Protein OmpN tái tổ hợp sau khi hòa tan bằng Urea sẽ được tiến hành tinh sạch bằng sắc ký ái lực để thu được protein OmpN có độ tinh sạch cao dùng cho các thí nghiệm sau này
a) Tinh sạch và tái gấp cuộn đồng thời trên cột sắc ký ái lực Niken His trap FF 5ml.
Protein OmpN khi hòa tan với Urea ở nồng độ cao sẽ bị biến tính, do đó khi tinh sạch protein cần phải qua quá trình tái gập cuộn protein để thu được protein với cấu trúc như ban đầu.
Hình 3.4. Kết quả lượng protein không bám trong cột sắc ký ở các điều kiện khác nhau; A: không bổ sung glycerol 10% và 15mM glucose, B: bổ sung thêm glycerol10% và 15mM glucose, C: bổ sung thêm chất hỗ trợ và pha loãng mẫu xuống nồng độ thích hợp
Protein (nồng độ 4mg/ml ) sau khi hòa tan với Urea 8m được chạy qua cột sắc ký ái lực Niken với các chất hổ trợ khác nhau (glucose, glycerol). Kết quả ở hình 3.4 cho thấy khi sử dụng các dung dịch đệm không bổ sung các chất hỗ trợ glycerol 10% hay 15mM glucose thì lượng protein thất thoát ra ngoài cao, chỉ khoảng 55% lượng protein còn giữ lại trong cột (hình 3.4 A). Thêm vào đó, một lượng protein bị
44
thất thoát trong các quy trình rửa và tái gấp cuộn, nên lượng protein thu được sau khi thôi giải thấp, chỉ khoảng hơn 20%.
Tiến hành bổ sung thêm glycerol 10% và 15mM glucose vào trong các dung dịch đệm sử dụng cho quá trình tinh sạch. Hình 3.4 B cho thấy, lượng protein không bám lên cột Ni2+ giảm, theo kết quả thu được thì chỉ khoảng 30,4% lượng protein thất thoát ra ngoài. Ngoài ra, ở thí nghiệm tiếp theo, chúng tối tiến hành pha loãng nồng độ của mẫu protein từ 4mg/ml xuống khoảng 2,5-3mg/ml thì thu được kết quả khả quan hơn. Lượng protein không bám giảm đáng kể (hình 3.4 C), hơn 75% lượng protein được giữ lại trong cột sắc kí, và cũng ít protein thất thoát hơn trong quy trình rửa cũng như tái gập cuộn.
Kết quả thí nghiệm được trình bày tóm tắt ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả lượng protein thất thoát ở các điều kiện khác nhau
Nghiệm thức Glycerol 10% Glucose 15mM Pha loãng nồng độ mẫu Lượng protein thất thoát Hiệu suất 1 - - - 55% 45% 2 + + - 30.4% 69.6 % 3 + + + 25% 75%
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, sử dung binding buffer có bổ sung thêm 10% glycerol, 15mM glucose và pha loãng mẫu protein xuống khoảng 2,5-3mg/ml trước khi cho chạy qua cột sắc kí để tinh sạch sẽ giúp cho lượng protein bám lại trong cột là tốt nhất. Hiệu suất protein được giữ lại trong cột sắc kí là 75%.
Trong quy trình thôi giải protein, imidazol có trong đệm thôi giải sẽ cạnh tranh vị trí bám của đuôi His-tag của protein đối với các ion Ni2+ trong cột sắc ký. Khi đó các phân tử protein tự do sẽđược giải phóng ra ngoài. Hình 3.5 A cho thấy, trong điều kiện thôi giải bình thường, không bổ sung thêm các chất hỗ trợ tái gấp cuộn, hàm lượng protein đo được ở đỉnh của đồ thị theo phương pháp Braford khoảng 0.8 mg/ml và khoảng 20% lượng protein thu lại được sau quá thôi giải. Vì hàm lượng protein dính trên cột trước khi thôi giải chiếm khoảng 55% mà chúng tôi chỉ thu được 20% sau khi thôi giải nên có thể protein không được tái gấp cuộn đúng
45
và chúng trở lại dạng không tan và còn dính lên cột. Cột sau khi thôi giải được rửa lại với dung dịch Urea 8M để chứng minh giã thuyết này (kết quả không trình bày ở đây).
Do đó, chúng tôi tiến hành bổ sung thêm một số chất hỗ trợ cho quá trình tái gấp cuộn.
Hình 3.5. Kết quả tinh sạch OmpN tái tổ hợp trong điều kiện tái gấp cuộn;A: không có Arginine trong quá trình tái gấp cuộn, B: tái gập cuộn trong điều kiện bổ sung thêm L- Arginine
Theo các tài liệu nghiên cứu trước đây, có nhiều chất có thể hỗ trợ cho quá trình tái gấp cuộn như CHAPS, Tween 80, SDS, EDTA, MgCl2, hay ure, guanidine hydrochloride ở nồng độ thấp …
Tuy nhiên, trong số những chất trên, có những chất có thể làm biến tính hoặc gây ảnh hưởng đến cấu trúc của protein. Những nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, trong những chất hỗ trợ, L-arginine được sử dụng rộng rãi nhất, nó như là một chất ổn định không gây biến tính hay ảnh hưởng đến cấu trúc của protein. Do đó, chúng tôi tiến hành bổ sung thêm L-arginine vào đệm tái gấp cuộn (refolding buffer), nồng độ L-arginine được dùng là 0.4M.
Một số chất hỗ trợđược được thống kê ở bảng 3.2
46
Bảng 3.2. Các chất hỗ trợ cho quá trình tái gấp cuộn [28]
Chất hỗ trợ Nồng độ Ảnh hưởng
CHAPS 30mM chất tẩy rửa
EDTA 20mM chất càng cua (Chelate)
Glycerol 10–50% chất ổn định Guanidine HCl 0.1–1M Chaotroph L-arginine 0.4–0.5M chất ổn định Laroylsarcosin Up to 4M chất tẩy rửa MgCl2/CaCl2 2–10mM Cation NaCl/Ammonium sulfate 0.2–0.5M muối Non-detergent sulfo betain
Up to 1M chất hòa tan (Solublizer)
PEG 3350 Up to 0.5% W/V Osmolyte SDS 0.1% chất tẩy rửa Sodium citrate/sulfate 0.2–0.5M muối Sucrose/glucose Up to 0.75M chất ổn định TMAO 1–3M Tris 0.4–1M Buffer Triton X-100 0.1–1% chất tẩy rửa Tween-80 0.01% chất tẩy rửa Glycine Up to 1M Osmolyte Proline Up to 1M Osmolyte Urea 0.1–2M Chaotroph
Hình 3.5B cho thấy, lượng protein thôi giải cao hơn so với thí nghiệm không có bổ sung L-Arginine trong đệm thôi giải, nồng độ protein đo được theo phương pháp Braford là 1,1 mg/ml. Và tổng lượng protein OmpN tinh sạch thu được khoảng 25,5% lượng protein ban đầu cho vào.
47 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.6. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% quá trình tinh sạch protein His tag-OmpN trong điều kiện tái gấp cuộn; Giếng1: mẫu protein OmpN trước khi tinh sạch, Giếng2: protein OmpN không bám vào cột, Giếng 3: protein OmpN thu được ở giai đoạn rửa (wash), Giếng 4,5: protein OmpN thu được ở giai đoạn tái gấp cuộn trên cột, Giếng 6: thang chuẩn protein, Giếng7,8,9: protein OmpN thu được ở giai đoạn thôi giải
Quan sát trên gel SDS PAGE 12.5% điện di kiểm tra kết quá trình tinh sạch protein OmpN ở hình 3.6 thấy: ở các giếng đều có xuất hiện vạch đậm có kích thước tương ứng với kích thước của protein OmpN tái tổ hợp (~49 kDa). Ở giếng 2, 3 ngoài protein OmpN còn có xuất hiện các vạch của protein tạp khác. Tuy nhiên, ở giếng 4, 5 protein tạp giảm đáng kể, chỉ thấy xuất hiện một vài vạch mờ. Và kết quả ở các giếng 7,8,9 cho thấy protein tinh sạch thu được là khá tốt, độ tinh sạch khoảng hơn 90% và không thấy xuất hiện các vạch phụ.
Tuy nhiên, lượng protein thu được sẽ bị thất thoát trong quá trình loại muối, nồng độ protein cuối cùng sẽ không đáp ứng được nhu cầu của những thí nghiệm tiếp theo. Do đó, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein theo một phương pháp khác, nhằm nâng cao hiệu suất tinh sạch và thu được lượng protein OmpN cần thiết với nồng độ cao hơn.
b) Tinh sạch OmpN tái tổ hợp trong điều kiện biến tính với Urea
Sử dụng đệm thôi giải có Urea với nồng độ lần lượt 2M, 4M, 6M để thu nhận protein OmpN và không qua quá trình tái gấp cuộn trực tiếp trên cột sắc ký. Trong trường hợp này, quá trình tái gấp cuộn sẽ được thực hiện trong quá trình trao đổi dung dịch đệm sau khi thu được protein tinh sạch.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
55.6 kDa 42.7 kDa 49 kDa
48
Hình 3.7. Kết quả tinh sạch OmpN-His tag trong điều kiện biến tính; A: Urea 2M, B: Urea 4M, C: Urea 6M
Trong điều kiện đệm thôi giải có Urea 2M (hình 3.7 A), nồng độ protein OmpN đo được theo phương pháp Braford ở đỉnh cao nhất nằm trong khoảng 1,6 mg/ml. Lượng protein thu được sau tinh sạch khoảng 34-35% lượng protein ban đầu.
C B A
49
Khi tăng nồng độ Urea lên 4M (hình 3.7 B), lượng protein thu được cũng không tăng lên đáng kể. Nồng độ protein đo được ở đỉnh cao nhất cũng khoảng 2mg/ml và tổng lượng protein thu được khoảng 39% so với tổng lượng protein cho vào.
Ở thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành tăng nồng độ urea lên 6M (hình 3.7 C), bằng với nồng độ của urea có trong binding buffer. Kết quả cho thấy, lượng protein thu được tăng lên đáng kể, nồng độ protein thu được rất cao, ởđỉnh cao nhất đo được khoảng 5mg/ml. Tổng lượng protein tinh sạch thu được đạt hơn 50% so với lượng protein đầu tiên nạp vào cột sắc ký.
Hình 3.8. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% quá trình tinh sạch OmpN- His tag trong điều kiện biến tính; Giếng 1: mẫu protein OmpN trước khi tinh sạch, Giếng 2: protein không bám trên cột sắc ký, Giếng 3: protein ra khỏi cột trong quá trình wash, Giếng 4: thang protein chuẩn, Giếng5: protein thu được sau tinh sạch
Kết quả trên hình 3.8 cho thấy, ở giếng 5, với 20µl protein chỉ thấy một vạch có kích thước khoảng 49kDa, tương ứng với kích thước dự đoán, và không xuất hiện các vạch phụ..
Dựa vào các thí nghiệm trên, chúng tôi có kết quả sau: ở cả 2 quy trình tinh sạch, hiệu suất tinh sạch là khá tốt, kết quảđiện di trên gel SDS PAGE không thấy xuất hiện các protein tạp. Tuy nhiên, khi tinh sạch ởđiều kiện biến tính thì nồng độ
55.6 kDa 42.7 kDa 49 kDa
50
protein thu được là cao hơn, và ở Urea 6M thì lượng OmpN thu được sau quá trình tinh sạch là cao nhất, khoảng 50%protein tổng số nằm ở phần cặn.