E. coli
3.4. BƢỚC ĐẦU LÊN MEN BẰNG HỆ THỐNG LÊN MEN Ở QUY MÔ 1 LÍT
ĐỂ THU NHẬN PROTEIN FGF-2 TÁI TỔ HỢP DẠNG TAN
Quá trình lên men sản xuất FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FGF đƣợc tiến hành bằng hệ thống lên men tự động. Sự tăng trƣởng của chủng trong suốt quá trình lên men đƣợc theo dõi gián tiếp thông qua việc phân tích trọng lƣợng khô tế bào sau mỗi 2 giờ lên men. Kết quả phân tích trọng lƣợng khô tế bào đƣợc trình bày trong Hình 3.11.
Hình 3.11. Kết quả phân tích trọng lượng khô tế bào trong quá trình lên men
Nhìn chung, trọng lƣợng khô của tế bào tăng dần trong suốt quá trình lên men. Điều này phù hợp với đặc trƣng tăng trƣởng của chủng, chứng tỏ quá trình lên men và cảm ứng không bị nhiễm. Ở cuối quá trình lên men (giờ thứ 24), lƣợng sinh khối giảm. Đây có thể là do chủng bƣớc vào pha suy vong hoặc do sai số nhất định. Do đó, cần có những khảo sát và phân tích sâu hơn để đánh giá chính xác tình trạng tăng trƣởng của chủng trong suốt quá trình lên men và quyết định thời điểm dừng lên men mang lại hiệu quả lên men cao nhất.
Nhằm theo dõi sự biểu hiện protein FGF-2 của chủng trong quá trình lên men, chúng tôi tiến hành thu mẫu sau mỗi 2 giờ lên men để điện di SDS-PAGE. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein hòa tan trong suốt tiến trình lên men đƣợc trình bày trong Hình 3.12.
Hình 3.12. Hình điện di SDS-PAGE mẫu protein ở pha tan tại các thời điểm lên men. 1, Thang phân tử lượng protein; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, BL21(DE3)/pET-FGF sau
6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, giờ lên men.
Tại thời điểm giờ lên men thứ 6, chất cảm ứng IPTG đƣợc bổ sung và protein mục tiêu bắt đầu đƣợc tạo thành. Do đó, ở giờ nuôi cấy thứ 6 (giếng 2) không có sự biểu hiện của protein mục tiêu. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy bắt đầu từ giờ nuôi cấy thứ 8 (giếng 3) vạch protein mục tiêu xuất hiện và mức độ biểu hiện của protein này cũng tăng dần trong suốt quá trình lên men. Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích trọng lƣợng khô tế bào trong Hình 3.11.
Để đánh giá chính xác sự biểu hiện FGF-2 dạng tan trong chủng, chúng tôi tiến hành định lƣợng bằng phần mềm Quantity One của Biorad (Phụ lục 3). Kết quả ở
Bảng 3.3 cho thấy tỉ lệ protein FGF-2 trong pha tan (%) tăng dần trong suốt quá trình lên men. Tuy nhiên, ở cuối quá trình lên men, tỉ lệ này gần nhƣ không tăng (từ giờ lên men thứ 22 đến giờ thứ 24 tăng 0,1%). Kết quả này có thể do chủng đã bƣớc vào pha suy vong, năng lực sản xuất protein mục tiêu của chủng giảm. Do đó, cần phải có những khảo sát mở rộng nhằm đánh giá thời điểm dừng lên men để mang lại sản lƣợng
Bảng 3.3. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 trong pha tan (%) sau mỗi 2 giờ lên men
Thời gian lên men (giờ) Thời gian sau cảm ứng (giờ) Tỉ lệ FGF-2 trong pha tan
(%) 8 2 6,0 10 4 6,7 12 6 7,7 14 8 8,3 16 10 9,5 18 12 9,8 20 14 9,7 22 16 10,5 24 18 10,6
Sau 24 giờ lên men, toàn bộ sinh khối E. coli đƣợc thu nhận và đƣợc phá tế bào bằng phƣơng pháp đồng hóa dựa vào áp suất cao. Nhằm tối đa hóa lƣợng FGF-2 dạng tan có thể thu nhận đƣợc sau quá trình phá tế bào, chúng tôi tiến hành khảo sát số chu kỳ phá mẫu. Mẫu protein thể vùi và thể tan sau mỗi chu kì phá mẫu đƣợc tiến hành điện di SDS-PAGE nhằm xác định lƣợng FGF-2 thu đƣợc sau mỗi chu kỳ. Kết quả điện di này đƣợc trình bày trong Hình 3.13.
Hình 3.13. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein sau các chu kì phá tế bào bằng phương pháp đồng nhất hóa dựa vào áp suất cao
1, Thang protein phân tử lượng thấp; 2, Dịch thu nhận sau lên men sau 1 chu kì phá tế bào (thể vùi); 3, Dịch thu nhận sau lên men sau 1 chu kì phá tế bào (thể tan); 4, Dịch thu nhận sau lên men sau 2 chu kì phá tế bào (thể vùi); 5, Dịch thu nhận sau lên men sau 2 chu kì phá tế bào (thể tan); 6, Dịch thu nhận sau lên men sau 3 chu kì phá tế bào (thể vùi); 7, Dịch thu nhận sau lên men sau 3 chu kì phá tế bào (thể tan).
Dịch nổi thu nhận sau khi ly tâm đƣợc định lƣợng Bradford nhằm đánh giá hiệu quả của quá trình lên men. Hiệu quả thu nhận FGF-2 dạng tan ở chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FGF sau lên men đƣợc tính theo các công thức sau:
100 YxZ T X Tx E% 100
Kết quả sau xử lý đƣợc trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hiệu quả thu nhận FGF-2 ở chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF sau quá trình lên men
Sinh khối khô (g/L) (X) 5,70
Lƣợng protein tổng thu đƣợc trong 1L dịch lên men (g) (Y) 2,75
% FGF-2 trong pha tan (Z) 10,6
Lƣợng FGF-2 (g/L) (T) 0,29
Hiệu quả thu nhận FGF-2 (E%) 5,11
Kết quả ghi nhận đƣợc ở bảng 3.4 cho thấy quá trình lên men chủng BL21(DE3)/pET-FGF thu đƣợc 0,29g protein FGF-2 dạng tan trong một lít dịch lên men với tỉ lệ FGF-2 trong pha tan là 10,6%, đạt hiệu quả thu nhận FGF-2 là 5,11%.