Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá tra (pangasianodon hypophthalmus) đối với protein màng ompn tái tổ hợp của vi khuẩn edwardsiella ictaluri

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ LƯU PHƯƠNG HẠNH KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) ĐỐI VỚI PROTEIN MÀNG OmpN TÁI TỔ HỢP CỦA VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số chuyên ngành: 60 42 30 1 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN QUỐC BÌNH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012 LỜI CÁM ƠN Hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của rất nhiều người. Trước hết, con xin cảm ơn Ba Mẹ, O Chú, anh chị em trong gia đình và người thân đã luôn bên cạnh ủng hộ, lo lắng và động viên con trong suốt quá trình học tập. Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy giáo - TS. Nguyễn Quốc Bình đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện. Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM đã cung cấp toàn bộ kinh phí và hỗ trợ máy móc, trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Ngô Huỳnh Phương Thảo, ThS. Lâm Vỹ Nguyên, ThS. Vũ Thị Thanh Hương, ThS. Dương Vân Anh cùng các anh chị em bạn bè trong phòng CNSH Thủy Sản, CNSH Y Dược, CNSH Vi Sinh, CNSH Thực Vật … đã có những giúp đỡ quý báu, tạo điều kiện thuận lợi cũng như chia sẻ với tôi những khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn đến bạn bè của tôi, những người đã luôn bên cạnh, quan tâm, cổ vũ, và giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian thực hiện. Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học i MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC SƠ ĐỒ viii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình nuôi cá tra và bệnh gan thận mủ 3 1.2. Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mũ trên cá Tra. 5  1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 5 1.2.2. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 6 1.3. Sơ lược về protein màng và vai trò của protein màng OmpN (outer membrane protein N) trong vi khuẩn Edwarsiella ictaluri 8 1.3.1. Sơ lược về protein màng 8 1.3.2. Protein màng OmpN của vi khuẩn E. ictaluri 9 1.4. Tình hình nghiên cứu vaccine kháng khuẩn Edwardsiella ictaluri cho cá Tra 13 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 14 1.5. Sơ l ược về các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp 16 1.5.1. Hệ thống vi khuẩn E. coli 16 1.5.2. Hệ thống nấm men Pichia pastoris 17 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Thiết bị, hóa chất và dụng cụ 20 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ 20 2.1.2 Hóa chất và môi trường 21 Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học ii 2.1.2.1. Hóa chất và môi trường dùng để biểu hiện OmpN trong hệ thống E. coli 21 2.1.2.2. Hóa chất dùng trong tinh sạch OmpN tái tổ hợp từ E. coli 21 2.1.3. Chủng vi sinh vật 26 2.1.3.1. Chủng vi khuẩn Escherichia coli: 26 2.1.3.2. Chủng nấm men Pichia pastoris 26 2.1.4. Các plasmid 26 2.1.5.1. Plasmid pET 28 26 2.1.5.2. Plasmid pPIC9K 28 2.2. Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1. Thu nhận và khảo sát gây đáp ứng miễn dịch ở cá tra của OmpN tái tổ hợ p trên hệ thống E.coli 30 2.2.1.1. Biểu hiện protein OmpN trong E. coli 30 2.2.1.2. Thu nhận protein OmpN từ hệ thống biểu hiện E. coli 31 2.2.1.3. Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN 32 2.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 35 2.2.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen OmpN 36 2.2.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40 3.1. Kết quả thu nhận OmpN tái tổ hợp trên h ệ thống E. coli 40 3.1.1. Biểu hiện protein OmpN trong E. coli 40 3.1.2. Tinh sạch protein OmpN từ hệ thống biểu hiện E. coli 42 3.1.2.1. Mức độ hòa tan của protein OmpN ở dạng thể vùi với urea 42 3.1.2.2. Tinh sạch protein OmpN bằng sắc ký ái lực 43 3.1.2.3. Loại muối dung dịch protein OmpN tinh sạch bằng sắc lý lọc gel Superfine Sephadex G-25 50 3.1.3. Khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN 51 3.1.3.1. Kiểm tra kháng thể kháng OmpN từ thỏ bằng phương pháp Western blot 51 Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học iii 3.1.3.2. Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN 52 3.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 55 3.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang plasmid PIC9K nối với đoạn gen OmpN. 55 3.2.1.1. Thu nhận đoạn gen OmpN và pPIC9K từ chủng E. coli DH5α 55 3.2.1.2. Tạo dòng chủng E. coli DH5α mang đoạn gen OmpN nối với pPIC9K 57 3.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 59 3.2.3. Kết quả sàn lọc dòng tế bào nấm men P. pastoris có khả năng biểu hiện ompN cao 63 CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 4.1. Kết luận 65 4.2. Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampiciline ELISA Enzymee-Linked Immunosorbent Assay IPTG Isopropyl-β-D-thiogalacyopyranoside Kana Kanamycine LB Luria bertani MCS Multi cloning site MD Minimal dextrose medium OD Optical density PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction TBS Tris-Buffered Saline TBS/T Tris-Buffered Saline/Tween 20 SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis YNB Yeast nitrogen base YPD Yeast extract peptone medium Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học v DANH MỤC CÁC BẢNG  Trang Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR. 24  Bảng 2.2. Thành phần gel SDS-PAGE 25 Bảng 2.3. Thành phần các dung dịch dùng trong điện di SDS-PAGE 25 Bảng 2.4. Đặc điểm của plasmid pET28 a+ 28 Bảng 2.5. Đặc điểm của pPIC9K 29 Bảng 2.6. Thí nghiệm khảo sát độc tính của protein OmpN tinh sạch đối với cá Tra 34  Bảng 2.7. Thành phẩn phản ứng cắt plasmid 37 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng nối pPIC9K và OmpN 38 Bảng 3.2. Các chất hỗ trợ cho quá trình tái gấp cuộn [28] 46 Bảng 3.3 Tóm tắt kết quả quá trình loại muối từ 6M đến 0M bằng sắc ký lọc gel trên cột gel sephadex G25 51  Bảng 3.4. Kết quả đo OD của phản ứng tạo màu trong ELISA 54  Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 5  Hình 1.2. Cá Tra khỏe mạnh và cá Tra bị bệnh gan thận mủ 7 Hình 1.3 Màng ngoài của vi khuẩn Gram âm 8 Hình 1.4. So sánh amino acid của OmpN1, OmpN2 và ompN3 12 Hình 1.5. Cấu trúc mẫu tương đồng của OmpN1, OmpN2, OmpN3 13 Hình 1.6. Hình ảnh của cấu trúc OmpN1, OmpN2 và OmpN3 xếp chồng lên nhau13  Hình 1.7. Hình thái vi khuẩn Escherichia coli 16 Hình 1.8. Hình thái nấm men Pichia pastoris 17 Hình 2.1. Vector pET28 a+ 26 Hình 2.2. Vùng MCS của vector pET28 a+ 27 Hình 2.3. Vector pPIC9K 28 Hình 2.4. Vùng MSC của vector pPIC9K 29 Hình 3.1. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% protein OmpN được biểu hiện trong E. coli 40  Hình 3.2. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% protein OmpN sau khi phá vỡ tế bào E. coli bằng sonicator 41  Hình 3.3. Kết quả hòa tan OmpN với Urea ở các nồng độ khác nhau 42 Hình 3.4. Kết quả lượng protein không bám trong cột sắc ký ở các điều kiện khác nhau 43  Hình 3.5. Kết quả tinh sạch OmpN tái tổ hợp trong điều kiện tái gấp cuộn 45 Hình 3.6. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% quá trình tinh sạch protein His tag-OmpN trong điều kiện tái gấp cuộn 47  Hình 3.7. Kết quả tinh sạch OmpN-His tag trong điều kiện biến tính 48 Hình 3.8. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% quá trình tinh sạch OmpN-His tag trong điều kiện biến tính 49  Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học vii Hình 3.9. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE qua trình loại muối protein sau tinh sạch 50  Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của protein OmpN-His tag trong huyết thanh của cá Tra bằng SDS-PAGE12.5% (A) và Western Blot(B) 52  Hình 3.11. Kết quả điện di trên gel agarose1% plasmid pGEX4T1::OmpN 56 Hình 3.12. Kết quả điện di trên gel agarose 1% đoạn gen OmpN đã được tinh sạch 57  Hình 3.13. Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi 3’AOX1 và 5’AOX1 58  Hình 3.14. pPIC9k được tách từ các chủng E. coli DH5α đã kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc 59  Hình 3.15. Kết quả cắt pPIC9K::OmpN bằng SalI và BglII được điện di trên gel agarose 1% 60  Hình 3.16. Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt pPIC9k:: OmpN được điện di trên gel agarose 1% 61  Hình 3.17. Các khuẩn lạc Pichia pastoris mọc trên đĩa môi trường MD sau khi biến nạp pPIC9K::OmpN 61  Hình 3. 18. Kết quả PCR kiểm tra kết quả tạo dòng P. pastoris mang đoạn gen OmpN 62  Hình 3.19. Kết quả chọn các chủng P. pastoris có số copy cao nhât. 63 Hình 3.20. Các dòng P. pastoris đã tạo dòng thành công 64  Đồ thị 3.1 Số lượng trung bình cá chết ở mỗi nghiệm thức đánh giá độc lực của OmpN trên cá tra …………………………………………………………………. 53 Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học viii DANH MỤC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1. Tổng quát quá trình thu nhận protein OmpN tái tổ hợp trên hệ thống E. coli và khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá Tra đối với protein OmpN tái tổ hợp 30  Sơ đồ 2.2. Tổng quát quá trình tạo dòng P. pastoris mang đoạn gen OmpN 35 [...]... tài Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đối với protein màng OmpN tái tổ hợp của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Mục tiêu của đề tài Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá Tra đối với protein màng OmpN tái tổ hợp của vi khuẩn E ictaluri Nội dung đề tài bao gồm - Tinh sạch protein OmpN tái tổ hợp từ hệ thống biểu hiện E coli - Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN. .. phát sinh bệnh từ E .ictaluri dựa vào khả năng kiểm soát hệ protein của nó để tránh sự phòng ngừa của vật chủ, và như vậy, sự nghiên cứu hệ protein là quan trọng đối với vi c hiểu được cơ chế gây bệnh của vi khuẩn [12] 1.3 Sơ lược về protein màng và vai trò của protein màng OmpN (outer membrane protein N) trong vi khuẩn Edwarsiella ictaluri 1.3.1 Sơ lược về protein màng Thành của vi khuẩn Gram âm gồm... thấm của màng vi khuẩn [7],[34] Có hai loại protein chính trên màng tế bào là protein xuyên màng và protein ngoại biên không xuyên màng Protein ngoại biên không xuyên màng còn được gọi là protein bề mặt màng Các protein này thường liên kết với lớp đôi lipid và nằm ở bề mặt ngoài màng Protein xuyên màng đã được nghiên cứu là không tan trong nước, có bề mặt ngoài của protein là phần kị nước Màng ngoài của. .. và lớp màng ngoài Cấu trúc của lớp màng ngoài là protein, phospholipids và lipopolisaccharide (LPS) Màng ngoài giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại các tác động bất lợi của môi trường như: sự tấn công của các vi khuẩn khác, sự xâm nhập của các chất có hại cho tế bào [31] Protein chiếm khoảng 50% khối lượng lớp màng ngoài của vi khuẩn gram âm Protein màng ngoài (OmpN) đóng vai trò quan trọng trong vi c duy... hướng phát triển có nhiều tiềm năng Protein OmpN là một tiểu phần của E ictaluri, trợ giúp cho quá trình bám dính, là một kháng nguyên quan trọng kích thích đáp ứng miễn dịch [5] Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ dừng ở bước đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với protein màng ompN nhằm tạo tiền đề cho vi c sản xuất vaccine tiểu phần ngừa bệnh gan thận mủ cho cá tra Từ những thực tế trên, chúng... dạng bền vững và ổn định Một số protein màng có khả năng gây độc Khả năng gây độc của protein được biểu hiện ở các vi khuẩn gram âm, và chúng cần thiết cho sự sinh tồn của vi khuẩn chống lại sự xâm nhập của các đại thực bào và các tế bào eukaryote [3] Protein màng ngoài của E ictaluri hay các vi khuẩn gram âm gây bệnh nói chung có vai trò quan trọng trong vi c tương tác với tế bào chủ trong quá trình... bảo vệ của tế bào chủ Nó cũng có tính kháng nguyên vì thành phần của màng ngoài được dễ dàng nhận ra như cơ chất lạ bởi hệ thống phòng thủ miễn dịch của tế bào chủ 1.3.2 Protein màng OmpN của vi khuẩn E ictaluri Cơ chế gây độc thật sự rõ ràng ở E ictaluri vẫn chưa được làm sáng tỏ Trong phạm vi họ Enterobacteriaceae, tác nhân giúp vi khuẩn bám dính và xâm nhập vào tế bào chủ là protein màng Các protein. .. thắt chặt các quy định về các mặt hàng thủy sản nhập khẩu 1.2 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra 1.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Edwardsiella ictaluri thuộc giống Edwardsiella, họ Enterobacteriaceae, bộ Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [43] E ictaluri là tác nhân gây... trợ của DNA E ictaluri và được chặn bởi một protein liên kết peniciline ở một đầu và một protein mang tính giả thuyết ở đầu kia Gen OmpN2 cũng được tìm thấy trên một sợi bổ trợ của E ictaluri và đã được chặn bởi β-ketoadipate enol-lactone hydrolase ở một đầu và phosphofructose kinase ở đầu còn lại Khác với gen OmpN1 và OmpN2 , gen OmpN3 đã được tìm thấy trên một sợi thực của DNA và bị chặn bởi một protein. .. môi trường bên trong và bên ngoài Protein vận chuyển là nhịp cầu của màng sinh học - Chức năng thu nhận và truyền tín hiệu giữa các tế bào và trong nội bộ tế bào - Chức năng miễn dịch: protein màng đóng vai trò là các kháng nguyên trên về mặt và là thụ quan của tế bào, tham gia vào quá trình miễn dịch - Đóng vai trò là các protein dung hợp màng - Liên kết với bộ khung của tế bào, giúp tế bào có được . Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đối với protein màng OmpN tái tổ hợp của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Mục tiêu của đề tài Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở. LÊ LƯU PHƯƠNG HẠNH KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) ĐỐI VỚI PROTEIN MÀNG OmpN TÁI TỔ HỢP CỦA VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI Chuyên ngành: Hóa. ở cá Tra đối với protein màng OmpN tái tổ hợp của vi khuẩn E. ictaluri Nội dung đề tài bao gồm - Tinh sạch protein OmpN tái tổ hợp từ hệ thống biể u hiện E. coli - Đánh giá đáp ứng miễn dịch