protein FGF-2 tái tổ hợp ở dạng tan
a) Các bước chuẩn bị
* Chuẩn bị và hoạt hóa giống:
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF đƣợc cấy chuyền hoạt hóa lên đĩa petri chứa môi trƣờng thạch LB có bổ sung ampicillin để sàng lọc chủng. Đĩa petri này đƣợc ủ ở 37o
C trong 10 - 14 giờ, sau đó giữ ở tủ mát 4oC.
Cấy một khuẩn lạc đơn của chủng từ đĩa petri vào ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng LB-Amp100. Lắc 250 vòng/phút, 37o
C trong 12-14 giờ.
Sử dụng 5ml giống trên cho vào erlen 250ml có chứa 100ml môi trƣờng lên men đƣợc bổ sung kháng sinh ampicillin ở nồng độ 100μg/ml. Lắc 250 vòng/phút ở 37o
C trong 12 - 14 giờ. Erlen chứa dịch nuôi cấy này đƣợc dùng để nạp giống vào bình lên men theo tỷ lệ 1/10 (v/v).
* Lắp ráp hệ thống lên men, nạp môi trường và giống:
Các sensor pH, sensor DO đƣợc lắp vào các vị trí trên bình lên men theo Hình 2.5.
Tiến hành nạp giống vào bình lên men và tiếp tục bổ sung Ampiciline đạt nồng độ cuối 100µg/ml, các thao tác trên đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng.
Sau đó, bình lên men đƣợc lấy ra khỏi tủ cấy vô trùng và lắp ráp vào hệ thống, lắp ráp hệ thống đƣờng ống nƣớc giải nhiệt, động cơ khuấy, đƣờng khí vào (air inlet), hệ thống đƣờng ống nối với các bình đựng dung dịch acid, base, antifoam. Hệ thống lên men sau khi đã đƣợc lắp ráp hoàn chỉnh nhƣ Hình 2.6.
Hình 2.6. Hệ thống thiết bị lên men
b) Lên men cảm ứng biểu hiện FGF-2
Các thông số cài đặt cho quá trình lên men chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF nhƣ sau: pH=7,00, DO>20%, khuấy ở tốc độ 250 vòng/phút, sục khí ở 1vvm. Trong sáu giờ đầu, cài đặt nhiệt độ ở 37oC. Sau 6 giờ lên men, bổ sung IPTG đạt nồng độ cuối là 0,3mM và chỉnh nhiệt độ về 30oC, tốc độ khuấy về 150 vòng/phút. Sau 8 giờ lên men, chỉnh nhiệt độ về 25oC.
Tiến hành thu dịch nuôi cấy và phân tích trọng lƣợng khô tế bào (DCW) sau mỗi hai giờ kể từ thời điểm bắt đầu lên men nhằm khảo sát động học tăng trƣởng của chủng. Kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp bằng phƣơng pháp SDS-PAGE và định lƣợng bằng phần mềm Quantitive One. Sau 24 giờ lên men, tiến hành ly tâm 1ml dich lên men để thu sinh khối và hòa lại trong 300ml nƣớc cất. Dịch tế bào đƣợc phá bằng máy phá tế bào M-110EH-30 Microfluidizer Processor để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp trong pha tan. Dịch nổi sau khi thu nhận sẽ đƣợc định
lƣợng bằng phƣơng pháp đo Bradford nhƣ đã trình bày ở Mục 2.2.7f để đánh giá hiệu quả của quá trình lên men.
c) Đánh giá hiệu quả lên men
* Phân tích trọng lượng khô tế bào (DCW):
Tại mỗi thời điểm thu mẫu, hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf đã đƣợc sấy đến khối lƣợng không đổi và khối lƣợng của eppendorf đã đƣợc xác định bằng cân. Tiến hành ly tâm bỏ dịch nổi và sấy ở 80oC trong 4 giờ đến khi khối lƣợng khô tế bào không đổi. Mẫu sau khi sấy đƣợc đem đi cân để xác định giá trị DCW.
* Chuẩn bị mẫu cho điện di SDS-PAGE:
- Tại mỗi thời điểm thu mẫu, hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf. - Ly tâm thu sinh khối ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Rửa tủa bằng nƣớc cất: Hòa tủa thu đƣợc trong 1ml nƣớc cất, vortex cho tủa hòa đều trong nƣớc cất, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi và thu tủa.
- Hòa tủa trong 600μl nƣớc cất.
- Tiến hành sonicate dịch vừa thu nhận ở 4oC cho đến khi dịch trong. Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút, thu tủa và nổi riêng.
- Tiến hành điện di SDS-PAGE các mẫu thể tan để đánh giá sự biểu hiện của protein FGF-2 tái tổ hợp trong tế bào chất E. coli trong suốt quá trình lên men.
* Cách tính hiệu quả thu nhận FGF-2 [1]:
Hiệu quả thu nhận FGF-2 tối đa (E) đƣợc tính dựa trên lƣợng FGF-2 (T) thu đƣợc từ sinh khối khô tế bào (X) trong 1L (V) dung dịch sau 24 giờ lên men.
X Tx
E% 100
T đƣợc tính dựa vào lƣợng protein tổng (Y) tính đƣợc thông qua nồng độ đƣợc đo bằng phƣơng pháp Bradford ([Protein tổng]) và % FGF-2 trên protein tổng (Z) của dịch nổi bằng phần mềm Quantity One do công ty Biorad cung cấp.