a) Sàng lọc sơ bộ bằng phương pháp PCR khuẩn lạc
Để sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5α có mang plasmid tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành PCR khuẩn lạc các thể biến nạp với cặp mồi bắt cặp chuyên biệt với T7
promoter và T7 terminator trên plasmid. Đồng thời, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR với plasmid pET-19b làm mẫu đối chứng âm. Kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc trình bày trên Hình 3.4.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc
1, Thang chuẩn 100 bps Plus; 2, Sản phẩm PCR plasmid pET-19b; 3, Sản phẩm PCR khuẩn lạc dự tuyển E. coli DH5α/pET-FGF.
Plasmid pET-19b không mang gen fgf nên phản ứng PCR chỉ khuếch đại đoạn DNA giữa T7 promoter và T7 terminator có kích thƣớc 275bp. Kết quả điện di cho
thấy có một vạch DNA có kích thƣớc trên 200bp phù hợp với kích thƣớc sản phẩm PCR plasmid pET-19b (Hình 3.4, giếng 2).
Vector pET-FGF đƣợc xây dựng bằng cách chèn gen fgf vào giữa T7 promoter và T7 terminator. Do đó, phản ứng PCR các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pET- FGF tạo ra sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc 681bp. Trên bản gel điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc cho thấy một vạch DNA nằm giữa vạch 600bp và 700bp của thang (Hình 3.4, giếng 3) phù hợp với kích thƣớc dự đoán.
Nhƣ vậy, chúng tôi bƣớc đầu xác định đƣợc các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp. Plasmid sẽ đƣợc tiếp tục tách chiết từ các khuẩn lạc trên để kiểm tra trong bƣớc tiếp theo.
b) Kiểm tra bằng phương pháp cắt hạn chế
Plasmid tách chiết từ các dòng cho kết quả PCR khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc cắt bởi enzyme EcoRI để kiểm tra kích thƣớc. Kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.5.
Hình 3.5. Kết quả cắt kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc dương tính E. coli DH5α/pET- FGF trong phản ứng PCR khuẩn lạc.
1, Thang DNA 1kb; 2, Plasmid pET-FGF; 3, Plasmid pET-FGF cắt bằng EcoRI; 4, plasmid pET-FGF cắt bằng BamHI và XbaI
Ở giếng 3, plasmid từ khuẩn lạc dƣơng tính E. coli DH5α/pET-FGF trong phản ứng PCR khuẩn lạc đƣợc cắt mở vòng bằng EcoRI. Kết quả điện di sản phẩm cắt cho một vạch có kích thƣớc khoảng 6000bp. Kết quả này tƣơng ứng với kích thƣớc của plasmid tái tổ hợp pET-FGF (6123bp).
Ở giếng 4, gen fgf đƣợc chèn vào vector bằng chiến lƣợc nối đầu dính. Khi cắt pET-FGF bằng BamHI và XbaI thì gen fgf sẽ bị cắt rời ra khỏi vector tái tổ hợp. Kết quả điện di sản phẩm cắt cho hai vạch. Một vạch có kích thƣớc khoảng 500bp tƣơng ứng với kích thƣớc của đoạn gen fgf (524bp). Vạch còn lại có kích thƣớc trên 5000bp tƣơng ứng với kích thƣớc của phần plasmid pET-19b còn lại (5599bp).
c) Kiểm tra bằng phương pháp PCR plasmid
Plasmid tách chiết từ các dòng cho kết quả PCR khuẩn lạc dƣơng tính cũng đƣợc dùng làm khuôn để kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi T7 promoter và T7
terminator. Mẫu đối chứng âm là plasmid pET-19b. Kết quả kiểm tra đƣợc trình bày trong Hình3.6.
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra dòng E. coli DH5α/pET-FGF bằng PCR plasmid. 1, Thang chuẩn 100bp; 2, Sản phẩm PCR pET-19b; 3, Sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR plasmid pET-19b cho ra đoạn DNA có kích thƣớc gần 200bp, tƣơng đƣơng với kích thƣớc đoạn trình tự không mang gen fgf giữa hai mồi (275bp) (Hình 3.6, giếng 2).
Phản ứng PCR plasmid từ các khuẩn lạc có kết quả sàng lọc dƣơng tính cho sản phẩm có kích thƣớc trên 600bp (giữa vạch 600bp và 700bp của thang). Kích thƣớc này tƣơng đƣơng với kích thƣớc của đoạn trình tự có gen fgf giữa hai mồi (681bp). Nhƣ vậy, plasmid tách từ các dòng có kết quả PCR khuẩn lạc dƣơng tính là vector tái tổ hợp pET-FGF (Hình 3.6, giếng 3).
d) Giải trình tự
Plasmid tái tổ hợp pET-FGF thu nhận đƣợc sau quá trình kiểm tra sẽ đƣợc tiến hành giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger cải tiến trên máy Big DyeTM terminator của công ty Macrogen, Hàn Quốc. Kết quả giải trình tự đƣợc so sánh độ tƣơng đồng với trình tự lý thuyết bằng phần mềm Jellyfish. Kết quả đƣợc trình bày trong Hình 3.7.
Kết quả giải trình tự cho thấy gen fgf tƣơng đồng 100% khi so sánh với trình tự lý thuyết bằng phần mềm Jellyfish. Nhƣ vậy, chúng tôi đã cấu trúc thành công plasmid tái tổ hợp pET-FGF chứa gen fgf mã hóa cho protein FGF-2.