Nghiên cứu sản xuất protein fgt 2 (fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli

LỜI CÁM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng tri ân đến Giáo sư, Tiến sĩ TRẦN LINH THƯỚC, người đã dạy dỗ và tạo điều kiện tốt nhất cho em được học tập và hoàn thành luận văn này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Tiến sĩ VÕ MINH TRÍ, Tiến sĩ ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO và Tiến sĩ TRẦN VĂN HIẾU vì đã giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn chị KIM HẰNG, chị PHƯƠNG HIẾU, anh THANH HÒA, bạn VĂN ĐỨC, các em MAI PHƯƠNG, TUYẾT HUỆ, HƯƠNG GIANG cùng tất cả các anh chị, các bạn và các em trong Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử & Môi trường, Phòng Thí Nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử và Trung tâm Khoa học & Công nghệ Sinh học đã động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Và trên hết, con cảm ơn BA, MẸ và gia đình đã luôn ở bên con, nuôi nấng, dạy dỗ, yêu thương và ủng hộ để con có được ngày hôm nay. BA, MẸ và gia đình sẽ luôn là chỗ dựa vững chắc và là niềm tự hào của con. TP. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2011. Nguyễn Thị Mỹ Trinh - 1 - Luận văn thạc sĩ sinh học LỜI MỞ ĐẦU Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2) là một protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động của nhiều quá trình trong cơ thể nhƣ cân bằng nội mô, ngăn chặn quá trình xơ hóa ở phổi, duy trì và tăng sinh tế bào thần kinh, chữa lành xƣơng bị tổn thƣơng, kích thích hình thành tế bào bạch cầu, kích thích sự hình thành mạch máu mới từ mạch máu sẵn có, kích thích sự tăng trƣởng của tế bào cơ mềm, chữa lành vết thƣơng và sửa chữa mô… Do sự đa dạng về chức năng, FGF-2 đang đƣợc quan tâm nghiên cứu để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Nhờ khả năng kích thích tăng sinh, ức chế biệt hóa, FGF-2 đang đƣợc sử dụng nhƣ là thành phần không thể thiếu trong nuôi cấy tế bào gốc phôi ngƣời. Trong công nghệ mỹ phẩm, một số nghiên cứu cho thấy FGF-2 có khả năng làm đen tóc, ngăn ngừa sự lão hóa da nên ngày càng đƣợc các hãng mỹ phẩm tin tƣởng và bổ sung vào các bộ sản phẩm chăm sóc da, tóc. Bên cạnh đó, trong lĩnh vực y học, việc sử dụng FGF-2 đã đem lại nhiều kết quả khả quan trong việc điều trị nhiều căn bệnh nhƣ bệnh thiếu máu tim cục bộ, điều trị bỏng, ngăn ngừa sẹo do phẫu thuật, chữa bệnh viêm nha chu… Trƣớc đây, sản phẩm FGF-2 thƣờng đƣợc thu nhận bằng cách tách chiết từ các dòng tế bào động vật. Việc sản xuất FGF-2 bằng phƣơng pháp này đảm bảo về hoạt tính của sản phẩm nhƣng sản lƣợng thấp và giá thành cao. Nhằm khắc phục những nhƣợc điểm trên, ngƣời ta đã tiến đến việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ để sản xuất nhân tố FGF-2. Do đặc điểm của FGF-2 là không có cấu nối disulfide nội phân tử và không cần sự biến đổi sau dịch mã cho hoạt tính sinh học nên hệ thống chủng chủ E.coli có thể đảm nhiệm việc sản xuất FGF-2 có hoạt tính thay cho các dòng tế bào động vật. Ở Việt Nam, FGF-2 chủ yếu đƣợc nhập từ các công ty nƣớc ngoài nên giá thành rất cao (1mg protein FGF-2 ngƣời đƣợc sản xuất nhờ kĩ thuật gen có giá khoảng 1260 USD, ProSpec) gây khó khăn trong việc ứng dụng. Do đó, việc sản xuất FGF-2 trong nƣớc nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng trên diện rộng với giá thành thấp cần đƣợc quan tâm đầu tƣ. - 2 - Luận văn thạc sĩ sinh học Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu sản xuất protein FGF-2 tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli” nhằm tìm ra phƣơng án sản xuất FGF-2 hiệu quả, kinh tế cho những ứng dụng trong nƣớc. Tuy nhiên, một trong những hạn chế của việc sử dụng E. coli làm tế bào chủ là protein thƣờng đƣợc tạo ra dƣới dạng thể vùi không có hoạt tính, cần phải trải qua quá trình gấp cuộn phức tạp, tốn kém. Do vậy, luận văn này đƣợc thực hiện với mục đích xây dựng quy trình sản xuất FGF-2 trong đó sử dụng chủng chủ E. coli để cảm ứng biểu hiện protein dạng tan trong tế bào chất. Đây là hƣớng chiến lƣợc hiệu quả và triển vọng cho phép sản xuất FGF-2 có hoạt tính một cách đơn giản với hiệu suất cao, giúp hạ giá thành sản phẩm. Với mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện luận văn với những nội dung sau: - Tạo dòng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF có khả năng biểu hiện vƣợt mức protein FGF-2 tái tổ hợp. - Biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli BL21(DE3)/pET-FGF. - Bƣớc đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít nhằm thu nhận FGF- 2 tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli. - Chứng minh hoạt tính kích thích tăng sinh dòng tế bào 3T3 của FGF-2 tái tổ hợp. - i - Luận văn thạc sĩ sinh học MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. NHÂN TỐ TĂNG TRƢỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF-2 4 1.1.1. Họ nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF 4 1.1.2. Cấu trúc của FGF-2 4 1.1.3. Chức năng của FGF-2 7 1.1.4. Ứng dụng của FGF-2 8 1.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 13 1.2.1. Giới thiệu chung 13 1.2.2. Một số hệ thống biểu hiện ở E. coli 16 1.2.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli 18 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU-PHƢƠNG PHÁP 21 2.1. VẬT LIỆU 22 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị 22 2.1.2. Hóa chất 22 2.1.3. Môi trƣờng 25 2.1.4. Vật liệu sinh học 26 2.2. PHƢƠNG PHÁP 28 2.2.1 Cấu trúc vector tái tổ hợp pET-FGF mang gen mã hóa protein FGF-2 28 2.2.2. Cấu trúc chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET- FGF (E. coli BL21(DE3)/pET-FGF) 36 2.2.3. Xác nhận sự biểu hiện FGF-2 dạng tan trong tế bào chất E. coli BL21(DE3) 36 2.2.4. Bƣớc đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp ở dạng tan 37 2.2.5. Kiểm tra hoạt tính kích thích tăng sinh dòng tế bào 3T3 của FGF-2 tái tổ hợp [23] 40 2.2.6. Các phƣơng pháp phân tích protein 41 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN 46 3.1. CẤU TRÚC VECTOR TÁI TỔ HỢP pET-FGF MANG GEN MÃ HÓA PROTEIN FGF-2 47 - ii - Luận văn thạc sĩ sinh học 3.1.1. Thu nhận gen fgf 47 3.1.2. Thu nhận vector pET-19b 48 3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa vector tái tổ hợp pET-FGF 49 3.1.4. Chọn lọc dòng tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET-FGF 50 3.2. CẤU TRÚC CHỦNG BIỂU HIỆN E. coli BL21(DE3) MANG VECTOR TÁI TỔ HỢP pET-FGF (E. coli BL21(DE3)/pET-FGF) 54 3.2.1. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli BL21(DE3) bằng phƣơng pháp hóa biến nạp 54 3.2.2. Sàng lọc dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET-FGF 55 3.3. XÁC ĐỊNH SỰ BIỂU HIỆN FGF-2 DẠNG TAN TRONG TẾ BÀO CHẤT E. coli 55 3.4. BƢỚC ĐẦU LÊN MEN BẰNG HỆ THỐNG LÊN MEN Ở QUY MÔ 1 LÍT ĐỂ THU NHẬN PROTEIN FGF-2 TÁI TỔ HỢP DẠNG TAN 57 3.5. KIỂM TRA HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH SỰ TĂNG SINH DÒNG TẾ BÀO 3T3 CỦA FGF-2 TÁI TỔ HỢP 60 CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ 63 4.1. KẾT LUẬN 64 4.2. ĐỀ NGHỊ 64 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 69 - iii - Luận văn thạc sĩ sinh học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicillin Amp r Ampicillin resistance APS Alkaline Phosphatases bp Pase pair CBB Coomassie Brilliant Blue cDNA Complementary Deoxyribose Nucleic Acid DCW Dry cell weight dH 2 O Distilled water (nƣớc cất) DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMEM/F12 Dulbecco’s Modifed Eagle’s Medium and Ham’s F12 medium DNA Deoxyribose Nucleic Acid dNTP DeoxyNucleotide TriPhosphate DTT Dithioerythritol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic acid FBS Fetal Bovin Serum fgf Fibroblast Growth Factor Gene FGF Fibroblast Growth Factor FGFR Fibroblast Growth Factor Receptor HRP Horseradish peroxidase iFGF Intracellular Fibroblast Growth Factor IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactoside Kan Kanamycin Kan r Kanamycin resistance kDa kilo Dalton LB Môi trƣờng Luria-Bertani MCS Multiple Cloning Site mRNA Messenger Ribose Nucleic Acid - iv - Luận văn thạc sĩ sinh học OD Optical Density PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBS Phosphate Buffered Saline PBST Phosphate Buffered Saline Tween PCA Phenol Chloroform isoamylalcohol PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribose Nucleic Acid RNase Enzyme thuỷ giải RNA rpm Round Per Minute SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel TEMED Tetramethylethylenediamine - v - Luận văn thạc sĩ sinh học DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Các vị trí dịch mã khác nhau tạo ra protein FGF-2 có kích thước khác nhau 5 Hình 1.2. Cấu trúc gấp cuộn của FGF-2 6 Hình 1.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong chu chất ở E. coli 15 Hình 1.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp ra ngoại bào ở E. coli 16 Hình 1.5. Cơ chế cảm ứng biểu hiện bởi IPTG 17 Hình 2.1. Plasmid pFGF 26 Hình 2.2. Plasmid pET-19b 27 Hình 2.3. Các thang chuẩn 27 Hình 2.4. Quy trình tạo vector tái tổ hợp pET-FGF 28 Hình 2.5. Các vị trí lắp đặt thiết bị trên bình lên men 37 Hình 2.6. Hệ thống thiết bị lên men 38 Hình 2.7. Sơ đồ minh họa thứ tự các thành phần trong bước chuyển màng 43 Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra plasmid pFGF 47 Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra plasmid pET-19b 49 Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α 49 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc 50 Hình 3.5. Kết quả cắt kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc dương tính E. coli DH5α/pET-FGF trong phản ứng PCR khuẩn lạc 51 Hình 3.6. Kết quả kiểm tra các dòng E. coli DH5α tái tổ hợp bằng PCR plasmid 52 Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gen fgf trên vector tái tổ hợp pET-FGF 53 Hình 3.8. Kết quả biến nạp plasmid pET-FGF vào tế bào E. coli BL21(DE3) 54 Hình 3.9. Kết quả PCR plasmid tách từ các dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET-FGF 55 Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện FGF-2 bằng điện di SDS-PAGE và lai Western Blot với kháng thể kháng FGF-2 56 Hình 3.11. Kết quả phân tích trọng lượng khô tế bào trong quá trình lên men 57 - vi - Luận văn thạc sĩ sinh học Hình 3.12. Hình điện di SDS-PAGE mẫu protein ở pha tan tại các thời điểm lên men. 58 Hình 3.13. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein sau các chu kì phá tế bào bằng phương pháp đồng nhất hóa dựa vào áp suất cao 59 Hình 3.14. Ảnh hưởng của mẫu FGF-2 tái tổ hợp lên trạng thái tế bào 3T3 61 Hình 3.15. Ảnh hưởng của mẫu FGF-2 tái tổ hợp lên sự tăng sinh của tế bào 3T3 61 - vii - Luận văn thạc sĩ sinh học DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Chức năng FGF-2 ở những cơ quan khác nhau 8 Bảng 2.1. Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS – PAGE 41 Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch của plasmid pFGF 47 Bảng 3.2. Nồng độ và độ tinh sạch của plasmid pET-19b 48 Bảng 3.3. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 trong pha tan (%) sau mỗi 2 giờ lên men 59 Bảng 3.4. Hiệu quả thu nhận FGF-2 ở chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF sau quá trình lên men 60 [...]... biết rõ, sản lƣợng protein sản xuất cao (có thể Luận văn thạc sĩ sinh học - 14 - lên đến 50%), có nhiều chủng đột biến, nhiều vector tạo dòng thích hợp và thao tác di truyền dễ dàng Protein tái tổ hợp đƣợc sản xuất ở E coli có thể thực hiện theo ba hƣớng: sản xuất nội bào, trong chu chất, và sản xuất ngoại bào a) Sản xuất nội bào Là chiến lƣợc đƣợc sử dụng phổ biến, tuy nhiên protein tái tổ hợp tạo... T7 RNA polymerase, do đó protein đƣợc biểu hiện vƣợt mức với lƣợng lớn [20 ] 1 .2. 3 Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E coli Bên cạnh những ƣu điểm đã đƣợc đề cập ở mục 1 .2. 1, một nhƣợc điểm chính trong vi c sử dụng E coli làm tế bào chủ để sản xuất protein tái tổ hợp là sản phẩm này thƣờng đƣợc tạo thành dƣới dạng kết tụ không tan gọi là thể vùi Protein trong thể vùi không có hoạt... ra protein FGF -2 có kích thước khác nhau (18; 22 ; 22 ,5; 24 và 34 kDa) [13] Quá trình dịch mã khác nhau xảy ra do tồn tại các vị trí gắn ribosome khác nhau trong mRNA của FGF -2 Khi biểu hiện FGF -2 cDNA trong tế bào và phân tách bằng kỹ thuật SDS-PAGE, dạng mở đầu bằng AUG và 3 dạng mở đầu bằng CUG cho thấy trọng lƣợng phân tử lần lƣợt là 18; 22 ; 22 ,5; và 24 kDa Dạng mở đầu bằng codon CUG (22 ; 22 ,5 và 24 ... sóc da của NS của SB Secrect (Hàn Quốc)… 1 .2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 1 .2. 1 Giới thiệu chung Vào những năm 1970, các thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp đầu tiên đã thành công ở vi khuẩn nhƣ hormon somatostatin, sau đó là insulin đều có giá trị cao ứng dụng trong công nghiệp dƣợc phẩm và công nghệ sinh học Từ các tế bào prokaryote (vi khuẩn) cho đến các tế bào eukaryote (động... đƣợc sử dụng nhƣ nguồn tế bào chủ để sản xuất protein tái tổ hợp Lựa chọn tế bào thích hợp cho sản xuất còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ đặc điểm, ứng dụng của protein mục tiêu, cũng nhƣ các đặc điểm tăng trƣởng, mức biểu hiện, các biến đổi hậu dịch mã và chi phí Hiện nay, Escherichia coli là chủng chủ đang đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp do có những ƣu thế nổi bật về tốc... cấu trúc gấp cuộn của 12 phiến β này tạo thành lõi kị nƣớc ở giữa (Hình 1 .2) [ 12] Hình 1 .2 Cấu trúc gấp cuộn của FGF -2[ 12] Các vị trí tích điện dƣơng (Lys-138, Lys-134, Lys- 128 , Arg- 129 , Lys-144) trên protein FGF -2 đƣợc xác định là vị trí gắn heparin của protein FGF Vị trí gắn receptor của protein đƣợc tạo thành nhờ đoạn peptide 115- 124 (chứa Tyr- 123 and Trp- 124 ) trên protein FGF -2 Trên cấu trúc không... có thể tăng cƣờng tính tan của protein tái tổ hợp Luận văn thạc sĩ sinh học - 20 - - Bổ sung các cofactor: Vi c thêm vào các cofactor có thể đem đến hiệu quả khả quan trong vi c làm tăng tính tan của protein Nhiều nghiên cứu cho thấy, vi c bổ sung MgCl2 0,1mM có thể tăng cƣờng tính tan của protein lên 50% c) Đồng biểu hiện với chaperone Chaperone hỗ trợ sự gấp cuộn của protein theo nhiều cách, một số... thích hợp Tóm lại, có rất nhiều biện pháp nhằm làm tăng cƣờng tính tan của protein tái tổ hợp Tuy nhiên, khả năng tan của protein tái tổ hợp còn tùy thuộc vào bản chất của protein, do đó phù hợp với những biện pháp tăng cƣờng tính tan khác nhau và cần phải lựa chọn để đƣa ra phƣơng án phù hợp Luận văn thạc sĩ sinh học - 21 - CHƢƠNG II VẬT LIỆU-PHƢƠNG PHÁP Luận văn thạc sĩ sinh học - 22 - 2. 1 VẬT LIỆU 2. 1.1... sung thêm 2% agar (giữ ở 4oC) - Môi trƣờng LB-Kan30 agar: môi trƣờng LB-Kan30 lỏng bổ sung thêm 2% agar (giữ ở 4oC) - Môi trƣờng lên men: + Trace: ZnSO4.7H2O 0 ,28 8g/l, MnSO4.7H2O 0,142g/l, H3BO3 0,062g/l, NaMoO4.2H2O 0,048g/l, CoCl2.6H2O 0,048g/l, KI 0,083g/l, CaSO4.5H2O 0, 125 g/l, H2SO4 0 ,25 M 1ml/l Luận văn thạc sĩ sinh học - 26 - + Môi trƣờng lên men (pH = 7): Trypton 10g/l, cao nấm men 5g/l, KH2PO4 3g/l,... và tái gấp cuộn để thu đƣợc dạng có hoạt tính Quá trình này thƣờng đạt hiệu suất thấp dẫn đến giá thành sản phẩm tăng cao Do vậy, các phƣơng pháp tăng cƣờng tính Luận văn thạc sĩ sinh học - 19 - tan của protein tái tổ hợp đƣợc quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm đơn giản hóa quy trình sản xuất protein tái tổ hợp với hiệu suất cao giúp giảm giá thành sản phẩm Các biện pháp tăng cƣờng tính tan của protein . sinh học Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu sản xuất protein FGF-2 tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli nhằm tìm ra phƣơng án sản xuất FGF-2. HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 13 1.2.1. Giới thiệu chung 13 1.2.2. Một số hệ thống biểu hiện ở E. coli 16 1.2.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli. E. coli DH5α chứa vector tái tổ hợp pET-FGF 49 3.1.4. Chọn lọc dòng tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET-FGF 50 3.2. CẤU TRÚC CHỦNG BIỂU HIỆN E. coli BL21(DE3) MANG VECTOR TÁI TỔ HỢP