Chủng E. coli BL21(DE3) mang gen OmpN nối với plasmid pET28 được tăng sinh và biểu hiện theo phương pháp ở mục 2.2.1.1. Sau khi OD600 đạt đến 0.6, tiến hành cảm ứng với IPTG nồng độ cuối là 1mM và tiếp tục nuôi cấy lắc 250 vòng/phút ở 370C trong 3h.
Sau quá trình biểu hiện, ly tâm dịch lên men thu sinh khối và kiểm tra kết quả biểu hiện protein bằng điện di SDS-PAGE 12.5%.
Hình 3.1. Kết quảđiện di trên gel SDS PAGE 12.5% protein OmpN được biểu hiện trong E. coli; Giếng 1:thang , Giếng 2:protein tổng số E. coli BL21(DE3) trước cảm ứng IPTG, Giếng 3:protein tổng số E. coli BL21(DE3) sau cảm ứng IPTG
Hình 3.1 cho thấy, ở giếng 3 xuất hiện một vạch đậm hơn nhiều lần so với những vạch còn lại và có kích thước tương ứng với kích thước của protein OmpN dung hợp với His-tag (~ 49kDa). Chứng tỏ, sau 3h cảm ứng bởi IPTG, protein OmpN đã được biểu hiện cao (overexpress) trong E. coli.
Sau khi ly tâm thu sinh khối tế bào E. coliđã biểu hiện protein, tiến hành phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm (sonicate) để thu nhận protein OmpN tái tổ hợp được
50 kDa 40 kDa 60 kDa
30 kDa
41
biểu hiện dưới dạng hòa tan hay thể vùi (inclusion bodies) nhằm xác định các phương pháp nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.2. Kết quảđiện di trên gel SDS PAGE 12.5% protein OmpN sau khi phá vỡ
tế bào E. coli bằng sonicator; Giếng 1: thang protein, Giếng2: dịch nổi tế bào, Giếng3: cặn của tế bào
Dựa vào trình tự amino acid của protein OmpN dung hợp với His tag có thể dựđoán được khả năng không tan của protein là hơn 75% khi biểu hiện ở mức cao trong tế bào E. coli [48]. Thực nghiệm cho thấy trên hình 3.2, ở giếng 3, phần cặn tế bào xuất hiện một vạch protein đậm có kích thước khoảng 49kDa tương ứng với kích thước của protein OmpN tái tổ hợp. Trong khi đó, ở phần dịch nổi (giếng 2,) không có vạch tương ứng. Như vậy, chúng tôi có thể kết luận rằng, khi biểu hiện protein OmpN trong E. coliở 370C, cảm ứng bởi 1mM IPTG thì protein OmpN thu được khá nhiều và phần lớn OmpN tái tổ hợp đều nằm ở dạng thể vùi, không tan.
Để biểu hiện được protein OmpN trong hệ thống E. coli ở dạng hòa tan, chúng tôi đã thử tiến hành thay đổi một vài điều kiện của quá trình biểu hiện như: giảm nồng độ IPTG cảm ứng, cảm ứng ở điều kiện nhiệt độ 280C. Tuy nhiên, kết quả kiểm tra cho thấy protein OmpN vẫn ở dạng thể vùi (dữ liệu không được trình bày ở đây). Vì vậy, chúng tôi chuẩn bị mẫu protein OmpN để tiến hành tinh sạch bằng
1 2 360 kDa 60 kDa 40 kDa 50 kDa 30 kDa 49 kDa
42
cách hòa tan protein OmpN dạng thể vùi với các nồng độ Urea khác nhau để kiểm tra và thu được protein ở dạng hòa tan tốt nhất.