Đoạn gen OmpN sau khi tinh sạch sẽ được đem nối với pPIC9K đã được cắt bởi 2 enzyme NotI và EcoRI theo công thức nối đã trình bày ở phần d, mục 2.2.2.1. Sau đó đem biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α khả nạp và nuôi tế bào trên đĩa LB agar có bổ sung 50µg/ml kana và 50µg/ml amp.
Bắt ngẫu nhiên 20 khuẩn lạc, đánh dấu từ N1 đến N20, kiểm tra kết quả tạo dòng bằng PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi 3’AOX1 và 5’AOX1 đặc trưng của pPIC9K. Nếu quá trình biến nạp thành công thì kết quả điện di agarose sẽ cho thấy những vach có kích thước khoảng 1706bp.
1 2
1000 bp 1500 bp
58
Hình 3.13. Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi 3’AOX1 và 5’AOX1; Giếng 1-20: các khuẩn lạc N1 - N20
Kết quả ở hình 3.13 cho thấy, sản phẩm PCR ở các giếng 3,5,7 (hình A) và giếng 11, 12 (hình B) cho vạch có kích thước khoảng 1706 bp, tương ứng với đoạn gen OmpN.
Để khẳng định chính xác kết quả tạo dòng trong pPIC9k, chúng tôi tiến hành tách plasmid từ những tế bào đã được kiểm tra PCR khuẩn lạc, sau đó sử dụng 2 enzyme NotI và EcoRI cắt để kiểm tra. Kết quảđược thể hiện ở hình 3. 14
B 1500 bp 1000 bp 2000 bp 10000 bp 1000 bp 2000 bp 10000 bp 1500 bp
59
Hình 3.14. pPIC9k được tách từ các chủng E. coli DH5α đã kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc (A) ( Giếng 1,2,3: plasmid tách từ các chủng N3, N5, N7,Giếng 4: thang DNA) và sản phẩm cắt pPIC9K::OmpN bằng NotI và EcoRI (B) ( Giếng 1: tháng DNA, Giếng 2,3,4: sản phẩm cắt plasmid từ các chủng N3, N5, N7) được điện di trên gel agarose 1%
Ở các giếng 2,3,4 ở hình 3.14 B ta đều thấy xuất hiện 1 vạch với kích thước khoảng 9263 bp, tương ứng với kích thước của pPIC9k và 1 vạch có kích thước tương ứng với kích thước của đoạn gen OmpN, khoảng 1209 bp.
Kết luận: Đã tạo dòng thành công chủng E. coli DH5α mang đoạn gen OmpN được nối với pPIC9k.