a) Hòa tan protein OmpN ở dạng thể vùi bằng urea
¾Sinh khối tế bào E. coliđã thu được rửa bằng PBS 1X (3 lần)
¾Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm
¾Hòa tan protein ở dạng thể vùi bằng Urea (ở các nồng độ 5M, 6M, 7M, 8M), và chọn nồng độ Urea hòa tan tốt nhất để sử dụng
b) Tinh sạch protein OmpN bằng sắc ký ái lực */ Trong điều kiện tái gấp cuộn trên cột.
¾ Dùng buffer A pha loãng mẫu protein His-OmpN xuống 6M urea
¾ Ly tâm dịch protein, thu dịch nổi
¾ Lấy dịch protein đã chuẩn bị đem tinh sạch theo phương pháp sắc kí ái lực (sử dụng cột His trap FF 5ml) theo các bước sau:
- Rửa cột với 50ml nước cất (tốc độ dòng chảy 2ml/phút)
- Cân bằng cột với 50 ml binding buffer (tốc độ dòng chảy 2ml/phút)
- Nạp mẫu protein cần tinh sạch vào cột sắc ký và thu protein không bám (tốc độ dòng chảy 0.5 ml/phút)
- Rửa lại với 25ml binding buffer (tốc độ dòng chảy 1ml/phút)
- Tái gập cuộn protein ngay trên cột với đệm tái gấp cuộn và binding buffer (chạy gradient nồng độ từ 6M – 0M Urea, tốc độ dòng chảy 1ml/phút trong 85 phút)
- Thu nhận các phân đoạn protein OmpN được thôi giải ra bằng đệm thôi giải (tốc độ dòng chảy 0.5 ml/phút)
32
- Loại imidazole ra khỏi các phân đoạn có nồng độ protein cao bằng phương pháp sắc lý lọc gel Superfine Sephadex G-25.
- Kiểm tra kết quả tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE
*/ Trong điều kiện biến tính
¾ Dùng buffer A pha loãng mẫu protein His-OmpN xuống 6M urea
¾ Ly tâm mẫu protein: 15000 vòng/ phút, 15 phút, thu dịch nổi
¾ Lấy dịch protein đem tinh sạch bằng phương pháp sắc kí ái lực (sử dụng cột His trap FF 5ml) theo các bước sau:
- Rửa cột với 50ml nước cất (tốc độ dòng chảy 2ml/phút)
- Cân bằng cột với 50 ml binding buffer (tốc độ dòng chảy 2ml/phút)
- Nạp mẫu protein cần tinh sạch vào cột và thu protein không bám (tốc độ dòng chảy 0.5 ml/phút)
- Rửa lại với 25ml binding buffer (tốc độ dòng chảy 1ml/phút)
- Thu nhận các phân đoạn protein OmpN được thôi giải ra bằng đệm thôi giải (tốc độ dòng chảy 0.5 ml/phút)
- Đo nồng độ protein trong các phân đoạn bằng phương pháp Bradford.
- Loại imidazole ra khỏi các phân đoạn có nồng độ protein cao bằng phương pháp sắc lý lọc gel Superfine Sephadex G-25.
- Kiểm tra kết quả tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE
c) Loại muối theo phương pháp sắc lý lọc gel Superfine Sephadex G-25(GE Healthcare)
- Cân bằng cột bằng 50ml desalting buffer (tốc độ dòng chảy 2ml/phút) - Nạp mẫu protein đã tinh sạch vào cột (tốc độ dòng chảy 0.3 ml/phút)
- Thu nhận protein đã loại được trao đổi dung dịch đêm desalting buffer trong eppendorf, 0.5ml/epp