hợp [23]
Hoạt tính sinh học của FGF-2 thu nhận sau quá trình tinh chế có thể đƣợc đánh giá thông qua thử nghiệm in vitro sử dụng dòng tế bào 3T3. Dòng tế bào này có nhiều thụ thể FGF-2 trên bề mặt, khi có sự hiện diện của FGF-2 có hoạt tính trong môi trƣờng nuôi cấy, FGF-2 sẽ gắn lên các thụ thể và kích thích sự tăng sinh của các tế bào này. Do đó, dựa vào số lƣợng tế bào 3T3 tăng sinh trong môi trƣờng nuôi cấy, có thể đánh giá hoạt tính của FGF-2 trong mẫu bằng cách so sánh với FGF-2 chuẩn (Sigma).
- Dịch nuôi cấy tế bào 3T3 đƣợc kiểm tra dƣới kính hiển vi soi ngƣợc. Chọn tế bào thử nghiệm ở trạng thái đang tăng sinh có hình thái đều, trong môi trƣờng nuôi cấy có ít hoặc không có tế bào chết, tế bào bám đạt 80-100% bề mặt đĩa.
- Bổ sung 0,5ml dung dịch 0,25% Trypsin-0,53mM EDTA vào đĩa để rửa tế bào. Đổ bỏ dung dịch.
- Bổ sung 1ml dung dịch 0,25% Trypsin-0,53mM EDTA, ủ tế bào ở 37oC, CO2 5%, 5 phút.
- Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu sau khi nhuộm Trypan Blue. - Rửa tế bào bằng môi trƣờng DMEM.
- Bổ sung môi trƣờng DMEM+10% FBS để mật độ tế bào đạt 0,5x105 tế bào/ml.
- Bổ sung dịch tế bào vào đĩa 96 giếng (mỗi giếng 100µl).
- Nuôi tế bào ở 37oC, CO2 5%, 48 giờ (tế bào bám 80% bề mặt đĩa). - Hút bỏ dịch nuôi cấy tế bào (tránh chạm vào đáy đĩa).
- Bổ sung 100µl DMEM+0,5% FBS vào mỗi giếng, ủ ở 37oC, CO2 5%, 24 giờ. - Bổ sung 50µl mẫu FGF-2 chuẩn và dịch đồng nhất tế bào BL21(DE3)/pET- FGF đƣợc pha loãng để FGF-2 đạt nồng độ 120ng/ml lần lƣợt vào mỗi giếng. Một giếng không đƣợc bổ sung FGF-2 để dùng làm chứng âm. Ủ ở 37oC, CO2 5%, 48 giờ.
- Bổ sung cell counting kit tỉ lệ 1/10 (v/v), ủ trong 1 h. - Đo OD bƣớc sóng 450nm bằng máy Multiskan Ascent.