a. Chuẩn bị tế bào chủng DH5α khả nạp bằng phương pháp hóa biến nạp
• Nguyên tắc: Các tế bào E.coli được phát triển ở pha log. Tế bào thu được bằng cách li tâm và huyền phù tế bào trong dung dịch có chứa CaCl2. Trộn lẫn DNA plasmid vào một dung dịch đệm phosphate với CaCl2 tạo ra phức hợp calcium-phosphate-DNA plasmid dính chặt vào màng tế bào và đi vào tế bào chất nhờ hiện tượng thực bào. Các tế bào phát triển trên môi trường không chọn lọc, cho phép tổng hợp protein kháng kháng sinh được mã hóa trong plasmid, sau đó được nuôi trên môi trường chứa kháng sinh cho phép xác định các khuẩn lạc chứa plasmid.
• Chuẩn bị tế bào khả nạp
- Cấy 1 khuẩn lạc E.coli DH5α vào 5 ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy lắc cấy lắc 250 vòng/phút ở 37oC, qua đêm.
- Cho 1 ml dịch cấy vào 100 ml môi trường lỏng LB. Nuôi cấy lắc 250 vòng/phút ở 37oC cho đến khi giá trị OD590 của dịch nuôi cấy đạt khoảng 0.375 (không được để OD590 quá 0.4)
- Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50ml lạnh. Ngâm trong nước đá trong 5 - 10 phút.
Chú ý: Tất cả các bước tiếp theo phải thực hiện trong đá lạnh.
- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 3000 vòng/phút/ 7phút/ 4oC. Bỏ phần dịch trong bên trên.
- Huyền phù sinh khối tế bào trong 10ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Ly tâm ở 2700 vòng/phút/5 phút/4oC. Bỏ dịch nổi.
- Huyền phù sinh khối tế bào trong 10ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ trên đá trong 30 phút. Ly tâm 2700 vòng/phút/ 5 phút/ 4oC.
- Huyền phù sinh khối trong 2ml dung dịch CaCl2 0,1 M + 10% glycerol lạnh. - Chia lượng nhỏ 100µl và làm lạnh nhanh ở -80oC.
37
- Trộn đều nhẹ nhàng 100 ng DNA plasmid trong 100 µl tế bào E.coli khả nạp. Giữ trong bểđá 10 phút.
- Chuyển nhanh dịch tế bào trên vào bểổn nhiệt 42oC trong 2 phút. - Nhanh chóng chuyển dịch tế bào vào bểđá trong 1-2 phút.
- Cho vào 250 µl môi trường LB. Nuôi cấy lắc ở 37oC, 1 giờ.
- Lấy 100 µl dịch trải trên môi trường LB agar có bổ sung kháng sinh ampicilline (50µg/ml).
- Ủ 37oC, qua đêm.
- Kiểm tra kết quả biến nạp bằng PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi pGEX
c. Cắt plamid bằng emzym EcoRI và NotI
- Phản ứng cắt giới hạn gồm các thành phần sau: DNA; EcoRI buffer; BSA 10X; enzyme NotI, enzyme EcoRI và H2O. Tổng thể tích phản ứng cắt là 50µl.
- Ủ phản ứng cắt ở 370C trong 3 giờ. Thành phần phản ứng cắt được trình bày ởbảng 2.7 Bảng 2.7. Thành phẩn phản ứng cắt plasmid Thành phần phản ứng Thể tích sử dụng EcoRI buffer 5 µl BSA 10X 5 µl NotI (10u/µl) 1.5 µl EcoRI (20u/µl) 1 µl Plasmid tinh sạch 20 µl (10µg) H2O 17.5 µl
d. Nối đoạn gen OmpN vào plasmid pPIC9K
- Đoạn gen OmpN và plasmid pPIC9k sau khi cắt bằng enzyme được tách và tinh sach bằng bộ kit kit Miniprep và PCR Purification kit của hãng Qiagen.
- Đoạn gen OmpN được nối vào pPIC9K theo công thức sau:
- Ủ hỗn hợp qua đêm ở 16°C ng(plasmid) x bp (insert) x bp (plasmid) 3 1
38
Thành phần phản ứng nối được trình bày ởbảng 2.8
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng nối pPIC9K và OmpN
Thành phần phản ứng Thể tích
Plasmid pPIC9K 6 µl (300ng) Đoạn gen OmpN tinh sạch 4.68 µl (117 ng)
T4 DNA enzyme 1.5 µl (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
T4 DNA buffer 2 µl
H2O 5.82 µl
e. Biến nạp sản phẩm nối vào chủng E.coli DH5α
- Sản phẩm nối được biến nạp vào chủng E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp đã được trình bày ở mục 2.2.2.1.b
- Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi 3’AOX1 và 5’ AOX1 đặc trưng cho plasmid pPICK9K.