a) Thu nhận và kiểm tra kháng thể kháng OmpN từ thỏ
33
Protein OmpN sau khi tinh sạch được gửi cho Viện Vaccine tại Nha Trang để gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ và thu nhận kháng thể kháng OmpN từ huyết thanh thỏ
*/ Kiểm tra độ đặc hiệu của kháng thể kháng thể kháng OmpN từ thỏ đối với vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp Western blot
Western blot là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tính đặc hiệu của kháng thểđể phát hiện ra protein đã được điện di trên gel SDS-PAGE và chuyển lên màng lai. Phương pháp được thực hiện theo các bước sau:
- Protein His-OmpN và sinh khối vi khuẩn E. ictaluri được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE (50 ng protein / giếng)
- Protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí protein đã được phân tách trên gel
- Ủ màng lai với 5% skim milk trong TBS/T buffer
- Ủ màng lại đã được cố định protein bằng kháng thể kháng OmpN từ thỏ (kháng thể sơ cấp) để tạo thành một phức hợp protein OmpN -kháng thể
- Tiếp tục ủ màng lai với kháng thể thứ cấp (kháng thể dê kháng thỏ) có gắng enzyme horseradish peroxidase (HRP) với tỷ lệ 1/5000. Lúc này kháng thể thứ cấp sẽ gắn vào kháng thể sơ cấp tạo phức protein-kháng thể sơ cấp- kháng thể thứ cấp
- Ủ màng lai với dung dịch hiện màu 3,3’-Diaminobenzidine (DAB), lắc đều khoảng 1-2 phút cho hiện màu rồi rửa ngay với nước cất
b) Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN */ Kiểm tra độc tính của protein OmpN tinh sạch đối với cá Tra
Tiêm cá bằng dịch OmpN đã tinh sạch sau lên men trong hệ thống E. coli với 2 nồng độ 10µg/100µl và 30µg/100µl.
Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức như trong bảng 2.6. Mỗi nghiệm thức gồm 30 con, và được lập lại 3 lần.
34
Bảng 2.6. Thí nghiệm khảo sát độc tính của protein OmpN tinh sạch đối với cá Tra
Nghiệm
thức Lượng tiêm Aluminium phosphate Số cá
1 10µg/100µl - 30 cá/bể x3 2 10µg/100µl + 30 cá/bể x3 3 30µg/100µl - 30 cá/ bể x3 4 30µg/100µl + 30 cá/bể x3 ĐC 1 PBS 1X - 30 cá/bể x3 ĐC 2 PBS 1X + 30 cá/bể x3 ĐCKT 30 cá/ bể x3 Tổng 630 cá/ 21 bể
Cá thí nghiệm có trọng lượng trung bình 12-15 gram/con. Trước khi thí nghiệm, nuôi thuần cá trong bể composite 2 tuần. Trong suốt thời gian thí nghiệm, cho cá ăn 2 lần một ngày, 8 giờ sáng và 5 giờ chiều, khẩu phần ăn đồng đều ở mỗi bể là 3 -5 % trọng lượng cơ thể/ngày.
Kiểm tra số lượng cá chết hằng ngày để đánh giá độc tính của OmpN đối với cá tra.
Sau khi tiêm 2 tuần, thu huyết thanh cá để kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch.
*/ Dùng phương pháp double sandwich ELISA để kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của cá Tra
ELISA (Enzymee-Linked Immunosorbent Assay) là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu, chẩn đoán và xét nghiệm bởi vì nó có khả năng phát hiện nhạy bén với một lượng vật chất rất nhỏ.
Phương pháp double sandwich ELISA hay còn gọi là phương pháp ELISA trực tiếp, là phản ứng kẹp kháng nguyên nằm giữa hai kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên. Trong đó có một kháng thể được gắn với enzyme, enzyme này sẽ làm cho chất nền biến màu (thành màu vàng) nếu kháng thể có phản ứng với kháng nguyên. Ðộ màu tạo thành là tỉ lệ với lượng enzyme bám ở giếng plastic, từđó suy ra lượng kháng thể, sau đó tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên
35
ELISA được thực hiện trong đĩa plastic kích thước 8cm x 12cm, chứa 8x12 giếng. Mỗi giếng có chiều cao khoảng 1cm và đường kính là 0,7cm. Bao gồm các bước sau
- Ủ giếng với huyết thanh cá đã tiêm protein OmpN tinh sạch ở 40C , qua đêm - Rửa sạch giếng bằng wash buffer (3 lần, 10 phút/lần)
- Ủ blocking buffer vào giếng trong 2 giờ, 370C
- Rửa sạch giếng bằng wash buffer (3 lần, 10 phút/ lần)
- Ủ giếng với OmpN tinh sạch được pha loãng bằng blocking buffer trong 2 giờ, 370C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Rửa sạch giếng bằng wash buffer (3 lần, 10 phút/lần)
- Ủ giếng bằng kháng thể goat anti rabbit (1/5000) trong 1h, ở 370C - Rửa sach giếng bằng wash buffer 3 lần (10 phút/lần)
- Cho cơ chất hiện màu substrate buffer vào, ủ trong 15 phút - Ngưng phản ứng bằng stop solution
- Xem kết quả bằng cách đo OD của mỗi giếng ở nước sóng 450nm.