a) Phương pháp điện di SDS-PAGE
Gel polyacrylamide là sản phẩm trùng ngƣng của các phân tử acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình trùng ngƣng đƣợc xúc tác bởi hệ thống amonium persulfate (APS) - N,N,N’,N’-tetramethylenediamine (TEMED). Sau khi trùng ngƣng sẽ tạo thành một hệ thống lƣới cho phép các protein có kích thƣớc khác nhau đi qua các lỗ với vận tốc khác nhau.
SDS là tác nhân biến tính mạnh. Phân tử này bám lên các phần kị nƣớc của protein, làm âm tính hóa protein và ngăn cản các liên kết hydro. Thêm vào đó, để loại bỏ các cầu nối disulfide trong phân tử protein, ngƣời ta có thể sử dụng thêm 2- mercaptoethanol hay dithiothreitol (DTT). Khi đó, protein đƣợc đƣa về cấu trúc bậc I và đƣợc phân biệt qua gel dựa trên chiều dài của chúng [24].
* Chuẩn bị mẫu điện di SDS-PAGE
- Bổ sung dung dịch nạp mẫu 5X vào mẫu cần phân tích với tỷ lệ 4:1, votex nhẹ.
- Đun ở 100oC trong 20 phút, sau đó ủ ngay vào đá 5 phút để biến tính protein.
* Chuẩn bị gel điện di
Gel điện di polyacrylamide 15% gồm gel gom và gel phân tách, có thành phần nhƣ sau:
Bảng 2.1. Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS - PAGE
Gel phân tách Gel gom
Thành phần Thể tích (l) Thành phần Thể tích (l) dH2O 1260 dH2O 630 Tris-HCl 1,5M pH 8,8 875 Tris-HCl 1,5M pH 6,8 256 40% Acrylamide 2,5% bisacrylamide 1320 40% Acrylamide 2,5% bisacrylamide 100 SDS 10% 35 SDS 10% 10 APS 10% 35 APS 10% 10 TEMED 2,8 TEMED 2,0
* Tiến hành điện di SDS – PAGE
Nạp 10µl và 5µl thang protein vào các giếng. Tiến hành điện di trong điều kiện 2mA/giếng, 220V trong khoảng 1 giờ. Khi hoàn tất điện di, lấy gel ra khỏi kính, cắt bỏ phần gel gom, nhuộm phần gel phân tích.
* Nhuộm gel
- Nhuộm gel với dung dịch nhuộm comassive trong 1 giờ.
- Giải nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm, thay dung dịch giải nhuộm sau mỗi giờ cho đến khi nền gel trở nên trong suốt và vạch protein hiện rõ.
e) Kiểm tra bằng phương pháp lai Western Blot
Để phát hiện protein FGF-2, thực hiện lai Western Blot với kháng thể đặc hiệu kháng FGF-2. Sau đó, sử dụng kháng thể thứ cấp anti-Ig chuột-HRP để phát hiện phản ứng chuyên biệt giữa kháng thể kháng FGF-2 với FGF-2. Khi HRP gặp cơ chất H2O2 và luminol, HRP sẽ thủy phân H2O2 và đồng thời oxi hóa luminol. Luminol bị oxy hóa ở trạng thái không bền sẽ phát ra ánh sáng để trở về trạng thái bền hơn. Ánh sáng này có bƣớc sóng ngắn sẽ làm cháy phim hình thành vệt trên phim. Nhƣ vậy, chỉ có những vị trí mang protein mục tiêu (protein FGF-2) mới tạo vệt trên phim [16].
* Điện di SDS-PAGE
Tiến hành điện di SDS-PAGE với các mẫu nhƣ trên cùng với thang prestained (2,5l). Điện di với điện thế 220V, 2mA/giếng trong khoảng 1 giờ.
* Chuyển màng lai
- Ngâm giấy thấm, màng lai nitrocellulose và gel trong dung dịch Towbin trong 10 phút, lắc nhẹ.
- Đặt tất cả vào bộ chuyển màng theo thứ tự: cực dƣơng-xốp đệm-giấy thấm- màng nitrocellulose-gel-giấy thấm-xốp đệm-cực âm (Hình 2.7) với hiệu điện thế 10V, cƣờng độ 100mA trong 30 phút.
Hình 2.7. Sơ đồ minh họa thứ tự các thành phần trong bước chuyển màng * Khóa màng
- Màng đƣợc đặt trong sữa gầy, lắc nhẹ trong 1giờ ở nhiệt độ phòng hay ủ qua đêm ở 4o
C.
- Lắc và rửa màng lai 5 lần với 15-20 ml PBST/lần, mỗi lần 5 phút.
* Ủ với kháng thể đặc hiệu
- Bổ sung 1l kháng thể kháng FGF-2 đặc hiệu đƣợc pha loãng trong 10ml PBST, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
- Lắc và rửa màng lai 5 lần với 15-20 ml PBST/lần, mỗi lần 5 phút.
* Ủ với kháng thể thứ cấp
- Bổ sung 1l kháng thể thứ cấp anti-Ig chuột-HRP đƣợc pha loãng trong PBST, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 1giờ.
- Lắc và rửa màng lai 5 lần với 15-20ml PBST/lần, mỗi lần 5 phút.
* Hiện phim
- Dung dịch phát hiện: detection 1 và dectection 2 với tỷ lệ 1:1
- Dung dịch hiện phim: developer 1X, fixer 1X, nƣớc, mỗi loại 200ml
Đặt màng lai vào một bao nylon sạch. Nhỏ đều dung dịch phát hiện lên màng, đặt bao nylon có chứa màng lai vào hộp ép phim, mang vào phòng tối, ép phim lên màng lai, để yên trong tối khoảng 30 phút. Sau khi ép xong nhúng phim vào dung dịch developer đến khi thấy vạch đen xuất hiện. Sau đó, nhúng vào dung dịch Fixer cho đến khi miếng phim trở nên trong hơn. Rửa phim lại bằng nƣớc máy, phơi khô.
f) Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bƣớc sóng hấp thu cực đại 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 595nm [25].
* Dựng đường chuẩn
- Chuẩn bị dung dịch albumin ở những nồng độ khác nhau: 0, 20, 40, 60, 80, 100g/ml.
- Cho 1,8ml dung dịch thuốc thử Bradford vào 200l dịch albumin ở những nồng độ khác nhau, để yên 10 phút.
- Đo mật độ quang ở bƣớc sóng 595nm.
- Dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ albumin và OD595 đo đƣợc.
* Định lượng protein tổng trong dịch tinh chế
- Pha loãng dịch protein cần đo bằng nƣớc cất với những độ pha loãng khác nhau.
- Cho 1,8ml dung dịch thuốc thử Bradford vào 200l dịch protein ở những nồng độ khác nhau, để yên 10 phút.
- Sau 10 phút, đo mật độ quang ở bƣớc sóng 595nm.
- Dựa trên đƣờng chuẩn và giá trị OD595 đo đƣợc, xác định đƣợc lƣợng protein tổng có trong mẫu.
Kết quả đƣợc chấp nhận khi giá trị OD595 đo đƣợc không vƣợt quá giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn.
g) Định lượng FGF-2 bằng phần mềm xác định đậm độ Quantity One
Phần mềm Quantity One có thể định lƣợng và phân tích nhiều dữ liệu sinh học khác nhau, bao gồm các mẫu phóng xạ, nhuộm huỳnh quang và gel điện di. Phần mềm này có thể định lƣợng tƣơng đối protein thực sự có trong tế bào thông qua tƣơng quan độ đậm của các vạch protein hiện diện trên bản điện di từ mẫu dung dịch tế bào bị phá
màng. Công cụ này cũng có thể tính cả các giếng và vạch có hình dạng không rõ ràng bằng cách điều chỉnh dọc theo chiều dài của chúng thông qua công cụ Volume.
Phần mềm Quantity One sẽ biến các tín hiệu từ các mẫu sinh học thành các dữ liệu số nhờ các công cụ hỗ trợ là ánh sáng hay các chất phóng xạ, các dữ liệu số này đƣợc hiển thị thành các thang màu xám trên máy tính. Một dữ liệu số khi đƣợc trình bày trên màn hình sẽ là một tổng thể của nhiều pixel nhỏ riêng lẻ. Mỗi pixel đƣợc cộng gộp từ 3 giá trị X,Y,Z, trong đó X,Y ứng với chiều ngang và chiều dọc mẫu ảnh, còn giá trị Z là cƣờng độ tín hiệu của pixel. Để có thể thấy và xác định đƣợc một dữ liệu, thì cƣờng độ các cụm pixel của nó phải cao hơn cƣờng độ pixel hình thành nên background của ảnh. Cƣờng độ tổng của một dữ liệu là cộng gộp của tất cả các cƣờng độ của pixel hình thành nên vật thể. Nghĩa là nếu cƣờng độ tổng càng cao thì nồng độ protein càng cao [14].
- Mẫu điện di SDS-PAGE đƣợc scan để lƣu giữ dƣới dạng file ảnh. Sau đó file ảnh này đƣợc sử dụng để phân tích bằng phần mềm Quantity One, tiện ích Band Analysis. Các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
- Mở giao diện Quantity One, tiện ích Band Analysis. - Mở file mục tiêu.
- Chọn chức năng Transform, Auto-scale để tối ƣu hóa hình ảnh. - Xác định vùng gel cần phân tích bằng chức năng Frame-lane.
- Trong vùng phân tích, chọn một giếng và chọn chức năng Lane-Background để xác định background của hình ảnh.
- Phát hiện các vạch protein trong các giếng bằng chức năng Detect Band. - Cuối cùng sử dụng chức năng Band Attribute/Relative Quantity để xác định tỉ lệ từng vạch protein so với tổng protein trong mỗi giếng.
CHƢƠNG III.