Tiến hành 2 phản ứng cắt pPIC9k::OmpN bởi 2 enzyme BglII và SalI.
1 2 3 4 A 1000 bp 1500 bp B 10000 bp
60
Hình 3.15. Kết quả cắt pPIC9K::OmpN bằng SalI và BglII được điện di trên gel agarose 1%; Giếng 1: thang DNA, Giếng 2: plasmid trước khi cắt,
Giếng 3: cắt bằng SalI, Giếng4: cắt bằng BglII
Trên pPIC9k có 1 vị trí cắt của enzyme SalI và 2 vị trí cắt của enzyme BglII. Kết quả ở hình 3.15 cho thấy, ở giếng 3, mẫu plasmid được cắt bởi enzyme SalI, xuất hiện một vạch kích thước khoảng 10.5 kb, phù hợp với kích thước dự kiến. Trong khi đó, ở giếng thứ 4, mẫu plasmid cắt bởi enzyme BglII, xuất hiện 2 vạch với kích thước khoảng 2.9 kb và 7.5 kb, phù hợp với kích thước dự kiến. Chứng tỏ các phản ứng cắt đã được thực hiện thành công.
Sau đó, tiến hành thu nhận và tinh sạch plasmid đã cắt thành công bằng kit Gel Extraction kit của hãng Qiagen, rồi điện di bằng gel agarose 1% để kiểm tra. Kết quả tinh sạch được trình bày ở hình 3.16
10000 bp
1 2 3 4
2000bp 7000bp 3000 bp
61
Hình 3.16. Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt pPIC9k:: OmpN được điện di trên gel agarose 1%; Giếng 1: thang DNA,Giếng 2: plasmid trước khi cắt,
Giếng 3: cắt bằng SalI, Giếng4: cắt bằng BglII
Biến nạp các plamid đã được tinh sạch vào trong tế bào P. pastoris khả nạp đã được chuẩn bị theo mục 2.2.2.2. Sau đó nuôi cấy tế bào trên môi trường MD, ủ từ 2- 3 ngày ở 280C.
Hình 3.17. Các khuẩn lạc Pichia pastoris mọc trên đĩa môi trường MD sau khi biến nạp pPIC9K::OmpN; A: biến nạp plasmid được cắt bởi SalI, B: biến nạp plasmid được cắt bởi BglII
Sau 2-3 ngày ủ trong 280C, trong đĩa môi trường MD agar đã có khá nhiều khuẩn lạc phát triển. Hình 3. 17 cho thấy, các khuẩn lạc có màu trắng ngà, hình tròn, không tạo răng cưa ở mép. Các khuẩn lạc biến nạp plasmid được cắt bởi
A B
1 2 3 4
2000bp 7000bp 3000 bp
62
enzyme SalI phát triển tốt hơn và nhiều hơn so với các khuẩn lạc biến nạp plasmid được cắt bởi BglII.
Để khẳng định chính xác kết quả, chúng tôi tiến hành tách bộ gen của các dòng P. pastoris và PCR với cặp mồi 3’AOX1 và 5’AOX1 để kiểm tra.
Hình 3. 18. Kết quả PCR kiểm tra kết quả tạo dòng P. pastoris mang đoạn gen OmpN; Giếng1: dòng P. pastoris SalI, Giếng 2: dòng P. pastoris BglII, Giếng 3: thang DNA
Hình 3.18 cho thấy, ở giếng 1, dòng Mut+ (pPIC9k được cắt bởi SalI) xuất hiện 2 vạch, một vạch tương ứng với kích thước của đoạn gen mã hóa cho protein OmpN (~ 1,7 kb) và một vạch cao hơn (~ 2,2 kb) tương ứng với gen AOX1. Trong khi đó ở giếng 2, dòng MutS mang pPIC9K được cắt bởi enzyme BglII sẽ mất đi gen AOX1 nên chỉ chỉ xuất hiện một vạch tương ứng với kích thước của đoạn gen mã hóa cho protein OmpN (~1.7 kb).
Như vậy, ở cả 2 giếng đều xuất hiện vạch phủ hợp với kích thước của đoạn gen OmpN, nên có thể kết luận rằng chúng tôi đã tạo chủng P. pastoris mang đoạn gen OmpN thành công ở cả 2 dòng Mut+ và MutS.
Từ những kết quả trên, chúng tôi có thể kết luận rằng: đã tạo dòng thành công chủng P. pastoris mang gen OmpN.
3000 bp
1 2 3
2000 bp 1500 bp
63 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});