Hình 1.8. Hình thái nấm men Pichia pastoris [46]
Nấm men Pichia pastoris là một trong 4 chi thuộc nấm men methylotrophic (3 chi khác là Candida, Hansenula và Torulopsis), có khả năng chuyển hóa methanol như một nguồn cacbon duy nhất của chúng [17].
18
Đầu những năm 1970, Pichia pastorisđã được sử dụng như một công cụ sinh học chuyển hóa methanol thành những protein có chất lượng cao hơn, trộn chung vào thức ăn để tăng lượng đạm có trong thức ăn dùng cho vật nuôi. Nhưng đến giữa những năm 1970, thì phương pháp này không thể cạnh tranh được về chi phí với đậu nành, và sự xuất hiện của ngành công nghệ sinh học lúc này đã thúc đẩy những nổ lực để tìm ra những protein có chất lượng cao hơn từ Pichia. Vào đầu những năm 1980, Pichia được giới khoa học sử dụng như một hệ thống vi sinh vật nhân thật điển hình để sản xuất ra các loại protein tái tổ hợp với số lượng lớn [17].
Pichia pastoris là vi sinh vật nhân thật, có thể thao tác dễ dàng nhưE. coli và mang nhiều lợi thế của hệ thống biểu hiện nhân thật như sản xuất protein, tái gấp cuộn, sửa sai sau quá trình dịch mã, ngoài ra nó nhanh hơn, đơn giản hơn vả rẻ hơn so với việc sử dụng các hệ thống khác như bacullovirus, mô của tế bào động vật. Và nó cũng đưa ra mức độ biểu hiện cao hơn. có thể sinh trưởng mạnh trong điều kiện đơn giản và rẻ tiền. Có thể phát triển tốt trong cả bình lắc và bình lên men, nên có thể sử dụng được ở cả quy mô nhỏ và quy mô công nghiệp.
Bước đầu tiên trong quá trình chuyển hóa methanol thành protein là oxy hóa methanol thành formaldehyde bằng enzyme alcohol oxidase và tạo ra hydro peroxide. Để tránh độc tính của hydrogen peroxide, quá trình chuyển hóa methanol diễn ra bên trong một tế bào chuyên biệt là peroxisome, cô lập hợp chất trung gian độc từ những phần còn lại của tế bào. Alcohol oxidase được cô lập trong peroxisome và có chức năng như một octomer-homo, với mỗi tiểu đơn vị liên kết cộng hóa trị với nhân tố flavin adenine dinucleotide (FAD). Alcohol oxidase có ái lực yếu với O2 và P. pastorisđền bù cho điều này bằng cách tạo ra một lượng lớn các enzyme [17].
Có 2 gen trong P. pastorsi mã hóa cho alcohol oxidase là AOX1 và AOX2, nhưng gen AOX1 chịu trách nhiệm đối với phần lớn các hoạt động của alcohol oxidase trong tế bào. Biểu hiện của gen AOX1 được cảm ứng và kiểm soát chặt chẽ bởi methanol đến mức cao, thường ≥ 30% tổng số protein hòa tan trong quá trình phát triển tế bào với methanol như là nguồn carbon. Biểu hiện của gen AOX1 được
19
kiểm soát ở mức độ phiên mã. Cơ chế kiểm soát AOX1 cũng tương tự như của gen GAL1 của S. cerevisiae, gồm 2 quá trình: ức chế/ giải phóng và cảm ứng. Quá trình ức chế của gen được gây ra bởi glucose [9][17].
Mất gen AOX1 sẽ làm giảm hoạt động của enzym alcohol oxidase của tế bào do đó dẫn đến quá trình sử dụng methanol chậm, ức chế quá trình sinh trưởng của tế bào nuôi trong môi trường có methanol, kết quả là sẽ tạo kiểu hình MutS (methanol utilization slow) [17].
Trên các vector biểu hiện phổ biến được sử dụng riêng cho chủng P. pastoris, protein mong muốn được sản xuất như một sản phẩm dung hợp với tín hiệu tiết α- mating factor (α-MF) từ Saccharomyces cerevisiae. Tín hiệu này được sử dụng thường xuyên và thành công trong quá trình tiết của tế bào. Điều này làm cho protein được tiết vào môi trường nuôi cấy, thuận lời cho việc tinh sạch protein sau này [9],[17].
P. pastoris còn có khả năng tạo các liên kết disulfide, gắn thêm các hydratcarbon vào protein – điều này là cần thiết đối với những protein có cấu trúc phức tạp. Trong khi đó, E. coli lại có thể tạo ra những protein tái gấp cuộn nhầm, và làm protein trở nên bất hoạt hay không hòa tan được [17].
Thêm vào đó, P. pastoris cũng được sử dụng như một mô hình để nghiên cứu những vấn đề khó xác định trong sinh học tế bào bao gồm cả sự phát sinh phi sinh học và lắp ráp thể peroxisome, tái chế protein và các bào quan một cách tựđộng, tổ chức thể Golgi [9].
Với những ưu điểm có được, hệ thống P. pastoris hiện đang được sử dụng rộng rãi để sản xuất protein tái tổ hợp với số lượng lớn và đáp ứng được nhu cầu sử dụng của con người.
20
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU