1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli

73 1,1K 4
Tài liệu đã được kiểm tra trùng lặp

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 73
Dung lượng 3,33 MB

Nội dung

LỜI MỞ ĐẦU Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF-2 Fibroblast Growth Factor-2 là một protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động của nhiều quá trình trong cơ thể như cân bằng nội

Trang 1

LỜI CÁM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng tri ân đến Giáo sư, Tiến sĩ TRẦN LINH THƯỚC, người đã dạy dỗ và tạo điều kiện tốt nhất cho em được học tập và hoàn thành luận văn này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Tiến sĩ VÕ MINH TRÍ, Tiến sĩ ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO và Tiến sĩ TRẦN VĂN HIẾU vì đã giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn chị KIM HẰNG, chị PHƯƠNG HIẾU, anh THANH HÒA, bạn VĂN ĐỨC, các em MAI PHƯƠNG, TUYẾT HUỆ, HƯƠNG GIANG cùng tất cả các anh chị, các bạn và các em trong Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử & Môi trường, Phòng Thí Nghiệm Công nghệ Sinh học Phân

tử và Trung tâm Khoa học & Công nghệ Sinh học đã động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Và trên hết, con cảm ơn BA, MẸ và gia đình đã luôn ở bên con, nuôi nấng, dạy dỗ, yêu thương và ủng hộ để con có được ngày hôm nay BA, MẸ và gia đình sẽ luôn là chỗ dựa vững chắc và là niềm tự hào của con

TP Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2011

Nguyễn Thị Mỹ Trinh

Trang 2

LỜI MỞ ĐẦU

Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2) là một protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động của nhiều quá trình trong cơ thể như cân bằng nội mô, ngăn chặn quá trình xơ hóa ở phổi, duy trì và tăng sinh tế bào thần kinh, chữa lành xương bị tổn thương, kích thích hình thành tế bào bạch cầu, kích thích sự hình thành mạch máu mới từ mạch máu sẵn có, kích thích sự tăng trưởng của

tế bào cơ mềm, chữa lành vết thương và sửa chữa mô…

Do sự đa dạng về chức năng, FGF-2 đang được quan tâm nghiên cứu để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Nhờ khả năng kích thích tăng sinh, ức chế biệt hóa, FGF-2 đang được sử dụng như là thành phần không thể thiếu trong nuôi cấy tế bào gốc phôi người Trong công nghệ mỹ phẩm, một số nghiên cứu cho thấy FGF-2 có khả năng làm đen tóc, ngăn ngừa sự lão hóa da nên ngày càng được các hãng mỹ phẩm tin tưởng

và bổ sung vào các bộ sản phẩm chăm sóc da, tóc Bên cạnh đó, trong lĩnh vực y học, việc sử dụng FGF-2 đã đem lại nhiều kết quả khả quan trong việc điều trị nhiều căn bệnh như bệnh thiếu máu tim cục bộ, điều trị bỏng, ngăn ngừa sẹo do phẫu thuật, chữa bệnh viêm nha chu…

Trước đây, sản phẩm FGF-2 thường được thu nhận bằng cách tách chiết từ các dòng tế bào động vật Việc sản xuất FGF-2 bằng phương pháp này đảm bảo về hoạt tính của sản phẩm nhưng sản lượng thấp và giá thành cao Nhằm khắc phục những nhược điểm trên, người ta đã tiến đến việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ để sản xuất nhân tố FGF-2 Do đặc điểm của FGF-2 là không có cấu nối disulfide nội phân tử và không cần sự biến đổi sau dịch mã cho hoạt tính sinh học nên hệ thống chủng chủ

E.coli có thể đảm nhiệm việc sản xuất FGF-2 có hoạt tính thay cho các dòng tế bào

Trang 3

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu sản

xuất protein FGF-2 tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli” nhằm tìm ra phương án

sản xuất FGF-2 hiệu quả, kinh tế cho những ứng dụng trong nước Tuy nhiên, một

trong những hạn chế của việc sử dụng E coli làm tế bào chủ là protein thường được

tạo ra dưới dạng thể vùi không có hoạt tính, cần phải trải qua quá trình gấp cuộn phức tạp, tốn kém Do vậy, luận văn này được thực hiện với mục đích xây dựng quy trình

sản xuất FGF-2 trong đó sử dụng chủng chủ E coli để cảm ứng biểu hiện protein dạng

tan trong tế bào chất Đây là hướng chiến lược hiệu quả và triển vọng cho phép sản xuất FGF-2 có hoạt tính một cách đơn giản với hiệu suất cao, giúp hạ giá thành sản phẩm

Với mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện luận văn với những nội dung sau:

- Tạo dòng E coli BL21(DE3)/pET-FGF có khả năng biểu hiện vượt mức

protein FGF-2 tái tổ hợp

- Biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E coli

BL21(DE3)/pET-FGF

- Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít nhằm thu nhận

FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E coli

- Chứng minh hoạt tính kích thích tăng sinh dòng tế bào 3T3 của FGF-2 tái tổ hợp

Trang 4

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF-2 4

1.1.1 Họ nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF 4

1.1.2 Cấu trúc của FGF-2 4

1.1.3 Chức năng của FGF-2 7

1.1.4 Ứng dụng của FGF-2 8

1.2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 13

1.2.1 Giới thiệu chung 13

1.2.2 Một số hệ thống biểu hiện ở E coli 16

1.2.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E coli 18

CHƯƠNG II VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 VẬT LIỆU 22

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị 22

2.1.2 Hóa chất 22

2.1.3 Môi trường 25

2.1.4 Vật liệu sinh học 26

2.2 PHƯƠNG PHÁP 28

2.2.1 Cấu trúc vector tái tổ hợp pET-FGF mang gen mã hóa protein FGF-2 28

2.2.2 Cấu trúc chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET-FGF (E coli BL21(DE3)/pET-pET-FGF) 36

2.2.3 Xác nhận sự biểu hiện FGF-2 dạng tan trong tế bào chất E coli BL21(DE3) 36

2.2.4 Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp ở dạng tan 37

2.2.5 Kiểm tra hoạt tính kích thích tăng sinh dòng tế bào 3T3 của FGF-2 tái tổ hợp [23] 40

2.2.6 Các phương pháp phân tích protein 41

CHƯƠNG III KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN 46

3.1 CẤU TRÚC VECTOR TÁI TỔ HỢP pET-FGF MANG GEN MÃ HÓA PROTEIN FGF-2 47

Trang 5

3.1.1 Thu nhận gen fgf 47

3.1.2 Thu nhận vector pET-19b 48

3.1.3 Tạo dòng tế bào E coli DH5α chứa vector tái tổ hợp pET-FGF 49

3.1.4 Chọn lọc dòng tế bào E coli mang vector tái tổ hợp pET-FGF 50

3.2 CẤU TRÚC CHỦNG BIỂU HIỆN E coli BL21(DE3) MANG VECTOR TÁI TỔ HỢP pET-FGF (E coli BL21(DE3)/pET-FGF) 54

3.2.1 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli BL21(DE3) bằng phương pháp hóa biến nạp 54

3.2.2 Sàng lọc dòng tế bào E coli BL21(DE3)/pET-FGF 55

3.3 XÁC ĐỊNH SỰ BIỂU HIỆN FGF-2 DẠNG TAN TRONG TẾ BÀO CHẤT

E coli 55

3.4 BƯỚC ĐẦU LÊN MEN BẰNG HỆ THỐNG LÊN MEN Ở QUY MÔ 1 LÍT ĐỂ THU NHẬN PROTEIN FGF-2 TÁI TỔ HỢP DẠNG TAN 57

3.5 KIỂM TRA HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH SỰ TĂNG SINH DÒNG TẾ BÀO 3T3 CỦA FGF-2 TÁI TỔ HỢP 60

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ 63

4.1 KẾT LUẬN 64

4.2 ĐỀ NGHỊ 64

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 69

Trang 6

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Amp Ampicillin

Amp r Ampicillin resistance

APS Alkaline Phosphatases

bp Pase pair

CBB Coomassie Brilliant Blue

cDNA Complementary Deoxyribose Nucleic Acid

DCW Dry cell weight

dH 2 O Distilled water (nước cất)

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DMEM/F12 Dulbecco’s Modifed Eagle’s Medium and Ham’s F12 medium DNA Deoxyribose Nucleic Acid

dNTP DeoxyNucleotide TriPhosphate

DTT Dithioerythritol

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic acid

FBS Fetal Bovin Serum

fgf Fibroblast Growth Factor Gene

FGF Fibroblast Growth Factor

FGFR Fibroblast Growth Factor Receptor

HRP Horseradish peroxidase

iFGF Intracellular Fibroblast Growth Factor

IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactoside

Kan Kanamycin

Kan r Kanamycin resistance

kDa kilo Dalton

MCS Multiple Cloning Site

mRNA Messenger Ribose Nucleic Acid

Trang 7

OD Optical Density

PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis

PBS Phosphate Buffered Saline

PBST Phosphate Buffered Saline Tween

PCA Phenol Chloroform isoamylalcohol

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribose Nucleic Acid

RNase Enzyme thuỷ giải RNA

rpm Round Per Minute

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel

TEMED Tetramethylethylenediamine

Trang 8

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Các vị trí dịch mã khác nhau tạo ra protein FGF-2 có kích thước

khác nhau 5

Hình 1.2 Cấu trúc gấp cuộn của FGF-2 6

Hình 1.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong chu chất ở E coli 15

Hình 1.4 Biểu hiện protein tái tổ hợp ra ngoại bào ở E coli 16

Hình 1.5 Cơ chế cảm ứng biểu hiện bởi IPTG 17

Hình 2.1 Plasmid pFGF 26

Hình 2.2 Plasmid pET-19b 27

Hình 2.3 Các thang chuẩn 27

Hình 2.4 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pET-FGF 28

Hình 2.5 Các vị trí lắp đặt thiết bị trên bình lên men 37

Hình 2.6 Hệ thống thiết bị lên men 38

Hình 2.7 Sơ đồ minh họa thứ tự các thành phần trong bước chuyển màng 43

Hình 3.1 Kết quả điện di kiểm tra plasmid pFGF 47

Hình 3.2 Kết quả điện di kiểm tra plasmid pET-19b 49

Hình 3.3 Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α 49

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc 50

Hình 3.5 Kết quả cắt kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc dương tính E coli

DH5α/pET-FGF trong phản ứng PCR khuẩn lạc 51

Hình 3.6 Kết quả kiểm tra các dòng E coli DH5α tái tổ hợp bằng PCR plasmid 52

Hình 3.7 Kết quả giải trình tự gen fgf trên vector tái tổ hợp pET-FGF 53

Hình 3.8 Kết quả biến nạp plasmid pET-FGF vào tế bào E coli BL21(DE3) 54

Hình 3.9 Kết quả PCR plasmid tách từ các dòng tế bào E coli

BL21(DE3)/pET-FGF 55

Hình 3.10 Kết quả kiểm tra sự biểu hiện FGF-2 bằng điện di SDS-PAGE

và lai Western Blot với kháng thể kháng FGF-2 56

Hình 3.11 Kết quả phân tích trọng lượng khô tế bào trong quá trình lên men 57

Trang 9

Hình 3.12 Hình điện di SDS-PAGE mẫu protein ở pha tan tại các thời điểm

lên men 58

Hình 3.13 Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein sau các chu kì phá tế

bào bằng phương pháp đồng nhất hóa dựa vào áp suất cao 59

Hình 3.14 Ảnh hưởng của mẫu FGF-2 tái tổ hợp lên trạng thái tế bào 3T3 61

Hình 3.15 Ảnh hưởng của mẫu FGF-2 tái tổ hợp lên sự tăng sinh của tế bào 3T3 61

Trang 10

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Chức năng FGF-2 ở những cơ quan khác nhau 8

Bảng 2.1 Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS – PAGE 41

Bảng 3.1 Nồng độ và độ tinh sạch của plasmid pFGF 47

Bảng 3.2 Nồng độ và độ tinh sạch của plasmid pET-19b 48

Bảng 3.3 Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2

trong pha tan (%) sau mỗi 2 giờ lên men 59

Bảng 3.4 Hiệu quả thu nhận FGF-2 ở chủng E coli BL21(DE3)/pET-FGF sau quá trình lên men 60

Trang 11

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang 12

1.1 NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF-2

1.1.1 Họ nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF

Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi được Amerlin tìm thấy lần đầu tiên trong dịch chiết tuyến yên vào năm 1973 [4] Năm 1974, Gospodarowicz công bố tìm thấy nhân tố tăng trưởng có tác dụng làm tăng sinh nguyên bào sợi trong dịch chiết não bò Sau đó, Gospodarowicz đã tiến hành phân đoạn dịch chiết này trong pH acid và base [7] Thí nghiệm này đã cô lập được hai dạng FGF khác nhau tương ứng với từng phân đoạn pH Nhân tố tăng trưởng thu nhận được ở pH acid gọi là FGF-1 và nhân tố tăng trưởng thu nhận được ở phân đoạn base gọi là FGF-2 Ngày nay, trên 23 nhân tố tăng trưởng đã được tìm thấy và được nghiên cứu về chức năng, cấu trúc,… Các nhân tố này bao gồm:

- FGF1- FGF10 là các nhân tố tăng trưởng có liên kết với thụ thể FGFR Trong

đó, FGF-1 (hay aFGF) có kích thước 16kDa là nhân tố tăng trưởng có tính acid và FGF-2 (hay bFGF) có kích thước 18kDa là nhân tố tăng trưởng có tính base

- FGF11, FGF12, FGF13, FGF14 là các FGF tương đồng và còn có tên gọi khác là FHF1-FHF4 (FGF homologous factors 1-4), chúng không bám vào FGFR nhưng tham gia vào quá trình hoạt hóa nội bào, nên còn được gọi là iFGF (intracellular FGF)

- FGF16 đến FGF23 là những protein mới và chưa biết rõ đặc điểm

Họ nhân tố tăng trưởng không những tương đồng cao về trình tự amino acid (13 -71%), cấu trúc gen cũng được bảo tồn cao giữa các loài động vật có xương sống Các protein thuộc họ này có ái lực cao với heparan sulfate proteoglycan Sự tương tác với

heparan sulfate giúp hoạt hóa một trong bốn receptor của FGF trên bề mặt tế bào [13]

1.1.2 Cấu trúc của FGF-2

FGF-2 được tìm thấy đầu tiên là dạng protein có 146 amino acid được phân lập

từ tuyến yên Khi FGF-2 cDNA được tạo dòng, codon AUG được xác định như codon

mở đầu cho quá trình dịch mã của protein gồm 155 amino acid và không có bất cứ codon AUG nào khác trong chuỗi polypeptide

Trang 13

Tuy nhiên, dựa vào trình tự cDNA tìm thấy trong não lợn, não chuột, gan, phôi người, tuyến tiền liệt và một vài dạng vi môi trường, người ta nhận thấy phân tử protein FGF-2 trên thực tế có thể dài hơn hoặc ngắn kích thước dự đoán Dạng ngắn hơn là kết quả của quá trình phân cắt phân tử FGF-2 155 amino acid Sự hình thành dạng trọng lượng phân tử lớn (196, 201 và 210 amino acid) đã được chứng minh bằng

phương pháp thống kê phiên mã/dịch mã in vitro cho thấy codon CUG ở đầu 5’ so với

codon AUG (được sử dụng là codon mở đầu cho quá trình dịch mã của dạng 155 amino acid) được sử dụng làm codon mở đầu cho quá trình dịch mã của các dạng có

Trang 14

đầu bằng codon AUG (18kDa) được tìm thấy nhiều trong tế bào chất Tuy nhiên, điều này còn tùy thuộc vào đặc điểm của tế bào thử nghiệm và mức độ biểu hiện của FGF-2 [5] Ngoài những protein có trọng lượng phân tử khác nhau như trên, một dạng FGF-2

hiếm gặp hơn cũng được tìm thấy có kích thước 34kDa (Hình 1.1) [13] Trong các

dạng FGF-2, FGF-2 có khối lượng phân tử 18kDa là dạng cơ bản vì trình tự amino acid của dạng này có trong các dạng còn lại

Phân tích FGF-2 tái tổ hợp bằng chiếu xạ tia X cho thấy protein này có dạng hình cầu, đường kính khoảng 4nm với lõi kị nước ở giữa và những vùng tích điện trên

bề mặt Phần lớn cấu trúc của FGF-2 có chứa 12 phiến β đối song và được sắp xếp thành 3 phần có cấu trúc đối xứng với nhau, cấu trúc gấp cuộn của 12 phiến β này tạo

thành lõi kị nước ở giữa (Hình 1.2) [12]

Hình 1.2 Cấu trúc gấp cuộn của FGF-2[12]

Các vị trí tích điện dương (Lys-138, Lys-134, Lys-128, Arg-129, Lys-144) trên protein FGF-2 được xác định là vị trí gắn heparin của protein FGF Vị trí gắn receptor của protein được tạo thành nhờ đoạn peptide 115-124 (chứa Tyr-123 and Trp-124) trên protein FGF-2 Trên cấu trúc không gian 3 chiều, phân tử FGF có 2 gốc cysteine (Cys-

78 và Cys-96) được lộ ra ngoài và 2 gốc cysteine khác (Cys-34 và Cys -101) được quay vào phía bên trong lõi kị nước Do đó, 4 cysteine có thể tạo thành 2 cầu nối

Trang 15

diusulfide Tuy nhiên, khi phân tích cấu trúc tinh thể thì khoảng cách giữa 2 cặp cysteine này quá xa để có thể hình thành cầu nối [13]

Phân tử FGF-2 tích điện dương ở vị trí Lys (vị trí gắn với heparin), sinh ra năng lượng trong phân tử, làm hoạt tính, cấu trúc của protein không ổn định Những phân tử tích điện âm như heparin tương tác với những vị trí này, làm cho FGF-2 trở nên ổn định hơn, bảo vệ FGF-2 chống lại tác động của nhiệt độ, pH cũng như tác động của protease Do đó, có thể kết luận rằng, những gốc sulfate trên heparin giúp ổn định hoạt tính của FGF-2 Hơn nữa, khi có những ion sulfate tồn tại trong dung dịch, nó cũng gắn vào các vị trí lysine trên FGF và đóng vai trò giúp ổn định hoạt tính của protein này giống như heparin Tuy nhiên, cả ion sulfate và heparin đều không ngăn được việc hình thành cầu nối disulfide nội/ngoại phân tử của các cystein tự do trong protein [13]

Ngoài ra, trên FGF-2 có hai vị trí gắn với FGFR:

- Vị trí gắn sơ cấp được tạo bởi các amino acid Y24, E96, N101, Y103, L140 và M142, tạo thành một nhóm kị nước trên bề mặt FGF2

- Vị trí gắn thứ cấp được tạo bởi các amino acid K110, Y111, và W114 trong trình tự mạch thẳng của FGF-2 (amino acid 106-115) [21]

FGF-2 là một phân tử góp phần vào quá trình hình thành mạch máu mới từ

mạch máu sẵn có (angiogenesis) trong in vivo và in vitro, kích thích sự tăng trưởng của

tế bào cơ mềm, chữa lành vết thương và sửa chữa mô Thêm vào đó, FGF-2 cũng có thể kích thích các tế bào máu và cũng có chức năng quan trọng trong sự biệt hóa và

đóng vai trò trong chức năng của nhiều hệ cơ quan (Bảng1.1)

Trang 16

Bảng 1.1 Chức năng FGF-2 ở những cơ quan khác nhau [5]

Cơ quan Chức năng

Giúp hạn chế xơ vữa và điều hòa áp lực máu

phôi

Quá trình tạo máu Kích thích hình thành bạch cầu

Cơ quan sinh sản Góp phần vào quá trình trưởng thành của tinh trùng

tín hiệu thần kinh

Ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào tạo sắc tố da Định hình sự phát triển của tế bào sừng

1.1.4 Ứng dụng của FGF-2

Là một protein đa chức năng, FGF-2 được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực bao gồm nuôi cấy tế bào, mỹ phẩm và y-sinh học

a) Ứng dụng của FGF-2 trong việc nuôi cấy tế bào gốc

Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa, có khả năng phân chia không hạn định trong điều kiện nuôi cấy phù hợp và biệt hóa thành các tế bào có hình dạng, chức năng chuyên biệt như tế bào cơ tim, tế bào da, tế bào thần kinh… Các tế bào gốc hoạt động như một hệ thống sửa chữa cho cơ thể, bù đắp cho tế bào chết đi trong suốt cuộc đời của mỗi sinh vật Như vậy, có thể nói tế bào gốc là nguồn gốc khởi đầu cho sự

sống của một cơ thể Với những đặc điểm như vậy, tế bào gốc đang dần chiếm lĩnh vị

trí đứng đầu trong lĩnh vực y-sinh học cả về nghiên cứu lẫn ứng dụng Để áp dụng tế

Trang 17

bào gốc vào chữa trị bệnh cũng như các ứng dụng khác, cần có một số lượng tế bào đủ lớn Do vậy, các nghiên cứu trước đây đã tìm ra nhiều cách thức để nuôi tế bào gốc như đồng nuôi cấy với lớp nguyên bào sợi của chuột (lớp feeder), nuôi trên màng nền laminin hoặc matrigel có bổ sung môi trường nuôi nguyên bào sợi của chuột hoặc nuôi trong môi trường có thành phần xác định Trong đó, việc xây dựng môi trường nuôi tế bào có thành phần xác định đang được ưa chuộng để dễ dàng trong việc kiểm soát và tối ưu hóa các thành phần, điều kiện nuôi Tuy nhiên, khi nuôi cấy trên môi trường này, các tế bào gốc thường bị biệt hóa thành các tế bào chức năng

Các kết quả nghiên cứu gần đây đã nhấn mạnh sự cần thiết của nhân tố FGF-2 trong việc duy trì trạng thái không biệt hóa của tế bào gốc phôi trong điều kiện nuôi không có lớp tế bào feeder Wang và cộng sự đã sử dụng FGF-2 ở nồng độ 26-36ng/ml

để tế bào duy trì trạng thái không biệt hóa sau 30 lần cấy chuyền Kết quả nghiên cứu của Xu và cộng sự cho thấy con đường tín hiệu BMP kích thích tế bào biệt hóa sẽ bị

ức chế bởi noggin và FGF-2 ở nồng độ cao Khi bổ sung vào môi trường nuôi 0,5µg/ml noggin và 40ng/ml FGF-2 thì các dòng tế bào gốc phôi người duy trì tình trạng không biệt hóa sau 18-32 lần cấy chuyền [22] Do vậy, hiện nay FGF-2 được sử dụng trong tất cả các môi trường nuôi tế bào gốc để duy trì trạng thái không biệt hóa của những tế bào này

b) Triển vọng của FGF-2 trong Y học

- Triển vọng của FGF-2 trong việc chữa trị bệnh tim thiếu máu cục bộ (ischemic heart disease)

Việc điều trị bệnh tim thiếu máu cục bộ vẫn đang là một thách thức lớn đối với

y học Nguyên nhân của bệnh là do sự tắt nghẽn động mạch vành dẫn đến việc giảm

mô cơ tim do thiếu oxy và các chất chuyển hóa quan trọng khác Một cách tiếp cận để khắc phục hiện tượng này là phục hồi lượng máu đến khu vực bị ảnh hưởng càng nhanh càng tốt Theo hướng này, một số phương pháp đã được phát triển như sử dụng bong bóng nong mạch vành, phẫu thuật bắc cầu mạch vành cũng như sử dụng các tác nhân tan huyết Các phương pháp tiếp cận này đã đem lại hiệu quả khả quan trong việc phục hồi lưu lượng máu và cải thiện chất lượng cuộc sống bệnh nhân nhưng lại cần

Trang 18

thời gian để phát huy hiệu quả trong khi các mô cơ tim vẫn tiếp tục chịu tình trạng thiếu máu cục bộ, do đó mức độ tổn thương càng tiến triển Bên cạnh đó, việc phục hồi lưu lượng máu đến tim sau thời gian tim bị thiếu máu cục bộ sẽ gây ra một tổn thương thứ cấp, gọi là tổn thương reperfusion (tổn thương tái thông máu) do cơ tim bị co lại dưới điều kiện stress oxy hóa, giảm pH, tăng canxi nội bào và tăng áp suất thẩm thấu Trước tình hình đó, các chất có tác dụng bảo vệ tim, trong đó có FGF-2 được sử dụng

để duy trì khả năng co bóp của cơ tim và làm giảm tổn thương reperfusion Tác dụng bảo vệ tim của FGF-2 bao gồm làm giảm tổn thương reperfusion, tái tạo cơ tim thông qua việc kích thích tăng sinh tế bào gốc tim và kích thích sự tạo thành mạch máu mới giúp làm tăng lưu lượng máu tới vùng tim bị thiếu máu cục bộ [8]

Hiệu quả sử dụng FGF-2 trong điều trị bệnh tim thiếu máu cục bộ đã được chứng minh trong thử nghiệm lâm sàng phase I trên 52 bệnh nhân không đáp ứng với các phương pháp điều trị thông thường Kết quả sau 6 tháng điều trị cho thấy hiệu quả tích cực của FGF-2 trong việc cải thiện cuộc sống của bệnh nhân, tăng cường khả năng vận động, tăng cường chức năng của tâm thất trái và giảm thiểu vùng bị thiếu máu [8] Tiếp theo thành công của thử nghiệm lâm sàng phase I, hiệu lực và tính an toàn của FGF-2 trong việc điều trị bệnh tim thiếu máu cục bộ đang được thử nghiệm lâm sang phase II với quy mô lớn hơn

- Triển vọng của FGF-2 trong việc phục hồi mô bao răng ở những bệnh nhân bị

viêm nha chu (periodontitis)

Viêm nha chu là bệnh do vi khuẩn tạo thành lớp màng bao quanh răng, phá hủy

mô bao răng bao gồm dây chằng nha chu, xương răng, xương ổ răng, nứu răng và có thể làm hư răng Trên khắp thế giới, bệnh viêm nha chu là một chứng bệnh phổ biến làm giảm chất lượng cuộc sống ở lứa tuổi trung niên và lứa tuổi già Một số thành công đã đạt được trong việc làm giảm sự phát triển của viêm nha chu như loại bỏ màng bám vi khuẩn bằng cơ học kết hợp với phẫu thuật Các phương pháp này giúp làm giảm sự viêm nhiễm nhưng không thể khôi phục lại nhưng mô bao răng bị mất cũng như cấu trúc và chức năng răng Để tái tạo những mô bao răng bị mất do viêm nha chu, nhiều biện pháp được sử dụng nhằm kích thích nguyên bào xương răng

Trang 19

(cementoblast) và nguyên bào xương (osteoblast) biệt hóa để hình thành chân răng và xương khoang răng Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự hiện diện của tế bào gốc trung mô trong dây chằn nha chu, tế bào gốc này sẽ được biệt hóa thành cementoblast

và osteoblast Do vậy, hiện nay nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tìm ra phương pháp mới để thúc đẩy sự tái sinh mô bao răng bằng cách ứng dụng những nhân

tố kích thích tế bào gốc trung mô tăng sinh và biệt hóa thành tế bào mô cứng

Do FGF-2 đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành mạch máu mới và có khả năng làm tăng sinh tế bào gốc trung mô, nhân tố tăng trưởng này được mong đợi

là có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh nhân bị viêm nha chu Các nghiên cứu

đã chứng minh FGF-2 có hiệu quả trong việc tái tạo mô bao răng trên các mô hình mô bao răng bị tổn thương nhân tạo ở chó săn và động vật linh trưởng

(Macaca fascicularis)

Hiện nay, FGF-2 trộn với hydroxypropylcelluloase được sử dụng như một tác nhân chữa bệnh viêm nha chu trong những nghiên cứu lâm sang phase II Thử nghiệm được tiến hành trên 13 trung tâm y tế ở Nhật, bao gồm 74 bệnh nhân bị viêm nha chu tham gia FGF-2 ở các nồng độ 0% (nhóm P), 0,03% (nhóm L), 0,1% (nhóm M) và 0,3% (nhóm H) được trộn với 3% hydroxypropylcelluloase Kết quả cho thấy khác biệt đáng kể về sự gia tăng chiều cao xương ổ răng sau 36 tuần ở các bệnh nhân nhóm

P (23,92%) vá nhóm H (58,62%) Sau 36 tuần, chiều cao xương ổ răng gia tăng tuyến tính ở nhóm P và nhóm H là 0,95 mm và 1,85 mm Ngoài ra, tính an toàn của FGF-2 cũng được chứng minh khi không có bất cứ biểu hiện bất lợi nào được ghi nhận [9]

- Ứng dụng FGF-2 trong việc ghép da ở những bệnh nhân bị bỏng

Sẹo lồi (keloid scars) hoặc sẹo phì đại (hypertrophic scars) có thể gây ra những tác hại khi hiện diện ở những vùng chức năng như khớp nối hay ảnh hưởng đến thẩm

mỹ khi xuất hiện ở các khu vực dễ thấy như mặt hoặc tay chân Những vết sẹo lớn do bỏng có xu hướng phát triển thành những sẹo phì đại và việc ghép da có thể giúp cải thiện chất lượng da cũng như rút ngắn thời gian nằm viện Tuy nhiên, làm lành vết thương do bỏng là một quá trình phức tạp do khả năng bị nhiễm khuẩn lớn Do đó, FGF-2 được sử dụng nhằm đẩy nhanh quá trình làm lành vết thương, giảm thiểu khả

Trang 20

năng nhiễm khuẩn FGF-2 đóng vai trò quan trọng trong việc làm lành vết thương ở da bằng cách hoạt hóa macrophage, tác dụng của nó sẽ kéo dài đến giai đoạn tổ chức lại

mô da diễn ra vài tuần sau khi da bị tổn thương Một cơ chế khác của FGF-2 tác động lên sự làm lành vết thương là kích thích sự tăng sinh của tế bào gốc trung mô, do đó đẩy nhanh quá trình đóng kín vết thương Để chứng minh hiệu quả của FGF-2, S Akita và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm trên 10 bệnh nhân bằng cách xử lý vết thương sau cấy ghép bằng FGF-2 với liều lượng 30µg trên 6 cm2

diện tích da, một ngày một lần cho đến khi vết thương khép kín Kết quả cho thấy khi so sánh với những bệnh nhân không được điều trị FGF-2, ở những bệnh nhân được điều trị FGF-2 sự hình thành biểu mô nhanh hơn 20% và vết sẹo mềm mại hơn tại thời điểm 1 năm sau khi vết thương đóng kín Loại thuốc FGF-2 được sử dụng trong nghiên cứu này

(Trafermin) cũng đã được phát triển và sử dụng rộng rãi trong việc làm lành vết

thương do bỏng ở Nhật Bản [3]

c) Ứng dụng của FGF-2 trong Mỹ phẩm

Nhân tố tăng trưởng FGF-2 có khả năng kích thích sự tăng sinh của nhiều loại

tế bào trong da bao gồm tế bào melanocyte, keratinocyte, những tế bào chính của lớp biểu bì và nguyên bào sợi trong hạ bì Nhiều nghiên cứu cho thấy FGF-2 có thể liên quan đến sự tái hình thành sắc tố da ở những đốm bạch biến (vitiligo macule) - một hiện tượng rối loạn sắc tố da tạo ra những đốm trắng trên da Những peptide có nguồn gốc từ FGF-2 đã được thử nghiệm lâm sàng trên những người bị bạch biến tại Ấn Độ

và đã thành công trong việc tái tạo sắc tố da cho 80% bệnh nhân tham gia

Ngoài ra, FGF-2 còn được xem là nhân tố ngăn ngừa lão hóa da hiệu quả Có nhiều yếu tố gây ra lão hóa da như tuổi già, tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, rối loạn về

da, sử dụng thuốc và do ảnh hưởng của môi trường… Nguyên nhân của lão hóa da là

do lượng collagen và decorin bị giảm Collagen là protein chủ yếu trong chất nền ngoại bào của da (chiếm 70% hạ bì da) và có chức năng làm căng da Decorin là proteoglycan đóng vai trò quan trọng trong viếc điều hòa lượng collagen trong da Collagen hiện diện trong da nhiểu nhất ở lứa tuổi 30 và giảm đi với tốc độ 1% mỗi năm Cả collagen và decorin đều giảm đi theo thời gian và dưới tác động của các nhân

Trang 21

tố gây tổn thương da làm da bị lão hóa và xuất hiện vết nhăn Các nghiên cứu cho thấy việc ứng dụng FGF-2 và các peptide có nguồn gốc từ FGF-2 có thể làm giảm vết nhăn của da Nguyên nhân của việc giảm nếp nhăn là do FGF-2 kích thích sự tăng sinh các các tế bào hạ bì, do đó làm tăng sự tổng hợp collagen [15]

Bên cạnh tác dụng chống lão hóa da, FGF-2 còn được chứng minh có khả năng làm đen tóc do tác dụng kích thích sự tăng sinh tế bào melanocyte trong nang tóc, đây

là tế bào sản xuất melanin giúp tóc có màu đen Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cho thấy FGF-2 có khả năng kích thích sự hình thành tế bào sinh tóc từ nhiều nguồn tế bào gốc khác nhau [19]

Do khả năng ngăn ngừa sự lão hóa da cũng như làm đen tóc, FGF-2 ngày càng được các hãng mỹ phẩm tin tưởng và bổ sung vào thành phần kem dưỡng da và dưỡng tóc như bộ sản phẩm bao gồm kem và dung dịch chống lão hóa da, mặt nạ dưỡng da, dung dịch bảo vệ tóc, kem ngăn ngừa vết nhăn ở mắt của hãng Dermaheal (Hàn Quốc), bộ sản phẩm chăm sóc da Skưnmedia, D’Mark (Philippine), bộ sản phẩm Skin Care Products, Elizabeth M Spiers, MD (Mỹ), bộ sản phẩm chăm sóc da của NS của

SB Secrect (Hàn Quốc)…

1.2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli

1.2.1 Giới thiệu chung

Vào những năm 1970, các thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp đầu tiên đã thành công ở vi khuẩn như hormon somatostatin, sau đó là insulin đều có giá trị cao ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học Từ các tế bào prokaryote (vi khuẩn) cho đến các tế bào eukaryote (động vật, nấm men, côn trùng) đều được sử dụng như nguồn tế bào chủ để sản xuất protein tái tổ hợp Lựa chọn tế bào thích hợp cho sản xuất còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như đặc điểm, ứng dụng của protein mục tiêu, cũng như các đặc điểm tăng trưởng, mức biểu hiện, các biến đổi hậu

dịch mã và chi phí Hiện nay, Escherichia coli là chủng chủ đang được sử dụng phổ

biến nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp do có những ưu thế nổi bật về tốc độ tăng

trưởng nhanh chóng, đạt được mật độ tế bào cao, phát triển trên môi trường đơn giản,

rẻ tiền, các đặc tính di truyền được hiểu biết rõ, sản lượng protein sản xuất cao (có thể

Trang 22

lên đến 50%), có nhiều chủng đột biến, nhiều vector tạo dòng thích hợp và thao tác di truyền dễ dàng

Protein tái tổ hợp được sản xuất ở E coli có thể thực hiện theo ba hướng: sản

xuất nội bào, trong chu chất, và sản xuất ngoại bào

a) Sản xuất nội bào

Là chiến lược được sử dụng phổ biến, tuy nhiên protein tái tổ hợp tạo ra ở dạng không tan (thể vùi), không có hoạt tính, đặc biệt là khi biểu hiện vượt mức, nên đòi hỏi phải tái gấp cuộn protein mục tiêu sau khi thu nhận Để khắc phục nhược điểm này đã

có nhiều cải tiến khác nhau như nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thấp, thay thế các

amino acid, sử dụng các chủng E coli khác nhau, đồng biểu hiện với chaperone gấp

cuộn, dung hợp hay đồng sản xuất với thioredoxin, thay đổi pH, nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện ở điều kiện stress… nhằm làm tăng khả năng tan của protein tái tổ hợp trong

tế bào chất của E coli

Một khía cạnh khác cần được quan tâm là sản xuất các protein có cầu nối

disulfide trong tế bào chất của E coli Do tế bào chất của E coli là môi trường có tính

oxy hoá khử thấp, thiếu hệ thống hình thành (protein DsbA và DsbB) hay có cơ chế ngăn chặn sự hình thành cầu nối nên protein mục tiêu có thể không có cầu nối disulfide hay có nhưng cấu hình sai Hướng giải quyết là đồng biểu hiện DsbA và DsbB, sử dụng các chủng đột biến gen trxB, nên sẽ không có enzyme thioredoxin reductase, giúp tăng khả năng hình thành các nhóm sulfuhydryl [10]

b) Biểu hiện trong chu chất

Mặc dù chỉ biểu hiện khoảng 4% protein trong tế bào nhưng vùng chu chất lại

có những ưu điểm nổi bật như môi trường oxi hoá khử giúp tăng tiềm năng hình thành cầu nối disulfide cũng như cấu hình chính xác, ngoài ra do số lượng protein tiết ra thấp nên khả năng tinh sạch protein đích tốt hơn, khả năng protein bị phân huỷ bởi protease thấp Tuy nhiên, đòi hỏi phải có sự tiết protein ra ngoài chu chất nên cần trình tự tín hiệu tiết Một số các peptide tín hiệu có thể được sử dụng là phoA, OmpT, OmpA, B-lactamase, PelB… Để tăng cường gấp cuộn có thể đồng biểu hiện với các chaperone

Trang 23

như: họ các protein Dsb, SurA, FkpA… Cũng có thể sử dụng các hệ thống tiết như

TAT, Sec YEG…(Hình 1.3) [6]

Hình 1.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong chu chất ở E coli [6]

c) Biểu hiện và tiết ra ngoại bào

Thông thường tế bào E coli chỉ tiết ra ngoài các protein gây độc và hemolysin,

nên protein được sản xuất tiết ra ngoại bào là rất ít Một số biện pháp có thể kiểm soát

sự tiết protein ra ngoài tế bào như các hoá chất sinh học, phương pháp vật lí (sốc thẩm thấu, đông lạnh), xử lí lysozyme, sốc chloroform Tuy nhiên những cách này chỉ dùng

sau khi thu hoạch tế bào

Phương pháp phổ biến là dung hợp protein đích với một protein mang mà bình

thường nó được tiết ra ngoài (như hemolysin), hay protein ngoài màng của E coli

Cũng có thể đồng biểu hiện với các gen mã hoá như kil, BRP (mã hoá protein giải

phóng bacteriocin),…(Hình 1.4) [6]

Trang 24

Hình 1.4 Biểu hiện protein tái tổ hợp ra ngoại bào ở E coli [6]

1.2.2 Một số hệ thống biểu hiện ở E coli

a) Hệ thống cảm ứng bởi IPTG

Ở hệ thống biểu hiện được cảm ứng bằng IPTG, chủng chủ được biến đổi di

truyền để có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase trong bộ gen Gen này được đặt dưới sự kiểm soát của lac promoter Ngoài ra, gen lacI cũng được chèn vào bộ gen để tạo lac repressor Khi không có sự hiện diện của IPTG trong môi trường, lac repressor tạo thành gắn với lac operator làm promoter lac bị bất hoạt, gen mã hóa cho T7

polymerase không được biểu hiện

Vector pET được thiết kế có T7 promoter và vùng MCS nằm sau T7 promoter

Gen mục tiêu sẽ được thiết kế chèn vào vector ở vùng MCS để được kiểm soát biểu

hiện bởi T7 promoter Ngoài ra, trên vector pET cũng có vị trí lac operator và gen lacI

mã hóa cho lac repressor để kiểm soát sự biểu hiện của T7 promoter

Khi có sự hiện diện của IPTG, IPTG sẽ gắn vào lac repressor ở vị trí allosteric, làm protein này thay đổi cấu hình và không thể gắn vào lac operator Nhờ đó lac promoter được hoạt hóa, gen mã hóa cho T7 RNA polymerase được biểu hiện tạo T7

Trang 25

RNA polymerase IPTG cũng giải phóng T7 promoter trên vector pET khỏi sự kiểm

soát của lac repressor Enzyme T7 RNA polymerase tạo thành sẽ gắn vào T7 promoter

đã đƣợc hoạt hóa giúp biểu hiện gen mục tiêu đã đƣợc tạo dòng vào vector (Hình 1.5)[17]

Hình 1.5 Cơ chế cảm ứng biểu hiện bởi IPTG [11]

Trang 26

trạng gây độc, cũng như không cần xử lí loại bỏ trong bước tinh sạch sản phẩm protein [20]

c) Hệ thống cảm ứng bởi L-arabinose

Promoter được sử dụng là pBAD với nhân tố kích hoạt AraC Khi môi trường có arabinose thì có sự điều hoà dương, ngược lại khi chỉ có glucose thì sự biểu hiện của operon bị ức chế Protein AraC hoạt động ở dạng dimer gắn vào 3 vị trí của operon arabinose là O1, O2, và I Khi vắng mặt arabinose thì dimer AraC sẽ tiếp xúc với vị trí O2 nằm trong vùng gen araC, cách promoter araBAD khoảng 210 cặp base Phần kia của dimer sẽ tiếp xúc với vị trí O1 trong vùng promoter, do đó hình thành DNA dạng loop Sự phiên mã của promoter AraBAD và araC sẽ bị ức chế bởi cấu hình loop này Khi có mặt arabinose thì chính arabinose sẽ gắn vào dimer AraC làm dimer này thay đổi cấu hình, lúc đó dimer không gắn vào vị trí O2 nữa mà gắn vào vị trí I, nhờ đó RNA polymerase bắt đầu hoạt động phiên mã

Đây là một hệ thống điều hoà mạnh, với chất cảm ứng không mắc tiền, trong quá trình lên men với hàm lượng cảm ứng 1% có thể đạt được sự biểu hiện tối ưu [20]

d) Hệ thống cảm ứng bởi muối

Cảm ứng bởi muối là phương pháp mới đơn giản, hiệu quả có thể áp dụng cho

sản xuất vượt mức protein tái tổ hợp Hệ thống này sử dụng chủng chủ E coli GJ1158 được thiết kế có promoter proU được cảm ứng bởi NaCl Để tăng cường biểu hiện, hệ thống cảm ứng muối có nhân tố phiên mã T7 RNA polymerase, do đó protein được

biểu hiện vượt mức với lượng lớn [20]

1.2.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E coli

Bên cạnh những ưu điểm đã được đề cập ở mục 1.2.1, một nhược điểm chính trong việc sử dụng E coli làm tế bào chủ để sản xuất protein tái tổ hợp là sản phẩm

này thường được tạo thành dưới dạng kết tụ không tan gọi là thể vùi Protein trong thể vùi không có hoạt tính, do đó cần phải trải qua quá trình hòa tan thể vùi bằng chất biến tính và tái gấp cuộn để thu được dạng có hoạt tính Quá trình này thường đạt hiệu suất thấp dẫn đến giá thành sản phẩm tăng cao Do vậy, các phương pháp tăng cường tính

Trang 27

tan của protein tái tổ hợp được quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm đơn giản hóa quy trình sản xuất protein tái tổ hợp với hiệu suất cao giúp giảm giá thành sản phẩm

Các biện pháp tăng cường tính tan của protein tái tổ hợp bao gồm [18]:

a) Các biện pháp biến đổi di truyền

- Sử dụng đuôi dung hợp: Các đuôi dung hợp như maltose binding protein

(MBP), E coli N-utilizing substance A (NusA), glutatione S-transferase (GST)… đã

được chứng minh có tác dụng làm tăng tính tan của protein mục tiêu Tuy nhiên, để thu được dạng protein có hoạt tính, các đuôi dung hợp này thường phải được loại bỏ khỏi protein mục tiêu Quá trình này thường có hiệu suất thấp, chi phí cao làm giảm hiệu suất của quy trình thu nhận protein và tăng giá thành sản phẩm

- Thay thế amino acid: Hướng tiếp cận khác có khả năng làm tăng tính tan của protein tái tổ hợp là thay thế các amino acid kỵ nước của protein thành các amino acid

ưa nước Tuy nhiên, biện pháp này có thể làm ảnh hưởng đến hoạt tính của protein và cần phải chứng minh tính an toàn của protein thu được, đặc biệt là những protein được

sử dụng làm thuốc

b) Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nhằm tăng cường tính tan của protein

Đây là biện pháp đơn giản, trong nhiều trường hợp nó có tác dụng tích cực

trong việc cải thiện tính tan của protein

- Giảm nhiệt độ nuôi cấy: Tương tác kỵ nước giữa các protein là nguyên nhân chính hình thành thể vùi Nhiệt độ cao thúc đẩy sự hình thành tương tác kỵ nước nên cũng thúc đẩy sự hình thành thể vùi Do vậy, một trong những phương pháp hiệu quả

giúp tăng cường tính tan của protein tái tổ hợp là giảm nhiệt độ nuôi cấy tế bào E coli

Mặt khác, nhiệt độ thấp cũng làm giảm tốc độ tổng hợp protein, giúp protein có đủ thời gian và không gian cho sự gấp cuộn đúng Tuy nhiên, việc giảm nhiệt độ nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của tế bào E coli Do đó cần phải lựa chọn nhiệt

độ nuôi cấy phù hợp nhằm làm tăng khả năng tan của protein nhưng duy trì được lượng sinh khối tế bào cao Bên cạnh đó, các biện pháp giảm lượng oxy hòa tan, thay đổi pH, thành phần môi trường cũng có thể tăng cường tính tan của protein tái tổ hợp

Trang 28

- Bổ sung các cofactor: Việc thêm vào các cofactor có thể đem đến hiệu quả khả quan trong việc làm tăng tính tan của protein Nhiều nghiên cứu cho thấy, việc bổ sung MgCl2 0,1mM có thể tăng cường tính tan của protein lên 50%

c) Đồng biểu hiện với chaperone

Chaperone hỗ trợ sự gấp cuộn của protein theo nhiều cách, một số chaperone thúc đẩy quá trình tái gấp cuộn, một số khác giúp ngăn ngừa sự hình thành thể vùi hoặc sửa chữa những cầu nối disulfide sai trong phân tử protein Do vậy, việc sử dụng chaperone nhằm tăng cường tính tan của protein mục tiêu là phương pháp được sử dụng phổ biến Tuy nhiên, hiệu quả làm tăng tính tan còn tùy thuộc vào loại chaperone được sử dụng cũng như phụ thuộc vào protein mục tiêu Do vậy, đối với mỗi loại protein cụ thể cần phải tiến hành khảo sát để tìm ra loại chaperone thích hợp

Tóm lại, có rất nhiều biện pháp nhằm làm tăng cường tính tan của protein tái tổ hợp Tuy nhiên, khả năng tan của protein tái tổ hợp còn tùy thuộc vào bản chất của protein, do đó phù hợp với những biện pháp tăng cường tính tan khác nhau và cần phải lựa chọn để đưa ra phương án phù hợp

Trang 29

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

Trang 30

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị

- Bộ pipetman 10, 20, 100, 1000, 5000l, các loại đầu tip tương ứng

- Các loại eppendof 0,2ml, 1,5ml

- Erlen 100ml, 250ml, 1000ml, ống đong, bercher, đĩa petri

- Đèn cồn, que cấy, bình tia chứa cồn, nước cất

- Máy ly tâm lạnh Mikro22R (Hettich Zentrifugen)

- Máy đo quang phổ Ultrospec 2000

- Máy lắc ổn nhiệt (Stuart Scientific)

- Máy đo nồng độ DNA Nanodrop

- Máy PCR (Biorad)

- Máy chụp hình gel Imagemaster VDS (Amersham Biosciences)

- Thiết bị chuyển màng lai Trans-Blot SD Semi-Dry (Biorad)

- Bộ điện di protein (Biorad)

- Bộ điện di ngang Horizon 58 (Life technology)

- Hộp đèn soi tia tử ngoại Hoefer (UVTM-19-230V)

- Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ)

- Máy lắc nước Grant GLS400 (Cambridge, Anh) và thiết bị làm lạnh đi kèm

- Hệ thống lên men tự động BioTron-LiFlus GX GX-05-12302 và các thiết bị phụ trợ như: máy nén khí, hệ thống nước giải nhiệt…

- Máy phá tế bào Model M-110EH-30 Microfluidizer Processor và hệ thống làm lạnh đi kèm

- Máy phá tế bào bằng sóng siêu âm Bioruptor

- Phần mềm Quantity One (Biorad)

2.1.2 Hóa chất

a) Hóa chất tách chiết plasmid từ vi khuẩn

- Dung dịch I: Glucose 50mM, Tris-HCl 2,5mM pH 8,0, EDTA 10mM pH 8,0

- Dung dịch II (pha trước khi sử dụng): 100l SDS 10%, 40l NaOH 5N, 860l

dH2O

Trang 31

- Dung dịch III: KOAc 5M, Glacial acetic 0,2M, pH 4,8

- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0

- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0) (giữ ở 4oC)

- Buffer 10X tương ứng (Fermentas, Đức)

- Mồi T7 promoter, T7 terminator (Bio Basic®, Canada)

- MilliQ

c) Hóa chất làm tế bào khả nạp vi khuẩn

- Dung dịch CaCl2 100mM vô trùng (giữ ở 4oC)

- Dung dịch MgCl2 80mM - CaCl2 20mM vô trùng (giữ ở 4oC)

- Dung dịch glycerol 80% vô trùng (giữ ở 4oC)

d) Hóa chất điện di DNA

- Dung dịch TAE: Tris acetate 40mM; EDTA 0,1M (pH 8,0)

- Dung dịch nạp mẫu DNA 6X: Bromophenol blue 0,25%; xylene cyanol 0,25%; glycerol 30% (pha trong TAE)

- Agarose

- Ethidium bromide 10%

e) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt hạn chế

- Enzyme cắt hạn chế: EcoRI, BamHI, XbaI (Fermentas, Đức)

- Buffer BamHI 10X (Fermentas, Đức)

- Buffer EcoRI 10X (Fermentas, Đức)

- MilliQ

Trang 32

g) Hóa chất dùng cho phản ứng nối

- Enzyme T4 DNA ligase (Fermentas, Đức)

- Buffer ligation 10X (Fermentas, Đức)

- MilliQ

h) Hoá chất dùng cho điện di SDS-PAGE

- Dung dịch điện di 5X (Tris - glycine buffer pH 8,3): Tris 15,1g, SDS 5g, glycine 94g pha trong 1 lít nước

- Tris - HCl 1,5M pH 8,8 (giữ ở 4oC)

- Tris - HCl 0,5M pH 6,8 (giữ ở 4oC)

- SDS 10%

- 40% acrylamide - 0,8% bis acrylamide (giữ ở 4oC)

- Ammonium persulphate (APS) (giữ ở 4oC)

- TEMED (N, N, N’, N’- tetramethylethylene diamine) (giữ ở 4oC)

- Dung dịch nạp mẫu 5X: Tris - HCl pH 6,8 10ml, DTT (dithiothreitol) 1,54g, SDS 0,4g, glycerol 4ml, bromophenol blue (dạng vết) pha trong 20ml dung dịch

- Dung dịch giải nhuộm: Ethanol tuyệt đối 100ml, glacial acetic acid100ml pha trong 1 lít dung dịch

i Hoá chất lai Western Blot

- Dung dịch Towbin: Tris-HCl 3g, glycine 14,4g, SDS 1g, nước cất đủ 800ml; methanol 200ml (thêm vào trước khi sử dụng)

- Dung dịch PBS: Na2HPO4 80mM, NaH2PO4 20mM, NaCl 100mM, pH 7,5

- Dung dịch PBST: dung dịch PBS 500ml, Tween20 2,5ml

- Dung dịch khóa màng: 5% sữa gầy trong dung dịch PBST

Trang 33

- Dung dịch chứa kháng thể anti-FGF: 10ml dung dịch PBST, 1µl kháng thể anti-FGF (10mg/ml) (Sigma)

- Dung dịch chứa kháng thể anti-Ig chuột-HRP: 10ml dung dịch PBST, 1µl kháng thể anti-Ig chuột-HRP (10mg/ml) (Sigma)

- Dung dịch phát hiện (Amersham): detection 1: detection 2 = 1:1

- Dung dịch hiện phim 5X

- Fixer 4X

j Hóa chất khác

- Dung dịch kháng sinh ampicillin 100mg/ml và kanamycin 50mg/ml

- Dung dịch IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) 1M (giữ ở -30oC)

- Các chất điều chỉnh pH trong quá trình lên men: NH4OH 15%, H3PO4 30%

- Chất phá bọt trong quá trình lên men: polyglycon

C sau khi hấp khử trùng (giữ ở 4oC)

- Môi trường LB-Kan30: môi trường LB bổ sung thêm kanamycin để nồng độ cuối là 30g/ml ở 40-45o

- Môi trường lên men:

+ Trace: ZnSO4.7H2O 0,288g/l, MnSO4.7H2O 0,142g/l, H3BO3 0,062g/l, NaMoO4.2H2O 0,048g/l, CoCl2.6H2O 0,048g/l, KI 0,083g/l, CaSO4.5H2O 0,125g/l,

H2SO4 0,25M 1ml/l

Trang 34

+ Môi trường lên men (pH = 7): Trypton 10g/l, cao nấm men 5g/l, KH2PO43g/l, Na2HPO4 6g/l, NaCl 0,5g/l, NH4Cl 0,5g/l, MgSO4 0,5g/l, CaCl2.2H2O 0,025g/l, citric acid 2g/l, glucose 0,5%, trace 1ml/l

- Môi trường nuôi cấy tế bào Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient MixtureF-12 (DMEM/F12) (Sigma), Fetal Bovin Serum (Sigma)

lac U169 (80 lacZ M15)) để dòng hóa plasmid tái tổ hợp

- Chủng E coli BL21(DE3) (F- dcm ompT hsdSB (r-B m-B) gal (DE3)) để biểu hiện protein tái tổ hợp

b) Plasmid

- Plasmid pFGF là plasmid chứa gen fgf mã hóa protein FGF-2 Hai đầu của gen fgf trên plasmid có trình tự nhận biết của BamHI và XbaI Plasmid này có kích thước 2551bp và mang gen kháng kanamycin (Hình 2.1)

Trang 35

enzyme cắt giới hạn giúp tạo dòng các gen mục tiêu vào plasmid T7 promoter điều hòa biểu hiện của gen mục tiêu đã chèn vào plasmid ở vùng MCS Gen lacI tham gia điều hòa T7 promoter và cả gen mục tiêu nằm sau promoter Trên plasmid còn có điểm ori giúp plasmid đƣợc nhân bản với số lƣợng lớn (Hình 2.2)

Hình 2.2 Plasmid pET-19b c) Các thang chuẩn

Hình 2.3 Các thang chuẩn

1, Thang chuẩn DNA 100bp (Fermentas, Đức); 2, Thang chuẩn DNA 1 Kbp (Fermentas, Đức); 3, Thang chuẩn protein phân tử lượng thấp (Amersham, Mỹ)

d) Các vật liệu sinh học khác

- Dòng tế bào nguyên bào sợi chuột NIH 3T3

- Protein FGF-2 chuẩn (Sigma)

- Kháng thể F6162 kháng FGF-2 (Sigma)

1 2

3 3

Trang 36

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Cấu trúc vector tái tổ hợp pET-FGF mang gen mã hóa protein FGF-2

a) Sơ đồ dòng hóa

Quy trình tạo vetor tái tổ hợp pET-FGF được trình bày như (Hình 2.4)

Hình 2.4 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pET-FGF

Ngày đăng: 08/10/2014, 18:16

HÌNH ẢNH LIÊN QUAN

Hình 1.1. Các vị trí dịch mã khác nhau tạo ra protein FGF-2 có kích thước khác nhau  (18; 22; 22,5; 24 và 34 kDa) [13] - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 1.1. Các vị trí dịch mã khác nhau tạo ra protein FGF-2 có kích thước khác nhau (18; 22; 22,5; 24 và 34 kDa) [13] (Trang 13)
Hình 1.2. Cấu trúc gấp cuộn của FGF-2[12]. - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 1.2. Cấu trúc gấp cuộn của FGF-2[12] (Trang 14)
Bảng 1.1. Chức năng FGF-2 ở những cơ quan khác nhau [5]. - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Bảng 1.1. Chức năng FGF-2 ở những cơ quan khác nhau [5] (Trang 16)
Hình 1.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong chu chất ở E. coli [6]. - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 1.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong chu chất ở E. coli [6] (Trang 23)
Hình 1.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp ra ngoại bào ở E. coli [6]. - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 1.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp ra ngoại bào ở E. coli [6] (Trang 24)
Hình 1.5. Cơ chế cảm ứng biểu hiện bởi IPTG [11]. - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 1.5. Cơ chế cảm ứng biểu hiện bởi IPTG [11] (Trang 25)
Hình 2.1. Plasmid pFGF - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 2.1. Plasmid pFGF (Trang 34)
Hình 2.2. Plasmid pET-19b  c) Các thang chuẩn - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 2.2. Plasmid pET-19b c) Các thang chuẩn (Trang 35)
Hình 2.4. Quy trình tạo vector tái tổ hợp pET-FGF - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 2.4. Quy trình tạo vector tái tổ hợp pET-FGF (Trang 36)
Hình 2.5. Các vị trí lắp đặt thiết bị trên bình lên men - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 2.5. Các vị trí lắp đặt thiết bị trên bình lên men (Trang 45)
Hình 2.6. Hệ thống thiết bị lên men  b) Lên men cảm ứng biểu hiện FGF-2 - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 2.6. Hệ thống thiết bị lên men b) Lên men cảm ứng biểu hiện FGF-2 (Trang 46)
Bảng 2.1. Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS - PAGE - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Bảng 2.1. Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS - PAGE (Trang 49)
Hình 2.7. Sơ đồ minh họa thứ tự các thành phần trong bước chuyển màng - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 2.7. Sơ đồ minh họa thứ tự các thành phần trong bước chuyển màng (Trang 51)
Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch của plasmid pFGF - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch của plasmid pFGF (Trang 55)
Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α (Trang 57)
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra plasmid pET-19b - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra plasmid pET-19b (Trang 57)
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc (Trang 58)
Hình 3.5. Kết quả cắt kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc dương tính E. coli DH5α/pET- DH5α/pET-FGF trong phản ứng PCR khuẩn lạc - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.5. Kết quả cắt kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc dương tính E. coli DH5α/pET- DH5α/pET-FGF trong phản ứng PCR khuẩn lạc (Trang 59)
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra dòng E. coli DH5α/pET-FGF bằng PCR plasmid. - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra dòng E. coli DH5α/pET-FGF bằng PCR plasmid (Trang 60)
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gen fgf trên vector tái tổ hợp pET-FGF - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gen fgf trên vector tái tổ hợp pET-FGF (Trang 61)
Hình 3.8. Kết quả biến nạp plasmid pET-FGF vào tế bào E. coli BL21(DE3)  1, Tế bào E. coli BL21(DE3)/ pET-FGF; 2, Đối chứng tế bào E - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.8. Kết quả biến nạp plasmid pET-FGF vào tế bào E. coli BL21(DE3) 1, Tế bào E. coli BL21(DE3)/ pET-FGF; 2, Đối chứng tế bào E (Trang 62)
Hình 3.9. Kết quả PCR plasmid tách từ các dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET-FGF. - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.9. Kết quả PCR plasmid tách từ các dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET-FGF (Trang 63)
Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện FGF-2 bằng điện di SDS-PAGE (A) và lai  Western Blot với kháng thể kháng FGF-2 (B) - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện FGF-2 bằng điện di SDS-PAGE (A) và lai Western Blot với kháng thể kháng FGF-2 (B) (Trang 64)
Hình 3.11. Kết quả phân tích trọng lượng khô tế bào trong quá trình lên men - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.11. Kết quả phân tích trọng lượng khô tế bào trong quá trình lên men (Trang 65)
Hình 3.12. Hình điện di SDS-PAGE mẫu protein ở pha tan tại các thời điểm lên men. - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.12. Hình điện di SDS-PAGE mẫu protein ở pha tan tại các thời điểm lên men (Trang 66)
Hình 3.13. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein sau các chu kì phá tế bào  bằng phương pháp đồng nhất hóa dựa vào áp suất cao - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.13. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein sau các chu kì phá tế bào bằng phương pháp đồng nhất hóa dựa vào áp suất cao (Trang 67)
Bảng 3.3. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 trong  pha tan (%) sau mỗi 2 giờ lên men - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Bảng 3.3. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 trong pha tan (%) sau mỗi 2 giờ lên men (Trang 67)
Hình 3.14. Ảnh hưởng của mẫu FGF-2 tái tổ hợp lên trạng thái tế bào 3T3. - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.14. Ảnh hưởng của mẫu FGF-2 tái tổ hợp lên trạng thái tế bào 3T3 (Trang 69)
Hình 3.15. Ảnh hưởng của mẫu FGF-2 tái tổ hợp lên sự tăng sinh của tế bào 3T3. - Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
Hình 3.15. Ảnh hưởng của mẫu FGF-2 tái tổ hợp lên sự tăng sinh của tế bào 3T3 (Trang 69)

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TRÍCH ĐOẠN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w