS TS Nguyễn Văn Duy – người thầy có tâm, gần gũi trực tiếp hướng dẫn truyền đạt nhiều kiến thức quý giá cho - ThS Nguyễn Thị Kim Cúc – cô giáo nhiệt tình luôn bảo, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý trực tiếp hướng dẫn cho - Cử nhân Huỳnh Thị Bích Mai, cử nhân Trần Thị Châu Loan bạn Lục Thị Luyễn, Nguyễn Minh Tân, Huỳnh Ngô Ý Nhi đồng môn bên cạnh giúp đỡ, hướng dẫn động viên - Toàn thể bạn lớp 55CNSH, người bạn đồng hành quan tâm giúp đỡ học tập sống Tôi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ vô giá ấy! Nha Trang, tháng năm 2017 Sinh viên Trần Thanh Hoàng ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG .v LỜI MỞ ĐẦU vii CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ung thư liệu pháp chống ung thư 1.1.1 Tổng quan ung thư 1.1.2 Thực trạng ung thư 1.1.3 Nguyên nhân gây ung thư 1.1.4 Phương pháp điều trị ung thư 1.2 Tình hình nghiên cứu bacteriocin kháng ung thư từ vi sinh vật 1.2.1 Đặc điểm bacteriocin kháng ung thư từ vi sinh vật 1.2.2 Azurin: bacteriocin kháng ung thư điển hình từ Pseudomonas aeruginosa 10 1.2.3 Tình hình nghiên cứu số bacteriocin kháng ung thư khác từ vi sinh vật 12 1.3 Giới thiệu gen cnazu8 từ Clostridium nexile mã hóa bacteriocin có tiềm kháng ung thư tương tự azurin .14 1.3.1 Clostridium nexile 14 1.3.2 Gen cnazu8 (p2seq12) 14 1.4 Biểu tinh chế protein Escherichia coli 15 1.4.1 Hệ thống biểu gen Escherichia coli .15 1.4.2 Vector biểu cho Escherichia coli 16 1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu protein Escherichia coli 17 1.4.4 Tinh chế protein tái tổ hợp Escherichia coli 188 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Vật liệu nghiên cứu 20 2.2.1 Chủng vi sinh vật môi trường nuôi cấy 20 2.2.2 Plasmid 20 iii 2.2.3 Hóa chất sinh học phân tử .22 2.2.4 Máy móc thiết bị chuyên dụng 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Cảm ứng biểu protein Cnazu8 E coli BL21 25 2.3.2 Khảo sát nồng độ IPTG 26 2.3.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy 26 2.3.4 Kỹ thuật điện di biến tính gel polyacrylamide (SDS-PAGE) 27 2.3.5 Phương pháp tăng tính hòa tan protein phá màng tế bào siêu âm 29 2.3.6 Tinh chế protein cột HisPur Ni-NTA 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kiểm tra biểu protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 34 3.2 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm IPTG đến biểu protein GST-6xHis-TEVCnazu8 35 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến biểu protein GST-6xHis-TEVCnazu8 37 3.4 Tăng khả hòa tan protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 phương pháp phá màng tế bào siêu âm 39 3.5 Bước đầu tinh chế protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 E coli BL21 cột HisPur Ni-NTA .40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .43 TÀI LIỆU THAM KHẢO .44 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên đầy đủ aa Acid amin ACP Anticancer peptides APS Amonium Persulphate bp Base pair DDT Dichloro Diphenyl Trichlorothane DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Disodium ethylenediamine tetraacetate FDA Food and Drug Administration Ghi Peptide kháng ung thư Cặp bazơ Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ IARC International Agency for Research on Tổ chức Nghiên cứu Ung Cancer thu Quốc tế IPTG Isopropyl-𝛽-D-thiogalactopyranoside kDa Kilodalton LB Luria Bertani Broth NST Chromosome Nhiễm sắc thể PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis Điện di polyacrylamide PMSF Phenylmethane Sulfonyl Fluoride RE Restriction enzyme RNA Ribonucleic Acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate TEMED tetramethylethylenediamine WHO World Health Organization Enzyme cắt giới hạn Tổ chức Y tế Thế giới v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính chống lại dòng tế bào ung thư khác bacteriocin Bảng 1.2 So sánh đặc điểm protein Cnazu8 azurin 15 Bảng 3.1 Thành phần dung dịch điện di protein 52 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc azurin (128 aa) 11 Hình 1.2 Kết kiểm tra biểu tính tan protein GST-6xHis-TEVChazu5 E coli BL21 .13 Hình 1.3 Tinh protein đích sắc ký lực 18 Hình 2.1 Plasmid tái tổ hợp pET42a(+) mang gen cnazu8 tạo dòng thành công .21 Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu đề tài 24 Hình 2.3 Quá trình biến tính protein SDS 28 Hình 3.1 Kết kiểm tra biểu tính tan protein GST-6xHis-TEVCnazu8 E coli BL21 .34 Hình 3.2 Kết khảo sát biểu tính tan protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 E coli BL21 theo nồng độ IPTG 36 Hình 3.3 Kết khảo sát biểu tính tan protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 E coli BL21 theo nhiệt độ nuôi cấy 37 Hình 3.4 Kết khảo sát tính tan protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 E coli BL21 phương pháp phá màng tế bào siêu âm (sonication) 39 Hình 3.5 Kết bước đầu tinh chế protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 E coli BL21 cột HisPur Ni-NTA .41 vii LỜI MỞ ĐẦU Xã hội ngày đại, y học ngày phát triển tượng nghịch lý có nhiều bệnh xuất Y học phải tham gia vào chạy đua bất đắc dĩ mà luôn nằm bị động Cuộc sống đại, môi trường sống bị ô nhiễm: chất thải công nghiệp, hiệu ứng nhà kính gia tăng nồng độ CO2 khí quyển, chất thải phóng xạ; thay đổi thói quen sinh hoạt, ăn uống người: ăn nhiều thức ăn nhanh, thực phẩm đóng hộp, thực phẩm bẩn không rõ nguồn gốc, tồn dư hóa chất, thói quen sinh hoạt lười vận động, béo phì, thường xuyên sử dụng rượu bia, chất kích thích với gánh nặng, áp lực, stress công việc sống Đó nguyên nhân làm cho người ngày có nhiều bệnh tật Xã hội đại gắn với bệnh thời đại bệnh tim mạch, đái tháo đường, viêm loét dày, bệnh thần kinh, gan, thiếu bệnh ung thư Bệnh ung thư nguyên nhân gây tử vong đứng thứ hai Mỹ, sau bệnh tim mạch Năm 2012, ước tính có 14,1 triệu trường hợp ung thư 8,2 triệu trường hợp tử vong ung thư xảy toàn giới (Lindsey cs, 2015) Năm 2017 Australia, ung thư nguyên nhân gây bệnh, ước tính có 134174 trường hợp ung thư chẩn đoán, trung bình 367 chẩn đoán ngày (Cancer in Australia, 2017) Ở Việt Nam trung bình ngày có 265 người chết ung thư Việt Nam nước đứng thứ Đông Nam Á số lượng người chết ung thư (Bộ Y tế, 2016) Ung thư bệnh nguy hiểm, có tỷ lệ tử vong cao đứng đầu giới tất bệnh mắc phải Mặc dù nỗ lực không ngừng nghỉ y học nhà khoa học, thời điểm chưa có phương pháp điều trị cụ thể ngăn chặn ung thư tái phát Có nhiều phương pháp điều trị ung thư: phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, miễn dịch phối hợp với trình điều trị Phương pháp điều trị ung thư phổ biến phẫu thuật để loại bỏ phần lớn khối u Sau đó, xạ trị để tiêu diệt tế bào ung thư sót lại kết hợp hóa trị liệu lâu dài nhằm ngăn chặn phát triển trở lại tế bào ung thư (Chakrabarty cs, 2014) Tuy nhiên, phương pháp điều trị nhìn chung có hiệu chưa cao, gây đau đớn cho thể, tồn nhiều tác dụng phụ, gây độc tế bào bình thường, cảm ứng khả kháng thuốc tế bào ung thư kích thích tế bào ung thư phát triển Vì vậy, việc tìm kiếm phương pháp, viii hợp chất điều trị ung thư có hiệu cao, hạn chế tác dụng phụ an toàn người bệnh vô cấp thiết Gần đây, số protein peptide vi khuẩn chứng minh có hoạt tính chống ung thư mức tiền lâm sàng nhiều loại tế bào ung thư khác Vì vậy, điều trị ung thư cách tiếp cận sản phẩm từ tự nhiên từ vi sinh vật sống nhận quan tâm đặc biệt Trong số đó, bacteriocin peptide có khả kháng khuẩn tổng hợp ribosome vi khuẩn hứa hẹn sản phẩm chống ung thư hiệu an toàn Azurin bacteriocin vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa báo cáo cho thấy hoạt tính kháng ung thư người giai đoạn thử nghiệm lâm sàng Một giả thuyết đặt liệu sản phẩm khác từ vi khuẩn tương tự azurin có hoạt tính kháng ung thư Bằng phân tích tin sinh học, Nguyen Nguyen (2016) tiến hành sàng lọc gen mã hóa bacteriocin tương tự azurin từ 66 loài vi khuẩn ưu hệ vi sinh vật đường ruột người kết thu 14 bacteriocin giả định tương tự azurin p28-azurin Bacteriocin Cnazu8 14 bacteriocin có tiềm mã hóa gen cnazu8 (p2seq12) từ Clostridium nexile Gần đây, gen cnazu8 tạo dòng thành công E coli BL21, để tiếp tục nghiên cứu gen cnazu8 nhằm thu nhận protein Cnazu8 để thực cho thí nghiệm hoạt tính kháng ung thư chọn đề tài: “Xác định điều kiện biểu thích hợp cho bacteriocin Cnazu8 có tiềm kháng ung thư từ Clostridium nexile Escherichia coli” hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Văn Duy ThS Nguyễn Thị Kim Cúc  Mục tiêu đề tài: xác định điều kiện biểu thích hợp bước đầu tinh chế bacteriocin Cnazu8 có tiềm kháng ung thư từ Clostridium nexile Escherichia coli  Phạm vi nghiên cứu đề tài: Gen cnazu8 mã hóa cho bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ Clostridium nexile sàng lọc từ hệ vi sinh vật đường ruột người tạo dòng thành công E coli BL21 41 khoảng 36,7 kDa, phù hợp với kích thước dự kiến protein mục tiêu, ngoại trừ giếng W5 (Hình 3.5) Điều giải thích: sau lần rửa cột ly tâm nồng độ protein lượng đáng kể, đến lần thứ rửa cột nồng độ protein thấp, chí không nên giếng W5 không xuất vạch protein nào, thấy khác biệt nồng độ protein thu lần rửa cột thứ thứ (giếng W1 W5) Hình 3.5 Kết bước đầu tinh chế protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 E coli BL21 cột HisPur Ni-NTA (M: thang protein chuẩn; S0: protein chưa tinh chế; S1-2: protein thu giai đoạn gắn cột tương ứng lần 1-2; W1, 5: protein thu lần rửa cột thứ 1, thứ 5; E1-3: protein thu tương ứng với lần 1-3 rửa giải protein liên kết với cột His-tag) Trong giếng S1 S2 có xuất vạch protein mục tiêu với nồng độ tương đương không nhiều qua cho thấy liên kết protein mục tiêu với cột His-tag có tính đặc hiệu chưa cao Vì liên kết protein mục tiêu cột His-tag có tính đặc hiệu cao hầu hết protein mục tiêu bị giữ lại cột giai đoạn dịch thu giai đoạn gắn cột không chứa (hoặc có ít) protein mục tiêu Ngoài ra, lượng protein mục tiêu hai giếng S1 S2 ngang chứng tỏ giai đoạn gắn cột lần tính đặc hiệu liên kết protein mục tiêu cột hoàn toàn không có, điều dẫn đến lượng protein mục tiêu dịch thu sau giai đoạn gắn cột lần gần không thay đổi so với giai đoạn gắn cột lần Có thể nhận thấy lượng protein mục tiêu mẫu chưa tinh chế ban đầu 42 không cao (giếng S0) nên lượng protein mục tiêu phân đoạn sau tương đối thấp thể qua vạch protein mờ nhạt Tuy nhiên, lý giải thích cho tính không đặc hiệu protein GST-6xHis-TEV-Cnazu8 biểu E coli BL21 cột His-tag Từ kết bước đầu tinh chế protein mục tiêu (Hình 3.5) cho thấy có hiện protein mục tiêu giai đoạn rửa giải protein liên kết với cột His-tag – phân đoạn sau cột ít, chứng tỏ protein mục tiêu có liên kết với cột (giếng E1-3) Dễ dàng nhận thấy vạch protein mục tiêu sau lần rửa giải giảm dần, nhiên chênh lệch lớn protein mục tiêu sau lần rửa giải thứ Qua cho thấy dung dịch rửa giải sử dụng chưa phù hợp nên lượng lớn protein mục tiêu liên kết với cột His-tag sau lần rửa giải thứ tiếp tục bị ly giải lần rửa giải Mặc khác, protein sau rửa cột gần thay đổi so với trước tinh chế, có vạch protein bị mờ giảm nồng độ so với ban đầu, dễ dàng nhận thấy điều qua giếng S0, S1 E1 (Hình 3.5) Qua kết luận có liên kết protein mục tiêu GST-6xHis-TEV-Cnazu8 biểu E coli BL21 với cột His-tag chưa đặc hiệu Vì vậy, cần tiếp tục khảo sát yếu tố nồng độ muối, nồng độ Imidazole để liên kết protein mục tiêu cột đặc hiệu Tuy nhiên, hạn hẹp mặt thời gian số khó khăn nghiên cứu nên chưa tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến liên kết protein mục tiêu cột 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận Đã biểu thành công bacteriocin Cnazu8 từ Clostridium nexile dạng protein dung hợp GST-6xHis-TEV-Cnazu8 E coli BL21 Kết biểu kiểm tra phương pháp SDS-PAGE Đã khảo sát điều kiện phù hợp để biểu gen cnazu8 chủng E coli BL21 tái tổ hợp quy mô phòng thí nghiệm Đó là: nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,1 mM; nhiệt độ biểu 37oC Đã nghiên cứu tăng khả hòa tan protein Cnazu8 phương pháp siêu âm giai đoạn phá màng tế bào Kết tinh chế bước đầu cho thấy protein dung hợp GST-6xHis-TEVCnazu8 gắn chưa đặc hiệu lên cột Ni-NTA  Kiến nghị Để tiếp tục hướng nghiên cứu trên, có số kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu nâng cao hiệu suất biểu protein tái tổ hợp Cnazu8 biểu E coli BL21 dạng hòa tan Tiếp tục tinh chế thu hồi protein tái tổ hợp Cnazu8 đặc hiệu từ tế bào E coli từ vật chủ khác, từ thử hoạt tính kháng ung thư protein 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002) Vi sinh vật học NXB Giáo Dục Nguyễn Văn Duy (2016) Tạo dòng biểu bacteriocin Chazu5 tương tự azurin kháng ung thư Escherichia coli Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Nghiên cứu Giảng dạy Sinh học Việt Nam lần thứ hai NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 955-962 Nguyễn Hữu Đống (2002) Di truyền phân tử kỹ thuật gen NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Nguyễn Bá Đức (2001) Bài giảng Ung thư học NXB Y học Hà Nội Trần Thị Châu Loan (2016) Tách dòng biểu gen cnazu8 (p2seq12) mã hóa bacteriocin có tiềm kháng ung thư từ Clostridium nexile Escherichia coli Khóa luận tốt nghiệp đại học, Trường Đại học Nha Trang Nguyễn Hoàng Lộc (2007) Nhập môn Công nghệ Sinh học NXB Đại học Huế Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2007) Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Phùng Phướng, Nguyễn Văn Cầu, Nguyễn Trần Thúc Huân (2013) Ung thư học đại cương NXB Đại học Y dược Huế Lê Đình Sáng (2010) Bệnh học Ung thư NXB Đại học Y khoa Hà Nội  Tài liệu Tiếng Anh 10 American Cancer Society (2010) The Global Economy Cost of Cancer 11 Apiyo D and Wittung-Stafshede P (2005) Unique complex between bacterial azurin and tumor- suppressor protein p53 Biochem Biophys Res Commun, 332, 965-968 12 Arsenio M Fialho, Nuno Bernardes, and Ananda M Chakrabarty (2016) Exploring the anticancer potential of the bacterial protein azurin AIMS Microbiology, 2, 292-303 13 Australian Institute of health and Welfare Canberra (2017) Cancer in Australia 2017, Cancer series number 101 Australasian Association of Cancer Registries 45 14 Bernardes N, Chakrabarty AM, Fialho AM (2013) Engineering of bacterial strains and their products for cancer therapy Appl Microbiol Biotechnol, 97, 5189-5199 15 Bhunia A K, Johnson M C, Ray B, and Belden E L (1990) Antigenic property of Pediocin AcH produced by Pediococcus acidilactici H J Appl Bacteriol, 69, 211-215 16 Blattner F R, Plunkett G, Bloch C A, Perna N T, Burland V, Riley M, ColladoVides J, Glasner JD, Rode CK, Mayhew GF, Gregor J, Davis NW, Kirkpatrick HA, Goeden MA, Rose DJ, Mau B and Shao Y (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science, 277 (5331), 1453–1462 17 Chakrabarty A M, Yamada T, Hiraoka Y, Ikehata M, Kimbara K, Avner BS, Das Gupta TK (2014) Microbial pathogenicity: a new approach to drug development Advances in Experimental Medicine and Biology, 808, 41-49 18 Chaudhari A, Fialho AM, Ratner D, Gupta P, Hong CS, Kahali S, Yamada T, Haldar K, Murphy S, Cho W, Chauhan VS, Das Gupta TK and Chakrabarty (2006) Azurin, Plasmodium falciparum malaria and HIV/AIDS: inhibition of parasitic and viral growth by Azurin Cell Cycle, (15), 1642-1648 19 Cornut G, Fortin C and Soulieres D (2008) Antineoplastic properties of bacteriocins: revisiting potential active agents American Journal of Clinical Oncology, 31 (4), 399-404 20 Cotter P D, Hill C, and Ross R P (2005) Bacteriocins: developing innate immunity for food Nat Rev Microbiol, 3, 777-788 21 Dobrzyńska I, Szachowicz-Petelska B, Figaszewski Z, and Sulkowski S (2005) Changes in electric charge and phospholipid composition in human colorectal cancer cells Mol Cell Biochem, 276, 113-119 22 Farkas-Himsley H and Cheung R (1976) Bacterial proteinaceous products (bacteriocins) as cytotoxic agents of neoplasia Cancer Res, 36, 3561-3567 23 Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin M D, Forman D, Bray F (2015) Cancer incidence and mortality worldwide International Journal of Cancer, 136(5), 359-386 24 Ferlay Jacques, Hai-Rim Shin, Freddie Bray, David Forman, Colin Mathers and Donald Maxwell Parkin (2008) GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and 46 Mortality Worldwide: IARC Cancer Base No 10 Lyon, France: International Agency for Research on Cancer 25 Garraway L A and Lander E S (2013) Lessons from the cancer genome Cell, 153, 17-37 26 Goto M, Yamada T, Kimbara K, Horner J, Newcomb M, Gupta TK, Chakrabarty AM (2002) Induction of apoptosis in macrophages by Pseudomonas aeruginosa azurin: tumour-suppressor protein p53 and reactive oxygen species, but not redox activity, as critical elements in cytotoxicity Mol Microbiol, 47, 549-559 27 Hoskin W D and Ramamoorthy A (2008) Studies on Anticancer Activities of Antimicrobial Peptides Biochim Biophys Acta, 1778(2), 357-375 28 Jennsen H, Hamill P and Hancock R E W (2006) Peptide antimicrobial agents Clin Microbiol Rev, 19, 491-511 29 Jia L, Gorman GS, Coward LU, Noker PE, McCormick D, Horn TL, Harder JB, Muzzio M, Prabhakar B, Ganesh B, Das Gupta TK, Beattie CW (2011) Preclinical pharmacokinetics, metabolism, and toxicity of azurin-p28 (NSC745104) a peptide inhibitor of p53 ubiquitination Cancer Chemother Pharmacol, 68, 513-524 30 Joo NE, Ritchie K, Kamarajan P, Miao D and Kapila YL (2012) Nisin, an apoptogenic bacteriocin and food preservative, attenuates HNSCC tumorigensis via CHAC1 Cancer Medicine, (3), 295-305 31 Kaur Sumanpreet and Kaur Sukhraj (2015) Bacteriocins as Potential Anticancer Agents Frontiers of Microbiology 6, 1-11 32 Lee S J and Lee S Y (2002) Efficient high-level production of spider silk protein by fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli and its purification Theories and Applications of Chem Eng, 8, 246-359 33 Lindsey Torre, Rebecca Siegle, Ahmedin Jemal (2015) Global Cancer Facts & Figures, 3th Edition World Health Organizaton 34 Lulla RR, Goldman S, Yamada T, Beattie CW, Bressler L, Pacini M, Pollack IF, Fisher PG, Packer RJ, Dunkel IJ, Dhall G, Wu S, Onar A, Boyett JM, Fouladi M (2016) Phase I trial of p28 (NSC745104), a non-HDM2mediated peptide inhibitor of p53 ubiquitination in pediatric patients with 47 recurrent or progressive central nervous system tumors: a pediatric brain tumor consortium study Neuro Oncol, 47, 1-7 35 Makrides S C (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli Microbiol Rev, 60 (3), 512-538 36 Mehta RR, Yamada T, Taylor BN, Christov K, King ML, Majumdar D, Lekmine F, Tiruppathi C, Shilkaitis A, Bratescu L, Green A, Beattie CW, Das Gupta TK (2011) A cell penetrating peptide derived from azurin inhibits angiogenesis and tumor growth by inhibiting phosphorylation of VEGFR-2, FAK and Akt Angiogenesis, 14, 355-369 37 Nguyen C and Nguyen VD (2016) Discovery of azurin-like anticancer bacteriocins from human gut microbiome through homology modeling and molecular docking against the tumor suppressor p53 Biomed Res Int, 2016, 112 38 Nguyen VD and Nguyen HHC (2015) Molecular screening of Azurin-like anticancer bacteriocins from human gut microfora using bioinformatics Advances in Intelligent Systems and Computing, 358, 219-229 39 Piserchio A, Ghose R, and Cowburn D (2009) Optimized bacterial expression and purification of the c-Src catalytic domain for solution NMR studies J Biomol NMR, 44 (2), 87-93 40 Punj V, Bhattacharyya S, Saint-Dic D, Vasu C, Cunningham EA, Graves J, Yamada T, Constantinou AI, Christov K, White B, Li G, Majumdar D, Chakrabarty AM, Das Gupta TK (2004) Bacterial cupredoxin azurin as an inducer of apoptosis and regression in human breast cancer Oncogene, 23, 2367-2378 41 Raguz S and Yagüe E (2008) Resistance to chemotherapy: new treatments and novel insights into an old problem Brit J Cancer, 99, 387-391 42 Riedl S, Rinner B, Asslaber M, Schaider H, Walzer S, Novak A, Lohner K, Zweytick D (2011) In search of a novel target-Phosphatidylserine exposed by non-apoptotic tumor cells and metastases of malignancies with poor treatment efficacy Biochim Biophys Acta, 1808, 2638-2645 48 43 Sahdev S, Khattar S K and Saini K S (2008) Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies Mol Cell Biochem, 307 (1-2), 249-264 44 Schneider K (2001) Counseling about cancer: Strategies for genetic counseling New York: John Wiley and Sons 45 Schweizer F (2009) Cationic amphiphilic peptides with cancer-selective toxicity Eur J Pharmacol, 625, 190-194 46 Taylor BN, Mehta RR, Yamada T, Lekmine F, Christov K, Chakrabarty AM, Green A, Bratescu L, Shilkaitis A, Beattie CW, Das Gupta TK (2009) Noncationic peptides obtained from azurin preferentially enter cancer cells Cancer Res, 69, 537-546 47 Utsugi T, Schroit A J, Connor J, Bucana C D and Fidler I J (1991) Elevated expression of phosphatidylserine in the outer membrane leaflet of human tumor cells and recognition by activated human blood monocytes Cancer Res, 51, 3062-3066 48 Volontè F, Marinelli F, Gastaldo L, Sacchi S, Pilone M S, Pollegioni L and Molla G (2008) Optimization of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase expression in E coli Protein Expr Purif, 61 (2), 131-137 49 Warso MA, Richards JM, Mehta D, Christov K, Schaeffer C, Rae Bressler L, Yamada T, Majumdar D, Kennedy SA, Beattie CW, Das Gupta TK (2013) A first-in-class, first-in-human, phase I trial of p28, a non-HDM2-mediated peptide inhibitor of p53 ubiquitination in patients with advanced solid tumours Br J Cancer, 108, 1061-1070 50 World Health Organization (2011) An overview of the evidence on environmental and occupational determinants of cancer Environmental and Occupational Determinants of Cancer: Interventions for Primary Prevention 51 Yamada T, Christov K, Das Gupta T K, Beattie C W (2011) Mechanism of action of p28, a first-in-class, non-HDM2 mediated peptide inhibitor of p53 ubiquitination Br J Cancer, 108(12), 2495-2504 52 Yamada T, Goto M, Punj V, Zaborina O, Chen ML, Kimbara K, Majumdar D, Cunningham E, Das Gupta TK, Chakrabarty AM (2002) Bacterial redox protein azurin, tumor suppressor protein p53, and regression of cancer 49 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99 (22), 14098-14103 53 Yamada T, Hiraoka Y, Ikehata M, Kimbara K, Avner BS, Das Gupta TK, Chakrabarty AM (2004) Apoptosis or growth arrest: modulation of tumor suppressor p53’s specificity by bacterial redox protein azurin Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101 (14), 4770-4775 54 Yin J, Li G, Ren X and Herrler G (2007) Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes J Biotechnol, 127 (3), 335-347 55 Zacharof M P and Lovitt R W (2012) Bacteriocins produced by lactic acid bacteria APCBEE Procedia, 2, 50-56 PHỤ LỤC Phụ lục Môi trường nuôi cấy Môi trường LB Cách pha 100 ml môi trường: cân 3,5 gram môi trường LB cho 100 ml nước cất, hòa tan hoàn toàn hấp khử trùng 121oC 15 phút Sau chờ nhiệt độ môi trường khoảng 40ºC – 50ºC bổ sung kháng sinh kanamycine để đạt nồng độ 30 µg/ml Phụ lục Hóa chất điện di SDS-PAGE Monomere solution( 40%) Acrylamide (FW 71,08) 10 g Bis-acrylamide (FW 154,2) 0,2 g Nước cất 25 ml Giữ tháng tối 4oC (Acrylamide chất độc thần kinh, thao tác phải cẩn thận) Resolving gel buffer 4X (0,5 M Tris HCl, pH 8,8) Tris base (FW 121,1) 1,815 g Nước cất thêm 7,5 ml Chỉnh pH 8,8 với HCl đậm đặc Thêm nước cất đến 10 ml Giữ tháng tối 4oC Stacking gel buffer 4X (0,5 Tris HCl, pH 6,8) Tris base (FW 121,1) 1,5 g Nước cất thêm 20 ml Chỉnh pH 6,8 với HCl đậm đặc Thêm nước cất đến 25 ml Giữ tháng tối 4oC SDS 10% SDS 2,5 g Nước cất 25 ml Giữ tháng nhiệt độ phòng Ammonium persulfate Ammonium persulfate 0,2 g Nước cất ml Pha để dùng không để lại Treatment buffer 2X 4X Stacking gel buffer 2,5 ml SDS 10% ml Glycerol ml Dithiothreitol (DTT) ( FW 154,2) 0,31 g Bromophenol Blue 0,002 g Thêm nước cất 10 ml Chia nhỏ thành thể tích 0,5 ml giữ tháng – 20oC Tank buffer (0,025 M Tris HCl; 0,192 M Glycine; 0,1% SDS; pH 8,3) Tris (FW 121,1) 3,028 g Glycine 14,413 g SDS 1g Nước cất lít Giữ tháng nhiệt độ phòng Resolving gel 15% Monomere 40% 3,8 ml 4X Resolving gel 2,5 ml SDS 10% 0,1 ml Nước cất 3,6 ml APS 10% 100 µl TEMED 10 µl Stacking gel 5% Monomere 40% 1,3 ml 4X Stacking gel 2,5 ml SDS 10% 0,1 ml Nước cất 6,2 ml APS 10% 50 µl TEMED 10 µl Bảng 3.1 Thành phần dung dịch điện di protein Gel gom 5% Gel phân tách 15% (Stacking gel) (Resolving gel) Nước cất 6,2 ml 3,6 ml Monomer solution 40% 1,3 ml 3,8 ml 4X Resolving gel buffer (pH 8,8) - 2,5 ml 4X Stacking gel buffer (pH 6,8) 2,5 ml - SDS 10% 0,1 ml 0,1 ml APS 10% 50 µl 100 µl TEMED 10 µl 10 µl Thành phần 10 Dung dịch nhuộm gel (Staining solution) Coomassie Brilliant Blue G- 250 0,025 g Methanol 40 ml Acid acetic 10 ml Bổ sung nước cất vừa đủ 100 ml 11 Dung dịch rửa màu Methanol 40 ml Acid acetic 10 ml Nước cất vừa đủ 100 ml 12 Thuốc thử Bradford Hòa tan 0,01 g Coomassive Brilliant Blue G-250 vào ml ethanol 96%, sau thêm 10 ml H3PO4 85% định mức lên đến 100 ml nước cất Phụ lục Đệm ly giải Cách pha 100 ml đệm ly giải màng tế bào (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM NaCl; mM mercaptoethanol; sau thêm lysozym với nồng độ đạt mg/ml) Pha stock: + Tris-HCl pha nồng độ 0,5 M, NaCl pha nồng độ M, lysozym pha nồng độ 10 mg/ml + Tris-HCl 0,5 M: cân 0,6 g Tris-HCl thêm 10 ml nước cất lần, hòa tan, khử trùng 121°C 20 phút + NaCl 1M: Cân 0,585 g thêm 10 ml nước cất lần, hòa tan, khử trùng 121°C 20 phút + Pha lyzozyme 10 mg/ml: Cân 50 mg lysozyme hòa tan ml nước cất lần, lọc vô trùng màng lọc vô khuẩn Phụ lục Kháng sinh Cách pha kháng sinh stock gốc 50 mg/m1 muốn pha thành 30 µg/ml (1X) ta tiến hành pha stock 100X mg/ml cách cho 60 µl stock kanamycine gốc bổ sung thêm 940 µg/ml nước cất 2X, vừa đủ ml Phụ lục Hóa chất làm tăng khả hòa tan protein Lysis buffer Nước cất 400 ml NaH2PO4 50 mM 2,4 g NaCl 500 mM 11,7 g Imidazol 10 mM 0,27232 g Triton X–100 pH 7,8 0,8 g Lysis buffer Nước cất 400 ml NaH2PO4 50 mM 2,4 g NaCl 300 mM 7,02 g Imidazol 10 mM 0,27232 g Triton X–100 pH 7,8 0,8 g Pha PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) 100 mM (pha 50 𝝁l) PMSF 0,87095 g Nước cất 50 𝜇l Đệm sonication 1: (50 mM NaH2PO4.H2O; 300 mM NaCl; 10 mM imidazole; pH 8) - Cách pha 20 ml sonication NaH2PO4.H2O 0,138 g NaCl 0,351 g Imidazole 0,2 ml imidazole M Thêm 15 ml nước cất 2X, điều chỉnh pH đến 8, thêm nước vào vừa đủ 20 ml Đệm sonication 2: (NaCl 500 mM; glycerol 5%; Tris HCl 30 mM; pH 8) - Cách pha 10 ml sonication buffer NaCl 0,2925 g Glycerol 5% Tris HCl M 0,3 ml Đệm sonication 3: (50 mM NaH2PO4.H2O; 500 mM NaCl; pH 8) - Cách pha: 10 ml NaH2PO4.H2O 0,069 g NaCl 0,2925 g Đệm sonication 4: (PBS + DTT: pH 7,2) - Cách pha 50 ml PBS pH 7,2 NaH2PO4.H2O 0,8073 g + 11,7 ml H2O Na2HPO4.12H2O 7,4308 g + 38,3 ml H2O  PBS pH 7,2 - Pha ml DTT 100 mM Cân 0,0154 g DTT + ml H2O 2X  Lưu ý: DTT sử dụng thêm vào với thể tích sử dụng Tất sonication buffer giữ tủ 4oC, phòng thiết bị nhiệt Phụ lục Hóa chất tinh chế protein tái tổ hợp Cách pha đệm PBS Cách pha lít 1X PBS, chuẩn bị sau: Nước cất 800 ml NaCl 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,24 g Điều chỉnh pH đến 7,4 HCl Thêm nước cất để tổng khối lượng l Hấp khư trùng (20 phút, 121°C) Bảo quản nhiệt độ phòng Wash buffer (pha 10 ml) Imidazol 25 mM 0,25 ml PBS pH 7,4 10 ml Elution buffer: Imidazol 250 mM Imidazol 2,5 ml PBS pH 7,4 10 ml Sodium phosphate M (NaH2PO4.H2O) Equilibration buffer Sodium phosphate 20 mM Sodium chloride 300 mM ... HỌC & MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN THÍCH HỢP CHO BACTERIOCIN CNAZU8 CÓ TIỀM NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ Clostridium nexile TRONG Escherichia coli GVHD : PGS TS Nguyễn Văn Duy... cho thí nghiệm hoạt tính kháng ung thư chọn đề tài: Xác định điều kiện biểu thích hợp cho bacteriocin Cnazu8 có tiềm kháng ung thư từ Clostridium nexile Escherichia coli hướng dẫn PGS.TS Nguyễn... tài: xác định điều kiện biểu thích hợp bước đầu tinh chế bacteriocin Cnazu8 có tiềm kháng ung thư từ Clostridium nexile Escherichia coli  Phạm vi nghiên cứu đề tài: Gen cnazu8 mã hóa cho bacteriocin