Tạo dòng, biểu hiện, tinh sạch đoạn polypeptide tox1 và tPMT c780 của pasteurella multocida trên e coli BL21(DE3)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐỖ THỊ TRUNG ANH TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH ĐOẠN POLYPEPTIDE TOX1 VÀ tPMT-C780 CỦA Pasteurella multocida TRÊN E coli BL21(DE3) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐỖ THỊ TRUNG ANH TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH ĐOẠN POLYPEPTIDE TOX1 VÀ tPMT-C780 CỦA Pasteurella multocida TRÊN E coli BL21(DE3) LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành đào tạo: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 Quyết định giao đề tài: Quyết định thành lập HĐ: 515/QĐ –ĐHNT ngày 17/05/2019 1585/QĐ-ĐHNT ngày 10/12/2019 Ngày bảo vệ: 20/12/2019 Người hướng dẫn khoa học: TS VŨ KHẮC HÙNG TS PHẠM THU THỦY Chủ tịch hội đồng: TS ĐẶNG THÚY BÌNH Phịng đào tạo sau đại học: KHÁNH HỊA – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Tạo dòng, biểu tinh polypeptide Tox1 tPMT-C780của Pasteurella multocida E coli BL21(DE3)” trình bày luận văn hồn tồn trung thực, khách quan Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn xác rõ nguồn gốc Khánh Hịa, ngày 09 tháng 09 năm 2019 Tác giả luận văn Đỗ Thị Trung Anh iii LỜI CÁM ƠN Lời cám ơn xin gửi đến Quý Thầy Cô Viện Công nghệ sinh học & Môi trường Khoa Sau đại học - Trường Đại học Nha Trang truyền đạt, chia sẻ kiến thức quý báu tạo điều kiện cho tơi hồn thành chương trình đào tạo Thạc sĩ Tơi xin gửi lời cám ơn chân thành đến TS Vũ Khắc Hùng, PhânViện Thú Y Miền Trung, TS Phạm Thu Thủy, Viện Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, anh chị em làm việc Bộ môn Công nghệ sinh học, Phân viện Thú Y Miền Trung hướng dẫn, định hướng truyền đạt cho kinh nghiệm nghiên cứu vô quý báu kinh nghiệm sống hữu ích Đồng thời, ln hỗ trợ tơi q trình học tập, nghiên cứu, tạo điều kiện cho tơi phát huy tốt lực Tơi xin cám ơn gia đình, bạn bè đóng góp cơng sức, động viên tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hịa, ngày 09 tháng 09 năm 2019 Tác giả luận văn Đỗ Thị Trung Anh iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN III LỜI CÁM ƠN IV MỤC LỤC V DANH MỤC BẢNG .IX DANH MỤC HÌNH X LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh tụ huyết trùng lợn 1.1.1 Lịch sử bệnh lý 1.1.2 Tác nhân gây bệnh 1.1.3 Gen ToxA độc tố Pasteurella multocida (PMT) 1.1.4 Cơ chế gây bệnh 1.1.6 Vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng 1.2 Kỹ thuật tạo dòng, biểu tinh chế protein 10 1.2.1 Khái niệm tạo dòng 10 1.2.2 Vector vật chủ dùng tạo dòng 11 1.2.3 Enzyme dùng tạo dòng 12 1.2.4 Kỹ thuật tạo dòng, biểu E coli 14 1.2.5 Tinh protein gắn đuôi dung hợp Histidine 15 1.3 Những nghiên cứu ngồi nước vắc xin phịng bệnh tụ huyết trùng tái tổ hợp 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Chủng vi sinh vật 19 2.1.3 Vector 19 2.1.4 Enzyme cắt giới hạn 19 2.1.5 Mồi 19 2.1.6 Hóa chất 20 2.1.7 Thiết bị 20 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 v 2.3 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Phân lập gen mã hóa Tox1 tPMT-C780 vi khuẩn Pasteurells multocida 22 2.4.2 Tạo vector tái tổ hợp 22 2.4.3 Biểu dòng tái tổ hợp 25 2.4.4 Xác định điều kiện cảm ứng tối ưu cho biểu đoạn polypeptide Tox1 tPMT-C780 25 2.4.5 Kiểm tra tính tan polypeptide Tox1 tPMT-C780 26 2.4.6 Tinh polypeptide tái tổ hợp Tox1 tPMT-C780 27 2.4.7 Phản ứng Western blot 29 2.4.8 Thử nghiệm hiệu bảo hộ 30 2.4.9 Thử nghiệm khả sinh đáp ứng miễn dịch 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết tạo dòng gen Tox1 tPMT-C780 vector biểu 32 3.1.1 Kết tạo dòng gen mã hóa Tox1 32 3.1.2 Kết tạo dịng gen mã hóa tPMT-C780 37 3.2 Kết biểu polypeptide Tox1 tPMT-C780 43 3.2.1 Kết biểu polypeptide Tox1 43 3.2.2 Kết biểu polypeptide tPMT-C780 47 3.3 Kết kiểm tra tính tan polypeptide Tox1 tPMT-C780 49 3.3.1 Kết kiểm tra tính tan polypeptide Tox1 49 3.3.2 Kết kiểm tra tính tan polypeptide tPMT-C780 50 3.4 Kết tinh polypeptide Tox1 tPMT-C780 51 3.4.1 Kết tinh polypeptide Tox1 51 3.4.2 Kết tinh polypeptide tPMT-C780 52 3.5 Kiểm tra polypeptide sau tinh phản ứng Western blot 53 3.5.1 Kết kiểm tra Tox1 Western blot 53 3.5.2 Kết kiểm tra tPMT-C780 Western blot 53 3.6 Kết thử nghiệm hiệu bảo hộ vắc xin tái tổ hợp chuột nhắt 54 3.7 Kết thử nghiệm khả sinh miễn dịch vắc xin tái tổ hợp 55 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 vi 4.1 Kết luận 57 4.2 Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 64 vii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Stt Chữ viết tắt Viết đầy đủ bp DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid L PCR Ghi Base pair Cặp bazơ lít Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp 6xHis HexaHistidine dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kDa Kilo Dalton 10 Amp Ampicilin 11 LB Môi trường Luria – Bertani 12 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 13 SDS - PAGE Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis Điện di biến tính gel polyacrylamide 14 TEMED 15 MCS Tetramethylethylenediamine Multiple Cloning Site viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng 18 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Pasteurella multocida Hình 1.2 Các vùng chức PMT Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dụng nghiên cứu 19 Hình 2.2 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pET32b/Tox1 21 Hình 2.3 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pRSETA/tPMT-C780 22 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình kiểm tra tính tan 25 Hình 2.5 Sơ đồ quy trình tinh polypeptide tái tổ hợp 27 Hình 2.6 Sơ đồ quy trình thử nghiệm hiệu bảo hộ polypeptide tái tổ hợp 28 Hình 3.1 Kết PCR nhân gene mã hóa Tox1 từ genome vi khuẩn P multocida 32 Hình 3.2 Trình tự nucleotide gen mã hóa Tox1 34 Hình 3.3 Kết PCR khuẩn lạc kiểm tra tạo dòng plasmid pGEMT/Tox1 E.coli DH5α 35 Hình 3.4 Kết PCR khuẩn lạc kiểm tra tạo dịng thành cơng plasmid pET32b/Tox1 E.coli DH5α 35 Hình 3.5 Kết so sánh trình tự axit amin mã hóa gene Tox1 plasmid tái tổ hợp pET32b/tox1 với trình tự axit amin từ đến 487 độc tố PMT vi khuẩn P multocida (Mã số: AAW57319.1) ngân hàng gen NCBI 36 Hình 3.6 Kết colony PCR kiểm tra gene Tox1 vi khuẩn E.coli BL21(DE3)/pET32b/Tox1 sau cấy chuyển ngày liên tiếp 37 Hình 3.7 Kết PCR khuếch đại gene mã hóa tPMT-C780 từ genome vi khuẩn P multocida với cặp mồi tPMT-C780F/ tPMT-C780R 37 Hình 3.8 Trình tự nucleotide gen mã hóa tPMT-C780 40 Hình 3.9 Kết colony PCR kiểm tra gene tPMT-C780 plasmid pGEM-T 41 Hình 3.10 Kết colony PCR kiểm tra đoạn gen tPMT-C780 plasmid pRSET-A vi khuẩn E.coli DH5α 41 Hình 3.11 Kết so sánh trình tự axit amin mã hóa gen mã hóa tPMT-C780 plasmid tái tổ hợp plasmid pRSET-A/ tPMT-C780 với trình tự axit amin từ 506-1285 độc tố PMT vi khuẩn P multocida (AAX76908.1) tạo thành ngân hàng gen NCBI 42 x TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt Bùi Quý Huy, 1998 Một số đặc điểm bệnh tụ huyết trùng Việt Nam năm vừa qua Khoa học công nghệ Thú y, 5, 9-94 Phạm Thị Phương Lan, 2013 Nghiên cứu xác định số yếu tố gây bệnh vi khuẩn Pasteurella multocida bệnh tụ huyết trùng trâu, bò Hà Giang, Cao Bằng lựa chọn vắc xin phòng bệnh Đại Học Thái Nguyên Lê Văn Năm, 2015 Nguyên nhân gây bệnh cách phòng chống bệnh tụ huyết trùng lợn TRUNG TÂM XÚC TIẾN THƯƠNG MẠI NÔNG NGHIỆP Nguyễn Ngã, 1999 Nghiên cứu chế tạo vacxin đa giá phòng bệnh đỏ lợn khu vực miền Trung Việt nam Khoa học Kỹ thuật Thú Y Hà Nội Phan Thanh Phượng, 1996 Tìm hiểu ảnh hưởng bênh tiên mao trùng đến trình đáp ứng miễn dịch trâu tiêm vắc xin tụ huyết trùng Khoa học kỹ thuật Thú Y Hà Nội Đoàn Thị Băng Tâm, 1987 Bệnh động vật nuôi tập 2, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Vũ Phạm Thái, 2009 Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ bệnh Tụ huyết trùng lợn, đặc điểm sinh học vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng lợn tỉnh Phú Thọ biện pháp phòng bệnh Luận Văn Thạc Sĩ, Đại Học Thái Nguyên Phan Đình Đỗ Trịnh Văn Thịnh, 1958 Bệnh truyền nhiễm gia súc, bệnh thường có Việt Nam, Hà Nội, NXB Nông Thôn B Tài liệu tiếng Anh BASU T., PODDAR R K 1997 Over expression of inducible proteins in Escherichia coli by treatment with ethanol Biochemistry and Molecular Biology International 41 (6): 1093-1100 10 BRENDA A WILSON, M H 2013 Pasteurella multocida: from Zoonosis to Cellular Microbiology Clin Microbiol Rev, 26 (3): 631-655 58 11 BUSCH, C., ORTH, J., DJOUDER, N & AKTORIES, K 2001 Biological Activity of a C-Terminal Fragment ofPasteurella multocida Toxin Infection and immunity, 69, 3628-3634 12 CARLTON L GYLES, J F P., J GLENN SONGER, CHARLES O THOEN 2008 Pasteurella Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals, 325-340 13 CARTER, G R 1955 Studies on Pasteurella multocida I A hemagglutination test for the identification of serological types American journal of veterinary research, 16, 481-484 14 CARTER, G R & RUNDELL, S W 1975 Identification of type A strains of P multocida using staphylococcal hyaluronidase Vet Rec, 96, 343 15 CHHETRI G., KALITA P., TRIPATHI T 2015 An efficient protocol to enhance recombinant protein expression using ethanol in Escherichia coli MethodX, 2, 385-391 16 CHOMNAWANG, M T., NABNUENGSAP, J., KITTIWORAKARN, J & PATHANASOPHON, P 2009 Expression and immunoprotective property of a 39-kDa PlpB protein of Pasteurella multocida Journal of Veterinary Medical Science, 71, 1479-1485 17 CHUNG, J Y., WILKIE, I., BOYCE, J D., TOWNSEND, K M., FROST, A J., GHODDUSI, M & ADLER, B 2001 Role of capsule in the pathogenesis of fowl cholera caused by Pasteurella multocida serogroup A Infect Immun, 69, 2487-92 18 CONFER, A W & AYALEW, S 2013 The OmpA family of proteins: Roles in bacterial pathogenesis and immunity Veterinary Microbiology, 163, 207222 19 DABO, S M., TAYLOR, J D & CONFER, A W 2007 Pasteurella multocida and bovine respiratory disease Anim Health Res Rev, 8, 129-50 20 DE ALWIS, M 1982 Pasteurella multocida serotype 6: B from an elephant Sri Lanka Vet J, 30, 28 21 DEANGELIS, P L., GUNAY, N S., TOIDA, T., MAO, W.-J & LINHARDT, R J 2002 Identification of the capsular polysaccharides of Type D and F 59 Pasteurella multocida as unmodified heparin and chondroitin, respectively Carbohydrate research, 337, 1547-1552 22 FOGED, N T 1988 Quantitation and purification of the Pasteurella multocida toxin by using monoclonal antibodies Infection and immunity, 56, 1901-1906 23 FRANK, G H 1989 Pasteurellosis of cattle Pasteurella and pasteurellosis, 197-222 24 FRANDSEN, P L., FOGED, N T., PETERSEN, S K & BORDING, A 1991 Characterization of Toxin from Different Strains of Pasteurella multocida Serotype A and D Journal of Veterinary Medicine, Series B, 38, 345-352 25 JANEWAY JR, C A., TRAVERS, P., WALPORT, M & SHLOMCHIK, M J 2001 The front line of host defense, New York, Garland Science 26 HARMEY, D., STENBECK, G., NOBES, C D., LAX, A J & GRIGORIADIS, A E 2004 Regulation of osteoblast differentiation by Pasteurella multocida toxin (PMT): a role for Rho GTPase in bone formation Journal of Bone and Mineral Research, 19, 661-670 27 HEDDLESTON, K., GALLAGHER, J & REBERS, P 1972 Fowl cholera: gel diffusion precipitin test for serotyping Pasteurella multocida from avian species Avian diseases, 925-936 28 HEDDLESTON, K L., REBERS, P A & RITCHIE, A E 1966 Immunizing and toxic properties of particulate antigens from two immunogenic types of Pasteurella multocida of avian origin The Journal of Immunology, 96, 124-133 29 HUNT, M L., ADLER, B & TOWNSEND, K M 2000 The molecular biology of pasteurella multocida Vet Microbiol, 72, 3-25 30 HUSSANI J., ABDULLAHI M.A., & ISMAIL S., 2012 Expression and immunogenicity determination ofrecombinant clone of Pasteurella multocida serotype B bagainst Haemorrhagic septicaemia: Towards a vaccinedevelopment Journal of Animal and Veterinary Advances 11 (3): 351356 60 31 HUSSDANI J., NAZMUL M.H.M., ABDULLAH M.A., & ISMAIL S., 2011 Recombinant clone ABA392 protects laboratory animals from Pasteurella multocida serotype B African Journal Microbiology Research 5: 2596–2599 32 KIM, T J., LEE, J I & LEE, B J 2006 Development of a toxA gene knockout mutant of Pasteurella multocida and evaluation of its protective effects The Journal of Microbiology, 44, 320-326 33 KITADOKORO, K., KAMITANI, S., MIYAZAWA, M., HANAJIMAOZAWA, M., FUKUI, A., MIYAKE, M & HORIGUCHI, Y 2007 Crystal structures reveal a thiol protease-like catalytic triad in the C-terminal region of Pasteurella multocida toxin Proceedings of the National Academy of Sciences, 104, 5139-5144 34 LAX, A J & GRIGORIADIS, A E 2001 Pasteurella multocida toxin: the mitogenic toxin that stimulates signalling cascades to regulate growth and differentiation Int J Med Microbiol, 291, 261-8 35 LEE, J & WOO, H.-J 2010 Antigenicity of partial fragments of recombinant Pasteurella multocida toxin Journal of microbiology and biotechnology, 20, 1756-1763 36 LEE J., KANG H E., WOO H J 2012 Protective Immunity Conferred by the C-Terminal Fragment of Recombinant Pasteurella multocida Toxin Clin Vaccine Immunol, 19(9):1526-1531 37 LIAO, C M., HUANG, C., HSUAN, S L., CHEN, Z W., LEE, W C., LIU, C I., WINTON, J R & CHIEN, M S 2006 Immunogenicity and efficacy of three recombinant subunit Pasteurella multocida toxin vaccines against progressive atrophic rhinitis in pigs Vaccine, 24, 27-35 38 MAY, B J., ZHANG, Q., LI, L L., PAUSTIAN, M L., WHITTAM, T S & KAPUR, V 2001 Complete genomic sequence of Pasteurella multocida, Pm70 Proceedings of the National Academy of Sciences, 98, 3460-3465 39 MULLAN, P B & LAX, A J 1998 Pasteurella multocida Toxin Stimulates Bone Resorption by Osteoclasts via Interaction with Osteoblasts Calcified Tissue International, 63, 340-345 61 40 MUJACIC, M., COOPER, K W & BANEYX, F 1999 Cold-inducible cloning vectors for low-temperature protein expression in Escherichia coli: application to the production of a toxic and proteolytically sensitive fusion protein Gene, 238, 325-332 41 MUSTAFA, A., GHALIB, H & SHIGIDI, M 1978 Carrier rate of Pasteurella multocida in a cattle herd associated with an outbreak of haemorrhagic septicaemia in the Sudan British Veterinary Journal, 134, 375-378 42 OKAY, S., ÖZCENGIZ, E., GÜRSEL, I & ÖZCENGIZ, G 2012 Immunogenicity and protective efficacy of the recombinant Pasteurella lipoprotein E and outer membrane protein H from Pasteurella multocida A: in mice Research in veterinary science, 93, 1261-1265 43 ORTH, J H., BLÖCKER, D & AKTORIES, K 2003 His1205 and His1223 are essential for the activity of the mitogenic Pasteurella multocida toxin Biochemistry, 42, 4971-4977 44 ORTH, J H., PREUSS, I., FESTER, I., SCHLOSSER, A., WILSON, B A & AKTORIES, K 2009 Pasteurella multocida toxin activation of heterotrimeric G proteins by deamidation Proceedings of the National Academy of Sciences, 106, 7179-7184 45 PULLINGER, G D & LAX, A J 2007 Histidine residues at the active site of the Pasteurella multocida toxin The open biochemistry journal, 1, 46 RIMLER, R B 2001 Purification of a cross-protective antigen from Pasteurella multocida grown in vitro and in vivo Avian diseases, 572-580 47 RUBIES, X., CASAL, J & PIJOAN, C 2002 Plasmid and restriction endonuclease patterns in Pasteurella multocida isolated from a swine pyramid Vet Microbiol, 84, 69-78 48 SCHUMANN, W & FERREIRA, L C S 2004 Production of recombinant proteins in Escherichia coli Genetics and Molecular Biology, 27, 442-453 49 SEO J., PYO H., LEE S., LEE J., & KIM T 2009 Expression of truncated fragments of Pasteurella multocida toxin and their immunogenicity The Canadian Journal of Veterinary Research, 73(3): 184-189 62 50 SØRENSEN, H P & MORTENSEN, K K 2005 Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli Journal of biotechnology, 115, 113-128 51 STERNER-KOCK, A., LANSKE, B., ÜBERSCHÄR, S & ATKINSON, M J 1995 Effects of the Pasteurella multocida Toxin on Osteoblastic Cells in vitro Veterinary Pathology, 32, 274-279 52 TABATABAI, L B & ZEHR, E S 2004 Identification of five outer membrane-associated proteins among cross-protective factor proteins of Pasteurella multocida Infection and immunity, 72, 1195-1198 53 WILSON, B A & HO, M 2012 Pasteurella multocida toxin interaction with host cells: entry and cellular effects Pasteurella multocida Springer 54 WU, J.-R., SHIEN, J.-H., SHIEH, H K., CHEN, C.-F & CHANG, P.-C 2007 Protective immunity conferred by recombinant lipoprotein E (PlpE) Vaccine, 25, 4140-4148 63 Pasteurella multocida PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích Mastermix 12,5 µl Nước cất 9,5 µl F(mồi xi) µl R(mồi ngược) µl DNA µl Tổng 25 µl Phụ lục 2: Quy trình tách chiết DNA genome sử dụng Kit Wizard Genomic DNA Purification Ly tâm canh khuẩn 13000 vịng phút Sau bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Thêm 600µl Nucleic Lysis Solution, lắc cho cặn hòa tan dung dịch Ủ 800 C phút Sau làm nguội tới nhiệt độ phịng Thêm 2,5µl Rnase Solution Dùng pipet trộn nhẹ nhàng Ủ 370 C tiếng Sau làm nguội đến nhiệt độ phịng Thêm 200µl Protein Precipitation Solution vào dung dịch Sau vortex mạnh 20 giây Sau ủ đá lạnh phút ly tâm 13000 vòng, phút Chuyển dịch sang Eppendorf (Hút khoảng