TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN và TINH CHẾ HFGF 2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR 2) tái tổ hợp từ ESCHERICHIA COLI 1

Tổng quan tài liệu CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU -3- Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu 1.1 HỌ NHÂN TỐ TĂNG TRƢỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF (FIBROBLAST GROWTH FACTOR) 1.1.1 Giới thiệu chung Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF đƣợc Armelin tìm thấy dịch chiết tuyến yên vào năm 1973 Năm 1974, Gospodarowicz công bố nghiên cứu tìm thấy nhân tố tăng trƣởng dịch chiết não bò Nghiên cứu tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học kết luận protein đƣợc tìm thấy có tác dụng làm tăng sinh nguyên bào sợi Sau đó, Gospodarowicz tinh chế phân đoạn dịch chiết đƣợc tìm thấy pH acid basic Thí nghiệm cô lập đƣợc hai dạng FGF khác tƣơng ứng với phân đoạn pH Nhân tố tăng trƣởng thu nhận đƣợc pH acid đƣợc gọi FGF-1 nhân tố tăng trƣởng thu nhận pH bazơ đƣợc gọi FGF-2 Hai loại protein có độ tƣơng đồng cao trình tự amino acid Hiện nay, 20 thành viên họ nhân tố tăng trƣởng FGF đƣợc tìm thấy nghiên cứu cấu trúc, hoạt tính… để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác [5, 8] Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi (FGF) đƣợc tìm thấy nhiều loài, từ giun tròn đến ngƣời Ở động vật có xƣơng sống, 20 thành viên họ nhân tố tăng trƣởng FGF đƣợc tìm thấy với khối lƣợng phân tử từ 17 đến 34 kDa Có 18 loại nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi (FGF1–FGF10 and FGF16–FGF23) đƣợc phân vào sáu họ nhỏ dựa vào tƣơng đồng trình tự nhƣ phát sinh giống loài: FGF1 FGF2; FGF3, FGF7, FGF10, FGF22; FGF4, FGF5 FGF6; FGF8, FGF17và FGF18; FGF9, FGF16 FGF20; FGF19, FGF21 FGF23 Những nhân tố FGFs không đƣợc xếp vào họ (FGF11-FGF14) có tƣơng đồng trình tự cao với họ FGF nhƣng không gắn đƣợc lên thụ thể FGF không đƣợc coi thành viên họ FGF (nhƣ FGF15 tìm thấy chuột dạng tƣơng đồng với FGF19 ngƣời) FGF hầu hết nhân tố cận tiết (paracrine), có vai trò hình thành mô quan giai đoạn phát triển phôi (năm phân họ FGF nằm nhóm này) Ngƣợc lại, phân họ cuối gồm FGF19, FGF21, FGF23 có vai trò -4- Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu nhƣ nhân tố nội tiết (endocrine), có vai trò điều hòa cân acid mật, cholesterol, glucose, vitamin D phosphate thể [6] Phần lớn gen fgf nằm rải rác toàn gen Ở ngƣời, 22 gen fgf vị trí chúng (trừ FGF-16) đƣợc xác định Nhiều gen protein FGF đƣợc nhóm lại nhiễm sắc thể, ví dụ nhƣ FGF-3, FGF-4 FGF-19 có gen nằm nhiễm sắc thể số 11, cánh dài, cách lần lƣợt 40 10kb Điều cho thấy gen mã hóa cho họ protein FGF đƣợc tạo nên chế nhân đôi, chuyển vị gen nhiễm sắc thể trình tiến hóa [8, 18] Họ nhân tố tăng trƣởng FGF tƣơng đồng cao trình tự amino acid (13-71%) mà cấu trúc gen chúng đƣợc bảo tồn cao loài động vật có xƣơng sống Các protein thuộc họ nhân tố tăng trƣởng có lực cao với heparan sulfate proteoglycan Sự tƣơng tác với heparan sulfate giúp hoạt hóa bốn loại receptor FGF bề mặt tế bào [7, 17] Hình 1.1 Sơ đồ thành phần chuỗi polypeptide FGF [8] Tất FGF có peptide tín hiệu Tuy nhiên, FGF9, 16 20 đƣợc tiết thông qua mạng lƣới nội chất máy golgi; FGF1 FGF2 đƣợc tiết theo đƣờng riêng biệt độc lập Các họ FGFs có vùng lõi tƣơng đồng bao gồm 120 – 130 amino acids xếp trật tự tạo thành 12 phiến β không song song (β1β12) nối với đầu carboxyl amino Vị trí gắn Heparan sulphate glucosaminoglycan (HSGAG) gọi HBS nằm bên lõi FGF bao gồm vòng nối β1-β2 phần cầu nối β10-β12 Đối với FGFs cận tiết, -5- Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu nhân tố hình thành HBS bề mặt tích điện dƣơng giáp Ngƣợc lại, HBS phân họ FGF19, 21 23 chứa trình tự hình thành vòng nối β1-β2 phần cầu nối β10-β12 làm hạn chế vùng HSGAG gắn lên lõi FGF, nên phân họ đƣợc tạo theo chế nội tiết [6] Họ nhân tố tăng trƣởng FGF họ protein đa chức Trong trình phát triển phôi, FGF có nhiều vai trò điều hòa tăng sinh tế bào, di chuyển biệt hóa Trong thể trƣởng thành, họ protein FGF yếu tố cân nội môi Ngoài họ protein có chức sửa chữa mô, đáp ứng với tổn thƣơng Một nhóm nhỏ protein thuộc họ FGF biểu mô trƣởng thành có vai trò quan trọng dẫn truyền tín hiệu thần kinh hệ thần kinh trung ƣơng ngoại vi Tuy nhiên, biểu bất thƣờng, nhân tố tăng trƣởng gây ung thƣ [5, 8] Bảng 1.1 Các chức họ nhân tố FGF [34] Chức Phân họ Tế bào đích Tăng sinh tế bào FGF-1, FGF-2 Tế bào mỡ tiền thân Tế bào biểu mô, tế bào nội mô, tế bào gốc thần kinh FGF-4 Tế bào gốc phôi FGF-7, FGF-10 Tế bào biểu mô FGF-18 Tế bào tạo xƣơng, tế bào sụn, hủy cốt bào Sự di trú tế bào Sự biệt hóa tế bào FGF-2 Tế bào thần kinh đệm, tế bào FGF-4 Tế bào FGF7 Tế bào nội mô, tế bào sừng FGF8 Tế bào mào thần kinh FGF1, FGF2 Tế bào thần kinh biểu mô FGF7 Tế bào sừng -6- Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Sự hình thành mạch FGF20 Tế bào gốc khỉ FGF1, FGF2 Tế bào biểu mô 1.1.2 Nhân tố tăng trƣởng FGF-2 1.1.2.1 Cấu trúc nhân tố tăng trƣởng FGF-2 Hình 1.2 Cấu trúc gene mã hóa protein FGF-2[17] Gen mã hóa FGF-2 ngƣời nằm vùng q26-27 nhiễm sắc thể số Gen dài khoảng 71kb gồm vùng không dịch mã 5’UTR (Untranslated Region), exon, intron vùng không dịch mã lớn 3’UTR (hình 1.2) Vùng không dịch mã 5’UTR 3’UTR chứa yếu tố điều hòa biểu nhân tố tăng trƣởng FGF-2, mật độ tế bào, chất dẫn truyền thần kinh, đƣờng truyền tín thứ cấp…[17, 20] -7- Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Hình 1.3 Cấu trúc ba chiều FGF-2[6] FGF-2 có hình dạng gần giống với hình chóp tam giác Mỗi mặt bên hợp thành hai chuỗi β Ba mặt bên hình chóp hình thành khoang trống sáu chuỗi β song song ngƣợc chiều tạo thành Phần đáy hình chóp gồm thêm sáu chuỗi β Nhƣ vậy, toàn phân tử FGF-2 đƣợc cấu tạo 12 chuỗi β xếp song song ngƣợc chiều (hình 1.3) FGF-2 đƣợc tìm thấy lần dạng protein có 146 amino acid với trọng lƣợng phân tử khoảng 16,5kDa đƣợc phân lập từ tuyến yên Khi cDNA FGF-2 đƣợc tạo dòng, codon AUG đƣợc xác định nhƣ codon mở đầu cho trình dịch mã cho protein gồm 155 amino acid Ngoài không tìm thấy codon AUG khác thƣợng nguồn mRNA Vì vậy, codon AUG đƣợc cho codon mở đầu cho trình dịch mã Tuy nhiên, dựa vào trình tự cDNA tìm thấy não lợn, não chuột, gan, phôi ngƣời, tuyến tiền liệt số tế bào đƣợc nuôi cấy khác, ngƣời ta nhận thấy phân tử FGF-2 thực tế có dài ngắn kích trƣớc Các dạng có ngắn đƣợc cho kết việc phân giải dạng 155 amino acid Các dạng dài có trọng lƣợng phân tử lớn (196, 201, 210 amino acid) đƣợc chứng minh thông việc phân tích phiên mã/dịch mã in vitro Và kết cho thấy codon CUG đầu 5’ so với codon AUG (vị trí khởi đầu phiên mã dạng FGF-2 gồm 155 amino acid) đƣợc sử dụng làm codon mở đầu cho trình dịch mã dạng FGF-2 có trọng lƣợng phân tử lớn [4, 5, 11] -8- Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Kết trình dịch mã tạo dạng protein FGF-2 khác với trọng lƣợng phân tử đặc điểm khác Khi cDNA FGF-2 đƣợc biểu tế bào, dạng mở đầu codon AUG có trọng lƣợng phân tử thấp (LMW) 18kDa Dạng lại đƣợc mở đầu codon CUG có trọng lƣợng phân tử cao (HMW) lần lƣợt 22; 22,5; 24; 34kDa [23] Hình 1.4 Các dạng FGF-2 tạo thành [23] Sự khác biệt cấu trúc FGF-2 có trọng lƣợng phân tử lớn với FGF-2 có trọng lƣợng 18kDa kéo dài đầu N Dạng trọng lƣợng phân tử lớn có chứa chín trình tự lặp lại Gly-Arg (hình 1.4) Trong đó, sáu arginines motif Glu-Arg đƣợc methyl hóa Chƣa có nghiên cứu ảnh hƣởng trình tự arginines đƣợc methyl hóa nhƣng ảnh hƣởng đến di chuyển hay lại nhân FGF-2 vận chuyển qua màng nhân Điều lý giải phần nguyên nhân FGF-2 trọng lƣợng phân tử thấp tồn chủ yếu tế bào chất có vai trò tác động theo chế cận tiết (paracrine) tự tiết (autocrine) Trong đó, FGF-2 trọng lƣợng phân tử cao tồn nhân, tiểu phần ribosom có vai trò tác động theo chế nội tiết (endocrine) [7, 19, 21] Kết gióng cột trình tự amino acid FGF-2 FGF-1 cho thấy có độ tƣơng đồng cao trình tự amino acid (53%), đó, dạng gấp cuộn hai phân tử -9- Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu giống Ngoài ra, amino acid bảo tồn họ protein FGF đƣợc tìm thấy vùng lõi FGF-2 Điều củng cố thêm dự đoán thành viên khác thuộc họ protein FGF có cấu trúc tƣơng tự với FGF-2 [6, 21] Các vị trí tích điện dƣơng (Lys-138, Lys-134, Lys-128, Arg-129, Lys-144) protein FGF-2 đƣợc xác định vị trí gắn heparin protein FGF Vị trí gắn receptor protein đƣợc tạo thành nhờ đoạn peptide 115-124 (chứa Tyr-123 and Trp-124) protein FGF-2 Trên cấu trúc không gian chiều, phân tử FGF có hai gốc cysteine (Cys-78 Cys-96) đƣợc lộ hai gốc cysteine khác (Cys-34 Cys -101) đƣợc quay vào phía bên lõi kị nƣớc Do đó, bốn cysteine tạo thành hai cầu nối diusulfide Tuy nhiên, phân tích cấu trúc tinh thể khoảng cách hai cặp cysteine xa để hình thành cầu nối bội phân tử nhƣng có khả hình thành cầu nối liên phân tử [7, 19] Phân tử FGF-2 tích điện dƣơng vị trí Lys (vị trí gắn với heparin), sinh lƣợng phân tử, làm cấu trúc protein không ổn định Những phân tử tích điện âm nhƣ heparin tƣơng tác với vị trí này, làm cho FGF-2 trở nên ổn định hơn, bảo vệ FGF-2 chống lại tác động nhiệt độ, pH nhƣ tác động protease Do đó, kết luận rằng, gốc sulfate heparin giúp ổn định hoạt tính FGF-2 Hơn nữa, có ion sulfate tồn dung dịch, gắn vào vị trí lysine FGF đóng vai trò giúp ổn định hoạt tính protein giống nhƣ heparin Tuy nhiên, ion sulfate heparin không ngăn đƣợc việc hình thành cầu nối disulfide nội/ngoại phân tử cystein tự protein Ngoài ra, có khả tƣơng tác đặc hiệu với heparin nên chất thƣờng đƣợc sử dụng để tinh chế FGF-2 phƣơng pháp sắc kí lực [25, 32] Sự tƣơng tác heparin FGF-2 làm phân tử gắn lại với tạo cấu trúc dimer tetramer Cơ chế heparin đóng góp vào việc hoạt hóa receptor FGF-2 chƣa đƣợc biết rõ Sự dimer hóa FGF-2 điều kiện cần thiết để FGF-2 gắn hoạt hóa receptor chúng Heparin phân tử glycoaminoglycan đƣợc sulfate hóa Một đơn vị heparin disaccharide chuỗi - 10 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu heparin bao gồm phân tử L-iduronic acid (Idu) D-glucosamine (GlcN) nối với cầu nối α(1-4) glycoside (hình 1.5) Một đơn vị heparin disaccharide có nhóm sulfate, nhóm sulfate liên kết với gốc 2-hydroxyl Idu hai nhóm sulfate lại liên kết với nhóm 2-amino 6-hydroxyl GlcN Heparin có dạng chuỗi xoắn quay bên phải đơn vị cấu tạo nên chuỗi heparin lệch góc 180o [25, 32] Hình 1.5 Đơn vị heparin saccharide chuỗi heparin [32] Các nghiên cứu cho thấy, chuỗi bên nhóm amino acid Asn-27, Arg-120, Lys-125 tạo thành cầu nối hydrogen với nhóm sulfate liên kết với gốc 2-hydroxyl chuỗi heparin [25] Ngoài tác dụng tƣơng tác với FGF-2 để tạo cấu trúc dimer tetramer giúp FGF-2 gắn với receptor với lực cao hơn, heparin bảo vệ nhân tố tăng trƣởng FGF-2 khỏi bất hoạt nhiệt acid phân giải protein (hình 1.6) [25] FGF-2 có điểm đẳng điện pI = 9,6 Nhiều nghiên cứu gần cho thấy FGF-2 bền pH [25] Với giá trị pI cực đoan nhƣ nên việc tinh chế FGF-2 sắc kí trao đổi ion dễ dàng so với protein có pI gần pH trung tính - 11 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Hình 1.6 Cấu trúc dimer dạng cis (a), dimer dạng trans (b) tetramer (c) FGF (hình tròn)và chuỗi heparin [25] 1.1.2.2 Hoạt tính sinh học FGF-2 FGF-2 nhân tố tăng trƣởng đa chức năng, có vai trò tăng sinh, di chuyển biệt hóa tế bào FGF-2 kích thích tăng sinh nguyên bào sợi, nguyên bào cơ, nguyên bào xƣơng, tế bào thần kinh, tế bào nội mô, tế bào sừng… Trong phôi sớm, FGF-2 có vai trò biệt hóa mô ngoại phôi bì thành mô trung phôi, trì tính đa tế bào FGF-2 có vai trò quan trọng trình hình thành mạch máu nhờ khả tăng sinh tế bào nội mô mạch máu, chữa lành vết thƣơng sửa chữa mô FGF-2 chất kích thích phân bào mạnh nhiều loại tế bào có nguồn gốc từ trung phôi bì thần kinh ngoại bì Ở cấp độ hệ quan, FGF-2 đóng vai trò quan trọng phát triển hệ quan khác (bảng 1.2) FGF2 kích thích nguyên bào sợi tăng sinh tạo mô hạt lấp đầy khoảng trống vết thƣơng gây trình làm lành vết thƣơng FGF-2 tiết tế bào nội mô lót bên thành mạch tác động theo chế autocrine kích thích tế bào nội mô thành mạch phân bào, tổ chức tế bào tạo thành theo cấu trúc dạng hình ống đóng vai trò chất hóa hƣớng động giúp hình thành mạch máu [4, 11, 34] Gần đây, tìm thấy nhiều chất kích thích tế bào nội mô phân bào với khối lƣợng phân tử 13-18kDa, có lực cao với heparin điểm đẳng điện basic Những chất kích thích phân bào bao gồm nhân tố tăng trƣởng tế bào hình sao, nhân tố tăng trƣởng gắn β heparin nhân tố tăng trƣởng từ tế bào máu, sụn, võng mạc, đại thực bào, vùng dƣới đồi… dạng FGF-2, khác đầu N Quá - 12 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu trình xử lý nhân tố tăng trƣởng FGF-2 mô khác với dạng protease đặc trƣng cho mô tạo nên nhiều dạng FGF-2 nhƣ liệt kê Tuy chức FGF-2 môi trƣờng invivo chƣa đƣợc biết rõ nhƣng tính chất FGF-2 điều kiện nghiên cứu in vitro cho thấy FGF-2 có vai trò quan trọng hình thành mạch máu mới, làm lành vết thƣơng có khả gây ung thƣ biểu bất thƣờng [26, 29, 33] Bảng 1.2 Chức FGF-2 hệ quan khác [4] Cơ quan Chức Não Duy trì biệt hóa tế bào thần kinh Mạch máu Hình thành mạch, tăng sinh tế bào trơn Hạn chế xơ vựa động mạch điều hòa huyết áp Phổi Phân nhánh hình thái, ngăn ngừa xơ hóa Chi Phát triển chi Cơ Hình thành Xƣơng Chữa lành xƣơng tổn thƣơng, hình thành sụn Quá trình tạo máu Kích thích tạo bạch cầu hạt, tăng tế bào nhân khổng lồ, trì tế bào gốc Chống lại trình apoptosis Hệ sinh sản Tạo tinh trùng Mắt Duy trì tế bào tiếp nhận ánh sáng truyền tín hiệu Da Hình thành hắc tố da Hình thành tế bào sừng Sửa chữa mô 1.1.2.3 Các hƣớng ứng dụng FGF-2 a) Trong nghiên cứu - Vai trò FGF-2 việc nuôi tế bào gốc phôi người - 13 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Khi nuôi tế bào gốc phôi ngƣời, cần bổ sung nhân tố tăng trƣởng nhƣ FGF-2, activin A, TGFβ1, Wnt1, Wnt3… vào môi trƣờng nuôi để ức chế biệt hóa tế bào Trong tất cách nuôi tế bào gốc phôi, FGF-2 thành phần thiếu môi trƣờng Ngoài ra, FGF-2 đƣợc tạo tế bào gốc phôi ngƣời FGF-2 tạo thành tác động trở lại lên tế bào hai cách Nếu FGF-2 có trình tự tín hiệu giúp điều hòa biểu gen liên quan đến kiểu hình sơ khai tế bào Cơ chế tác động dạng FGF-2 đƣợc tiếp tục nghiên cứu Đối với FGF-2 không gắn thêm trình tự tín hiệu đƣợc tiết tế bào tƣơng tác với thụ thể giúp tế bào gốc phôi ngƣời tăng sinh tình trạng không biệt hóa Hiện nay, cách nuôi tế bào gốc phôi môi trƣờng xác định có bổ sung nhân tố tăng trƣởng đƣợc ƣu tiên sử dụng nuôi tế bào dùng cho ứng dụng y học tránh đƣợc nguy nhiễm chéo mầm bệnh từ lớp tế bào đồng nuôi cấy Các nghiên cứu cho thấy việc kết hợp FGF-2 với nhân tố tăng trƣởng khác noggin, activin A… giúp trì trạng thái không biệt hóa tế bào gốc phôi nuôi cấy tế bào gốc phôi khoảng thời gian dài [4, 34] Nhƣ vậy, trạng thái không biệt hóa tế bào gốc ngƣời đƣợc trì nhờ nhân tố tăng trƣởng FGF-2 Cơ chế trì trạng thái không biệt hóa FGF-2 tế bào gốc phôi ngƣời cần đƣợc nghiên cứu cụ thể để tối ƣu hóa quy trình nuôi loại tế bào gốc [4, 34] b) Trong y học - Ngăn ngừa hình thành sẹo lồi Sự hình thành sẹo lồi đƣợc cho tình trạng tăng sinh mức nguyên bào sợi mô đàn hồi da lớp trung bì trình làm lành tổn thƣơng da đƣờng khâu vết mổ Những nghiên cứu gần cho thấy việc sử dụng FGF-2 có khả ngăn ngừa sẹo hiệu tác dụng ức chế trình chuyển nguyên bào sợi thành tế bào trơn Ngoài ra, FGF-2 thúc đẩy trình lành vết thƣơng, giảm khả tạo sẹo cách điều chỉnh cân chất - 14 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu ngoại bào Do đó, FGF-2 đƣợc ứng dụng xử lý, ngăn ngừa hình thành sẹo lồi da phẫu thuật [33, 34] - Điều trị bỏng Việc điều trị tổn thƣơng bỏng gây gặp nhiều khó khăn so với tổn thƣơng khác Những vết thƣơng bỏng thƣờng bị nhiễm trùng vi khuẩn gây nên biến chứng không mong muốn, trẻ em Để khắc phục khó khăn này, việc điều trị tổn thƣơng bỏng phải đƣợc tiến hành thời gian nhanh để tránh nhiễm trùng gây biến chứng khác Với mục đích đó, ngày FGF-2 đƣợc sử dụng để điều trị tổn thƣơng bỏng gây FGF-2 đóng vai trò làm cho trình lành hóa vết thƣơng da nhanh cách hoạt hóa đại thực bào (macrophage), kích thích tăng sinh tế bào gốc trung mô giúp đẩy nhanh trình co rút đóng kín vết thƣơng [33, 34] - Điều trị bệnh nhân thiếu máu cục Trong y học, bệnh thiếu máu cục đƣợc định nghĩa tƣợng hạn chế cung cấp máu đến mô, gây tình trạng thiếu oxy chất dinh dƣỡng cần thiết cho việc trao đổi chất tế bào dẫn đến tế bào bị chết hoại tử mô Thiếu máu cục thƣờng xuất bệnh thiếu máu cục tim, thiếu máu cục não, thiếu máu cục chi Tuy nhiên, bệnh thiếu máu cục tim chi dƣới thƣờng phổ biển có tỷ lệ tử vọng cao Nguyên nhân gây bệnh thiếu máu cục thƣờng gặp vấn đề mạch máu nhƣ xơ vữa động mạch, hạ huyết áp, chèn ép từ bên khối u… Bệnh thiếu máu cục thƣờng đƣợc điều trị cách phẫu thuật Ví dụ nhƣ bệnh nhân thiếu máu cục tim thƣờng đƣợc điều trị cách khai thông động mạch bị tắc nghẽn ống stent phẫu thuật mở đƣờng lƣu thông máu đến mô bị thiếu máu Tuy nhiên, hai cách có mặt hạn chế gây nên tổn thƣơng, biện pháp điều trị phát huy hiệu lâu dài Để khắc phục hạn chế phƣơng pháp trƣớc đó, ngƣời ta sử dụng nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF-2 để điều trị chứng thiếu máu cục tim Một - 15 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu vào mô bị thiếu máu, FGF-2 kích thích tăng trƣởng tế bào thúc đẩy phát triển mạch máu từ mạch máu tồn trƣớc [13, 18] c) Trong mỹ phẩm Các tính chất học, bảo vệ, phục hồi da suy giảm dần theo thời gian tuổi tác Ngoài ra, yếu tố gây stress môi trƣờng bên nhƣ ô nhiễm, tia tử ngoại… làm đẩy nhanh trình lão hóa da Sự tác động tuổi tác môi trƣờng dẫn đến da bị khô ráp, nhăn nheo nhƣ thay đổi sắc tố Về mặt mô học, theo thời gian lƣợng collagen da suy giảm, da dần nguyên bào sợi mạng lƣới mạch máu Để ngăn ngừa ngừa tƣợng đó, FGF-2 đƣợc chứng minh có khả thúc đẩy phát triển nguyên bào sợi, hỗ trợ trình tổng hợp collagen, hình thành mạch máu giúp ngăn ngừa đẩy lùi tiến trình lão hóa da [4, 34] Nhờ có khả ngăn ngừa lão hóa da mà FGF-2 đƣợc ứng dụng nhiều công nghệ mỹ phẩm Một số sản phẩm đƣợc thƣơng mại chứa FGF-2 đƣợc đƣa thị trƣờng chăm sóc sắc đẹp nhận đƣợc phản hồi tích cực 1.2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 1.2.1 Giới thiệu chung Vào năm 1970, thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp thành công vi khuẩn nhƣ hormon somatostatin, sau insulin có giá trị cao ứng dụng công nghiệp dƣợc phẩm công nghệ sinh học Hiện nay, Escherichia coli chủng chủ đƣợc sử dụng phổ biến sản xuất protein tái tổ hợp có ƣu bật tốc độ tăng trƣởng nhanh chóng, đạt đƣợc mật độ tế bào cao, phát triển môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền, đặc tính di truyền đƣợc hiểu biết rõ, sản lƣợng protein sản xuất cao (có thể lên đến 50%), có nhiều chủng đột biến, nhiều vector tạo dòng thích hợp thao tác di truyền dễ dàng [22, 30] Bảng 1.3 Các chủng E coli thường dùng để biểu protein tái tổ hợp[9] Chủng Đặc điểm - 16 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu AD494 Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide vùng tế bào chất BL21(DE3) Bất hoạt protease lon ompT BL21 trxB Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide vùng tế bào chất Bất hoạt protease lon ompT BL21 CodonPlus- Hỗ trợ biểu protein eukaryote với codon nhƣ RP AGG, AGA, CCC Bất hoạt protease lon ompT Đột biến recA làm ổn định vùng lặp BLR Bất hoạt protease lon ompT C41/ C43 Đột biến dành cho biểu protein màng JM 83 Tiết protein tái tổ hợp vùng ngoại vi tế bào chất Origami B Đột biến trxB/gor hỗ trợ tốt cho việc tạo thành liên kết disulfide tế bào chất Bất hoạt protease lon ompT Hỗ trợ biểu protein eukaryote với codon Rosetta-gami nhƣ AUA, AGG, AGA, CGG, CUA, CCC GGA Bất hoạt protease lon ompT Đột biến trxB/gor hỗ trợ tốt cho việc tạo liên kết disulfide tế bào chất Protein tái tổ hợp đƣợc sản xuất E coli thực theo ba hƣớng: sản xuất nội bào, chu chất, sản xuất ngoại bào Trong đó, sản xuất protein tái tổ hợp nội bào chiến lƣợc đƣợc sử dụng phổ biến Protein tái tổ hợp tạo dạng tan hay không tan (thể vùi), khuyết điểm chủ yếu chiến lƣợc hình thành protein dạng thể vùi hoạt tính, đặc biệt biểu vƣợt mức Protein mục tiêu sau thu nhận phải đƣợc tái gấp cuộn để có hoạt tính Nhiều cải tiến đƣợc tiến hành nhƣ nuôi cấy vi sinh vật nhiệt độ thấp, thay acid amin, sử dụng chủng E coli khác nhau(bảng 1.3), đồng biểu với chaperone gấp cuộn, thay đổi pH, nuôi cấy cảm ứng biểu điều kiện stress…[9] - 17 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Một khía cạnh khác cần đƣợc quan tâm sản xuất protein có cầu nối disulfide tế bào chất E coli Do tế bào chất E coli môi trƣờng có tính oxy hoá khử thấp, thiếu hệ thống protein DsbA DsbB để hình thành cầu nối disulfide hay có chế ngăn chặn hình thành cầu nối nên protein mục tiêu cầu nối disulfide hay có nhƣng cấu hình sai Hƣớng giải đồng biểu DsbA DsbB giúp tăng khả hình thành cầu nối disulfide [9, 30] 1.2.2 Các vị trí biểu protein tái tổ hợp 1.2.2.1 Biểu tế bào chất Hầu hết protein đƣợc biểu E coli đƣợc thiết kế biểu tế bào chất tế bào Việc biểu protein tái tổ hợp tế bào chất E coli gặp nhiều khó khăn nhƣ protein thƣờng đƣợc tạo dạng không tan, hoạt tính sinh học gọi thể vùi (inclusion body), tế bào chất E coli chế thúc đẩy hình thành cầu nối disulfide… Tuy nhiên, việc biểu protein tái tổ hợp tế bào chất E coli phƣơng án đƣợc sử dụng phổ biến mức độ biểu cao so với vị trí khác tế bào, việc thiết kế plasmid đơn giản Ngoài ra, ngƣời ta phát triển nhiều phƣơng pháp nhằm cải thiện tính tan protein tể bào chất nhƣ đồng biểu phân tử chapreron; sử dụng chủng E.coli đột biến gen trx…[9, 30, 31] 1.2.2.2 Biểu chu chất Khoang chu chất tế bào E coli nơi có tính oxi hóa cao có chứa enzyme xúc tác cho việc hình thành liên kết disulfide Tuy nhiên khoang chu chất lƣợng protein thƣờng đƣợc biểu với hiệu suất thấp Mặt khác, để protein chuyển từ màng khoang chu chất đoạn peptide tín hiệu Không phải peptid tín hiệu hoạt động tốt tế bào E coli Khi tăng tổng hợp peptide tín hiệu làm giảm mức độ biểu protein để tránh tình trạng ùn tắc hệ thống vận chuyển qua màng, làm tăng tổng hợp protein đóng vai trò chuyển màng Bên cạnh biểu chu chất, protein tồn dạng thể vùi [9, 30, 31] - 18 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Hình 1.7 Sự hình thành cầu nối disuldide chu chất E coli [9] 1.2.2.3 Tiết môi trƣờng E coli tiết (hầu nhƣ không có) protein môi trƣờng nuôi cấy Protein đƣợc định hƣớng tiết môi trƣờng phải qua hai màng: màng màng E coli Cơ chế chuyển qua màng đặc hiệu Ngƣời ta cho có hai cách để định hƣớng protein đƣợc tiết môi trƣờng sử dụng đƣờng tiết sẵn thông qua việc sử dụng đoạn peptide tín hiệu; cách thứ hai sử dụng yếu tố thẩm thấu ảnh hƣởng tới việc tiết protein có lựa chọn nhƣng lại hạn chế đƣợc tính thấm màng Nhìn chung protein tạo phƣơng pháp gặp [9, 30, 31] 1.2.3 Một số hệ thống cảm ứng biểu E coli 1.2.3.1 Hệ thống cảm ứng IPTG a Giới thiệu Hệ thống cảm ứng operon lac lactose đƣợc phát triển từ lâu nhƣng lại có khuyết điểm lớn, lactose vừa chất cảm ứng vừa chất cho -galactosidase nên lƣợng lactose bị hao hụt dẫn đến phải bổ sung trình cảm ứng Ngƣời ta sử dụng đồng đẳng lactose để thay IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) Do chất -galactosidase, nên IPTG đƣợc trì - 19 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu trình điều hoà Nhƣ vậy, IPTG phân tử có khả thay lactose điều hoà operon lac Hệ thống cảm ứng IPTG phổ biến sản xuất protein tái tổ hợp chất cảm ứng IPTG ổn định, có nhiều loại chủng chủ nhƣ hệ thống vector đƣợc thiết kế thích hợp cho cảm ứng IPTG Chủng chủ E coli BL21(DE3) hệ thống vector pET hệ thống biểu đƣợc sử dụng phổ biến biểu protein tái tổ hợp [3, 24, 31] b Hệ thống vector pET Các vector pET đƣợc xây dựng Studier cộng Những vector pET đƣợc bổ sung thêm nhiều đặc tính giúp việc tạo dòng, phát tinh chế protein mục tiêu trở nên dễ dàng Việc lựa chọn loại vector pET phù hợp để biểu protein mục tiêu phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trong đó, ba yếu tố quan trọng cần xét đến mục tiêu ứng dụng protein đích, đặc tính sinh học protein chiến lƣợc tạo dòng Hệ thống vector pET thƣờng đƣợc sử dụng để tạo dòng biểu protein tái tổ hợp E coli Vector có vùng MCS chứa enzyme cắt giới hạn giúp tạo dòng gen mục tiêu vào vector Vùng MCS đƣợc thiết kế nằm vùng hạ lƣu T7 promoter Khi tế bào chủ tạo enzyme T7 RNA polymerase gắn vào T7 promoter gen mục tiêu nằm vùng hạ lƣu promoter đƣợc phiên mã, dịch mã tạo protein tái tổ hợp tƣơng ứng Vì T7 promoter gắn đặc hiệu với enzyme T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ thực khuẩn thể nên protein mục tiêu đƣợc điều hòa biểu cách hiệu Mặt khác, T7 promoter promoter mạnh, T7 RNA polymerase có hoạt tính cao nên protein mục tiêu đƣợc sản xuất hiệu Vài sau cảm ứng, protein tái tổ hợp chiếm đến 50% tổng protein tế bào sản xuất Hệ thống vector pET có khả trì gen mục tiêu trạng thái không biểu đƣợc tạo dòng vào tế bào chủ gen mã hóa cho T7 RNA polymerase Điều giúp plasmid tồn ổn định tế bào chủ protein tái tổ hợp tạo gây độc cho tế bào - 20 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Tuy nhiên, việc điều hòa biểu T7 polymerase dựa vào promoter lac có hạn chế số trƣờng hợp không cảm ứng mà có biểu rò rỉ Nếu gen cần biểu có khả gây độc việc biểu rò rỉ làm ảnh hƣởng đến sức sống tế bào Để giải vấn đề này, đồng biểu T7 lysozyme để phân hủy T7 RNA polymerase đƣợc sản xuất với số lƣợng nhỏ chƣa đƣợc cảm ứng Nhờ protein có khả gây độc tế bào không đƣợc biểu có chất cảm ứng môi trƣờng Hƣớng giải tạo có khoảng thời gian ức chế thời điểm cảm ứng biểu cực đại protein mục tiêu nồng độ polymerase phải tăng lên đủ lớn để vƣợt qua đƣợc ức chế lysozyme [3, 24, 31] c Cơ chế cảm ứng biểu IPTG Ở hệ thống biểu đƣợc cảm ứng IPTG, chủng chủ đƣợc biến đổi di truyền để có gen mã hóa cho T7 polymerase gen Gen đƣợc đặt dƣới kiểm soát lac promoter Ngoài ra, gen lacI đƣợc chèn vào gen để tạo lac repressor Khi diện IPTG môi trƣờng, lac repressor tạo thành gắn với lac operator làm promoter lac bị bất hoạt, gen mã hóa cho T7 polymerase không đƣợc biểu Hình 1.8 Cơ chế điều hòa T7 promotor [24] - 21 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Vector pET đƣợc thiết kế có T7 promoter vùng MCS nằm sau T7 promoter Gen mục tiêu đƣợc thiết kế chèn vào vector vùng MCS để đƣợc kiểm soát biểu T7 promoter Ngoài ra, vector pET có vị trí lac operator gen lacI mã hóa cho lac repressor để kiểm soát biểu T7 promoter Khi có diện IPTG, IPTG gắn vào lac repressor vị trí allosteric, làm protein thay đổi cấu hình gắn vào lac operator Nhờ lac promoter đƣợc hoạt hóa, gen mã hóa cho T7 polymerase đƣợc biểu tạo T7 polymerase IPTG giải phóng T7 promoter vector pET khỏi kiểm soát lac repressor Enzyme T7 polymerase tạo thành gắn vào T7 promoter đƣợc hoạt hóa giúp biểu gen mục tiêu đƣợc tạo dòng vào vector (hình 1.8) [3, 16, 24, 31] 1.2.3.2 Hệ thống cảm ứng L - arabinose Promoter đƣợc sử dụng pBAD với nhân tố kích hoạt AraC Khi môi trƣờng có arabinose có điều hoà dƣơng, ngƣợc lại có glucose biểu operon bị ức chế Protein AraC hoạt động dạng dimer gắn vào vị trí operon arabinose O1, O2, I Khi vắng mặt arabinose dimer AraC tiếp xúc với vị trí O2 nằm vùng gen araC, cách promoter araBAD khoảng 210 cặp base Phần dimer tiếp xúc với vị trí O1 vùng promoter, hình thành DNA dạng vòng Sự phiên mã promoter AraBAD araC bị ức chế cấu hình vòng Khi có mặt arabinose arabinose gắn vào dimer araC làm dimer thay đổi cấu hình, lúc dimer không gắn vào vị trí O2 mà gắn vào vị trí I, nhờ RNA polymerase bắt đầu hoạt động phiên mã Đây hệ thống điều hoà mạnh, với chất cảm ứng không đắt tiền, trình lên men với hàm lƣợng cảm ứng 1% đạt đƣợc biểu tối ƣu [31] 1.2.3.3 Hệ thống cảm ứng muối Cảm ứng muối phƣơng pháp đơn giản, hiệu áp dụng cho sản xuất vƣợt mức protein tái tổ hợp Hệ thống sử dụng chủng chủ E coli GJ1158 đƣợc thiết kế có promoter proU đƣợc cảm ứng NaCl Để tăng cƣờng biểu hiện, hệ thống - 22 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu cảm ứng muối có nhân tố phiên mã T7 RNA polymerase, protein đƣợc biểu vƣợt mức với lƣợng lớn [31] 1.3 TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP Protein đƣợc tinh dựa đặc tính nhƣ độ hòa tan, kích thƣớc, điện tích liên kết lực Thông thƣờng, hỗn hợp protein trải qua nhiều giai đoạn phân tách, giai đoạn dựa đặc tính định, để cuối thu nhận đƣợc protein tinh Các kỹ thuật tinh thƣờng dùng: tủa muối, màng bán dẫn, sắc ký [15] 1.3.1 Tủa muối Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein giảm tính tan, tƣợng gọi tủa muối (salting out) Mỗi loại protein kết tủa nồng độ muối định Vì vậy, tƣợng tủa muối đƣợc dùng để phân đoạn protein [15] 1.3.2 Sự thẩm tích Protein đƣợc phân tách thẩm tách thông qua màng bán dẫn, chẳng hạn màng cellulose với nhiều lỗ Những phân tử có cấu trúc không gian định lớn đƣờng kính lỗ bị giữ lại bên túi thẩm tách, đó, phân tử nhỏ ion qua lỗ túi Kỹ thuật dùng để loại bỏ muối hay tách phân tử nhỏ, nhƣng với kỹ thuật không phân biệt đƣợc loại protein với [15] 1.3.3 Sắc ký Sắc ký phƣơng pháp phân tách quan trọng sinh học phân tử thích hợp với nhiều loại hợp chất sản phẩm tinh đƣợc sử dụng cho việc định lƣợng định danh Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động mẫu cần phân tách Trong đó, tùy vào loại mẫu cần phân tách ta lựa chọn loại sắc ký nhƣ nguyên liệu cho pha cố định pha di động Trong tinh protein, có bốn phƣơng pháp đƣợc ứng dụng nhiều sắc ký lọc gel dựa vào kích thƣớc phân tử (Size Exclusion Chromagraphy), sắc ký trao đổi - 23 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu ion dựa vào điện tích phân tử (Ion Exchange Chromagraphy), sắc ký lực dựa vào lực phân tử với loại phân tử khác (Affinity Chromagraphy) sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc (Hydrophobic Interaction chromatography, HIC) dựa vào mức độ kị nƣớc protein nồng độ muối khác Xây dựng quy trình tinh chế hiệu yếu tố định thành công việc sản xuất protein Tùy theo yêu cầu độ tinh sạch, cần thiết phải trì hoạt tính protein nhƣ mức độ tạp nguồn mẫu ban đầu, phƣơng pháp đƣợc sử dụng để tinh chế phối hợp phƣơng pháp khác Thông thƣờng, protein đƣợc sử dụng làm thuốc, trình tinh chế đầy đủ gồm giai đoạn: - Giai đoạn bắt giữ: Đây bƣớc cô lập nhanh protein mục tiêu khỏi vật liệu thô ban đầu Đồng thời, protein đƣợc cô đặc chuyển qua dung dịch giúp trì hoạt tính protein Ở bƣớc này, protein thƣờng đƣợc phân tách theo nhóm cách sử dụng sắc ký lực sắc ký trao đổi ion - Giai đoạn tinh chế trung gian: giai đoạn tập trung vào mục đích phân tách protein mục tiêu khỏi thành phần tạp lớn nhƣ nucleic acid, endotoxin, virus protein khác Giai đoạn không cần phải tiến hành nhanh thành phần tạp gây phân hủy thủy giải protein bị loại giai đoạn trƣớc Tuy nhiên, kỹ thuật tinh chế đƣợc sử dụng giai đoạn cần phải có khả phân tách cao Do vậy, cần phải lựa chọn biện pháp dung ly protein hiệu quả, nhƣ sử dụng gradient nồng độ dung ly nhiều bƣớc - Giai đoạn tinh chế cuối: Mục đích giai đoạn loại thành phần tạp nồng độ thấp điều chỉnh pH, nồng độ muối nhƣ bổ sung chất hỗ trợ để bảo quản protein Trong giai đoạn cần phải sử dụng kỹ thuật tinh chế có độ phân tách cao để đạt đến độ tinh cần thiết Đây quy trình tinh chế protein đầy đủ, điều nghĩa protein cần tinh chế theo quy trình ba bƣớc Ví dụ, giai đoạn bắt giữ tinh chế trung gian nhập lại thành bƣớc nhất, tƣơng tự nhập giai - 24 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu đoạn trung gian giai đoạn cuối lại với Trong số trƣờng hợp, nguồn mẫu ban đầu tinh cần tinh chế qua bƣớc cuối Ngƣợc lại, số protein dùng làm thuốc cần bốn, năm bƣớc tinh chế để đạt đƣợc yêu cần độ tinh tính an toàn [15, 28] 1.3.3.1 Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography – IEC) Ra đời từ năm 1960, IEC với khả phân tách khả nạp mẫu cao kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến để tinh protein, peptid, nucleic acid phân tử sinh học tích điện khác Kỹ thuật giúp phân tách phân tử sinh học dựa vào khác đặc tính tích điện chúng IEC phân tách phân tử dựa vào điện tích bề mặt Chất IEC hạt nhỏ chứa nhóm tích điện dƣơng (cation) tích điện âm (anion) Phân tử protein đƣợc tạo thành từ amino acid chứa nhóm acid base yếu, điện tích protein thay đổi theo thay đổi pH dung dịch chứa chúng Giá trị pH mà protein không tích điện gọi điểm đẳng điện (pI) Ở pH cao điểm đẳng điện, protein tích điện âm gắn vào chất cột trao đổi anion Ở pH thấp điểm đẳng điện, protein tích điện dƣơng gắn với chất cột trao đổi cation Để bắt đầu trình tinh chế, cột trao đổi ion cần đƣợc cân với buffer có lực ion pH thích hợp cho phép protein mục tiêu gắn vào chất sắc ký phần tử tạp khỏi cột nhiều Trong phƣơng pháp này, pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt tƣơng tác với phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, tăng nồng độ ion pha động, ion phân tử protein tƣơng tác với hạt mang điện tích Ví dụ, sắc ký trao đổi ion dƣơng, thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch dung ly ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích dƣơng, đó, protein mang điện tích dƣơng đƣợc phóng thích cột lần lƣợt theo độ lớn điện tích Trong số - 25 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu trƣờng hợp đặc biệt, protein đƣợc dung ly cách thay đổi pH dung dịch [15, 28] Hình 1.9 Minh họa sắc ký trao đổi ion [15] 1.3.3.2 Sắc ký lực (Affinitive chromatography, AC) Sắc ký lực phƣơng pháp hiệu quả, đƣợc ứng dụng rộng rãi việc tinh protein Kỹ thuật dựa lực protein với số nhóm hóa học chuyên biệt Khi nạp hỗn hợp protein vào cột, protein có khả nhận biết nhóm X hay dẫn xuất đƣợc gắn cột nối cộng hóa trị Sau cột đƣợc rửa để loại bỏ protein không tạo đƣợc nối nối không đặc hiệu, cuối dung ly protein mục tiêu dung dịch X với nồng độ cao thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết (hình 1.10) Kỹ thuật đƣợc sử dụng pha bắt giữ tinh chế trung gian AC có tính đặc hiệu protein nên kỹ thuật tinh chế có độ phân tách hiệu suất cao Trong kỹ thuật này, protein mục tiêu đƣợc gắn đặc hiệu thuận nghịch với ligand tƣơng ứng Ban đầu, mẫu đƣợc nạp vào dƣới điều kiện cho phép gắn đặc hiệu xảy Những protein không gắn đƣợc với ligand bị rửa sau Cuối cùng, - 26 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu protein mục tiêu đƣợc tách dƣới điều kiện chuyên biệt cách sử dụng chất gắn cạnh tranh, đƣợc tách dƣới điều kiện không chuyên biệt cách thay đổi pH lực ion Sau trình tinh chế AC, protein thu đƣợc có độ tinh cao đƣợc cô đặc [15, 28] Hình 1.10 Hình minh họa sắc ký lực [17] Nhằm mục đích ứng dụng nuôi cấy tế bào, y học mỹ phẩm, FGF-2 tái tổ hợp cần phải có độ tinh tối thiểu 95% Dựa vào đặc điểm FGF-2 có pI=9,6, có lực cao với heparin, bền pH dựa vào tính chất phƣơng pháp sắc ký đƣợc nêu trên, luận văn này, sử dụng phƣơng pháp sắc ký trao đổi cation sắc ký lực heparin nhằm thu nhận FGF-2 có độ tinh đạt yêu cầu từ pha tan dịch đồng tế bào E coli - 27 - Luận văn thạc sĩ sinh học [...]... disulfide hay có cơ chế ngăn chặn sự hình thành cầu nối này nên protein mục tiêu có thể không có cầu nối disulfide hay có nhƣng cấu hình sai Hƣớng giải quyết là đồng biểu hiện DsbA và DsbB giúp tăng khả năng hình thành cầu nối disulfide [9, 30] 1 .2. 2 Các vị trí biểu hiện protein tái tổ hợp 1 .2. 2 .1 Biểu hiện ở tế bào chất Hầu hết protein đƣợc biểu hiện ở E coli đều đƣợc thiết kế biểu hiện ở tế bào chất... nhiều chủng đột biến, nhiều vector tạo dòng thích hợp và thao tác di truyền dễ dàng [22 , 30] Bảng 1. 3 Các chủng E coli thường được dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp[ 9] Chủng Đặc điểm - 16 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu AD494 Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất BL 21( DE3) Bất hoạt protease lon và ompT BL 21 trxB Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào... hệ thống biểu hiện đƣợc sử dụng phổ biến trong biểu hiện protein tái tổ hợp [3, 24 , 31] b Hệ thống vector pET Các vector pET đƣợc xây dựng đầu tiên bởi Studier và cộng sự Những vector pET hiện nay đƣợc bổ sung thêm nhiều đặc tính mới giúp việc tạo dòng, phát hiện và tinh chế protein mục tiêu trở nên dễ dàng hơn Việc lựa chọn một loại vector pET phù hợp để biểu hiện protein mục tiêu phụ thuộc vào nhiều... cho sản xuất vƣợt mức protein tái tổ hợp Hệ thống sử dụng chủng chủ E coli GJ 115 8 đƣợc thiết kế có promoter proU đƣợc cảm ứng bởi NaCl Để tăng cƣờng biểu hiện, hệ thống - 22 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu cảm ứng muối có nhân tố phiên mã T7 RNA polymerase, do đó protein đƣợc biểu hiện vƣợt mức với lƣợng lớn [ 31] 1. 3 TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP Protein đƣợc tinh sạch dựa trên những đặc... quá trình tổng hợp collagen, hình thành mạch máu giúp ngăn ngừa và đẩy lùi tiến trình lão hóa của da [4, 34] Nhờ có khả năng ngăn ngừa sự lão hóa da mà hiện nay FGF -2 đƣợc ứng dụng rất nhiều trong công nghệ mỹ phẩm Một số sản phẩm đã đƣợc thƣơng mại chứa FGF -2 đã đƣợc đƣa ra thị trƣờng chăm sóc sắc đẹp và nhận đƣợc những phản hồi tích cực 1 .2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 1 .2. 1 Giới... không biểu hiện khi đƣợc tạo dòng vào tế bào chủ không có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase Điều này giúp plasmid tồn tại ổn định trong tế bào chủ do protein tái tổ hợp khi tạo ra có thể gây độc cho tế bào - 20 - Luận văn thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Tuy nhiên, việc điều hòa biểu hiện T7 polymerase dựa vào promoter lac có hạn chế là trong một số trƣờng hợp không cảm ứng mà vẫn có sự biểu hiện. .. đó lac promoter đƣợc hoạt hóa, gen mã hóa cho T7 polymerase đƣợc biểu hiện tạo T7 polymerase IPTG cũng giải phóng T7 promoter trên vector pET khỏi sự kiểm soát của lac repressor Enzyme T7 polymerase tạo thành sẽ gắn vào T7 promoter đã đƣợc hoạt hóa giúp biểu hiện gen mục tiêu đã đƣợc tạo dòng vào vector (hình 1. 8) [3, 16 , 24 , 31] 1 .2. 3 .2 Hệ thống cảm ứng bởi L - arabinose Promoter đƣợc sử dụng là pBAD... tế bào chất của tế bào Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E coli gặp nhiều khó khăn nhƣ protein thƣờng đƣợc tạo ra ở dạng không tan, không có hoạt tính sinh học gọi là thể vùi (inclusion body), tế bào chất của E coli không có cơ chế thúc đẩy sự hình thành cầu nối disulfide… Tuy nhiên, hiện nay việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E coli vẫn là phƣơng án đƣợc sử... biến nhất do mức độ biểu hiện cao hơn so với các vị trí khác trong tế bào, việc thiết kế plasmid cũng đơn giản hơn Ngoài ra, hiện nay ngƣời ta cũng phát triển nhiều phƣơng pháp nhằm cải thiện tính tan của protein trong tể bào chất nhƣ đồng biểu hiện các phân tử chapreron; sử dụng các chủng E .coli đột biến gen trx…[9, 30, 31] 1 .2. 2 .2 Biểu hiện ở chu chất Khoang chu chất của tế bào E coli là nơi có tính... protease lon và ompT Hỗ trợ biểu hiện protein của eukaryote với các codon hiếm Rosetta-gami nhƣ AUA, AGG, AGA, CGG, CUA, CCC và GGA Bất hoạt protease lon và ompT Đột biến trxB/gor hỗ trợ tốt cho việc tạo liên kết disulfide ở tế bào chất Protein tái tổ hợp đƣợc sản xuất ở E coli có thể thực hiện theo ba hƣớng: sản xuất nội bào, trong chu chất, và sản xuất ngoại bào Trong đó, sản xuất protein tái tổ hợp trong ... sắc đẹp nhận đƣợc phản hồi tích cực 1. 2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 1. 2 .1 Giới thiệu chung Vào năm 19 70, thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp thành công vi khuẩn nhƣ hormon... giải đồng biểu DsbA DsbB giúp tăng khả hình thành cầu nối disulfide [9, 30] 1. 2.2 Các vị trí biểu protein tái tổ hợp 1. 2.2 .1 Biểu tế bào chất Hầu hết protein đƣợc biểu E coli đƣợc thiết kế biểu tế... (FGF1–FGF10 and FGF16–FGF23) đƣợc phân vào sáu họ nhỏ dựa vào tƣơng đồng trình tự nhƣ phát sinh giống loài: FGF1 FGF2; FGF3, FGF7, FGF10, FGF22; FGF4, FGF5 FGF6; FGF8, FGF1 7và FGF18; FGF9, FGF16