Superfine Sephadex G-25
Hình 3.9. Kết quảđiện di trên gel SDS PAGE qua trình loại muối protein sau tinh sạch; Giếng 1: thang chuẩn protein, Giếng 2: mẫu protein OmpN ban
đầu, Giếng 3: protein OmpN sau tinh sạch, Giếng 4: protein OmpN loại muối
Trong quá trình loại muối bằng sắc ký lọc gel trên cột sephadex G-25. tùy từng mẫu protein mà chúng tôi điều chỉnh tốc độ và thời gian của quá trình khác nhau. Đối với mẫu protein tinh sạch trong điều kiện tái gấp cuộn trên cột, mục đích của quá trình là loại imidazol và muối NaCl ra khỏi dịch protein và protein đã được gấp cuộn lại nên tốc độ dòng chảy của desalting buffer là 0.5 ml/ phút. Tuy nhiên, với những mẫu protein tinh sạch trong điều kiện biến tính, quá trình loại muối nhằm loại urea, imidazol và NaCl ra khỏi dịch protein, đồng thời protein sẽ tái gấp cuộn lại, do đó tốc độ dòng chảy của desalting buffer là 0.1ml/phút. Ngoài ra, với những mẫu có nồng độ cao, chúng tôi tiến hành pha loãng nồng độ xuống khoảng 1-1.5 mg/ml để quá trình tái gấp cuộn protein diễn ra tốt hơn.
55.6 kDa
51
Với mẫu protein tinh sạch trong điều kiện dung dịch đệm thôi giải có Urea 4M và 6M, chúng tôi đã thử tiến hành loại muối và tái gấp cuộn theo nồng độ giảm dần, xuống 2M và 0M. Tuy nhiên, trong mỗi lần loại muối, lượng protein thất thoát cũng khá cao, chỉ thu được khoảng 40-50%. Do đó, chúng tôi loại muối và tái gấp cuộn trực tiếp từ 6M xuống 0M để hạn chế bớt lượng protein thất thoát. Kết quả được trình bày tóm tắt ở bảng 3.3.
Bảng 3.3 Tóm tắt kết quả quá trình loại muối từ 6M đến 0M bằng sắc ký lọc trên cột gel sephadex G25
Nghiệm thức Nồng độ pha loãng mẫu Hiệu suất
1 6 mg/ml 25% 2 5mg/ml 30.8% 3 4mg/ml 40% 4 3mg/ml 54.3% 5 2mg/ml 64.7% 6 1-1.5mg/ml 73.5% 3.1.3. Khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN
3.1.3.1. Kiểm tra kháng thể kháng OmpN từ thỏ bằng phương pháp Western blot
Protein OmpN tái tổ hợp sau khi tinh sạch được gửi ra viện Vaccine tại Nha Trang để thu nhận kháng thể kháng OmpN từ thỏ. Sau đó, chúng tôi tiến hành đánh giá kháng thể kháng OmpN có trong huyết thanh thỏ bằng phương pháp Western blot.
52
Hình 3.10. Kết quả đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể thỏ kháng OmpN; A: SDS-PAGE12.5% ,B:Western Blot (A)(Giếng 1: His tag-OmpN tinh sạch, Giếng 2: thang chuẩn protein, Giếng 3,4: protein tổng số của E. ictaluri); (B)( Giếng 1: His tag-OmpN tinh sạch, Giếng 2: thang chuẩn protein, Giếng 3: protein tổng số của E. ictaluri.
Kết quả Western blot, ở hình 3.10 B cho thấy, giếng 1 xuất hiện 1 vạch kích thước khoảng ~49 kDa, tương ứng với với kích thước của protein OmpN dung hợp His-tag (hình A). Trong khi đó, ở giếng protein tổng số của E. Ictaluri thì kháng thể chỉ nhận biết đặc hiệu được 1 vạch protein vớ kích thước khoảng ~ 44 kDa. tương ứng với kích thước của OmpN vi khuẩn E. ictaluri . Vì protein OmpN (44kD) dung hợp với 2 đầu His-Tag (5kD) cho ra một protein có kích thước 49kD so với kết quả này hoàn toàn phù hợp với mong muốn. Kết quả trên cho thấy kháng thể đa dòng của thỏ kháng OmpN tái tổ hợp chỉ nhận biết đặc hiệu một protein tương ứng với OmpN của E. Ictaluri.
3.1.3.2. Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN
a. Tác động của protein OmpN tinh sạch đối với cá Tra
Thử nghiệm đánh giá độc tính của OmpN tinh sạch đối với cá tra gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 30 con cá, được lập lại 3 lần (bảng 3.3). Số lượng cá chết được ghi nhận hằng ngày trong vòng 13 ngày. Số lượng cá chết được thể hiện ởđồ thị 3.1 A 1 2 3 4 B 1 2 3 50 kDa 40 kDa 30 kDa 60 kDa 55 kDa 43 kDa 72 kDa
53 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1 2 3 4 5 6 7
Đồ thị 3.1 Số lượng trung bình cá chết ở các nghiệm thức đánh giá độc lực của OmpN trên cá tra. Thí nghiệm 30 cá/lô, 3 lô/nghiệm thức. ;1: tiêm cá với OmpN 10µg/100µl không bổ sung adjuvant Aluminium phosphate;
2: tiêm cá với OmpN 10µg/100µl bổ sung adjuvant Aluminium phosphate; 3: tiêm cá với OmpN 30µg/100µl không bổ sung adjuvant Aluminium phosphate; 4: tiêm cá với OmpN 30µg/100µl bổ sung adjuvant Aluminium phosphate; 5: đối chứng với PBS 1X không bổ
sung adjuvant Aluminium phosphate; 6: đối chứng với PBS 1X bổ sung adjuvant Aluminium phosphate; 7: đối chứng không tiêm
Dựa vào đồ thị 3.1, chúng tôi thấy:ở nghiệm thức 1, sau khi tiêm OmpN tinh sạch với nồng độ 10µg/100µl không bổ sung adjuvant aluminium phosphate, trung bình mỗi bể chết 5± 3.5 con. Trong khi đó, đối với nghiệm thức 2, cùng một nồng độ protein nhưng có bổ sung aluminium phosphate thì trung bình có 3± 1.5 con cá chết mỗi bể. Đối với những mẫu cá tiêm protein OmpN nồng độ 30µg/100µl, số lượng cá chết trung bình ở mỗi bể tăng lên. Ở nghiệm thức 3 trung bình mỗi bể có có đến 10.7± 5 con cá chết. Tuy nhiên, ở nghiệm thức 4, số lượng cá chết ít hơn, trung bình khoảng 5.3 ± 5.7cá chết mỗi bể.
Ở những nghiệm thức đối chứng, 2 nghiệm thức tiêm PBS 1X trung bình có khoảng 5.3± 5.7 con (mẫu không bổ sung adjuvant) và 7±7 con (mẫu có bổ sung adjuvant) cá chết mỗi bể. Trong khi đó, mới mẫu đối chứng không tiêm thì số lượng cá chết trung bình khoảng 1.7± 0.6 con mỗi bể. .
Nghiệm thức Số lượng cá
54
Kết quả trên cho thấy số lượng cá chết trung bình mỗi bểở các nghiệm thức tiêm OmpNlà không quá cao. Số lượng trung bình cá chết cao nhất là ở nghiệm thức 3, khoảng hơn 10 con mỗi bể, chiếm khoảng 33% tổng số lượng cá đem thí nghiệm. Và số lượng cá chết ở các bể tiêm OmpN không chênh lệch so với bể đối chứng. Như vậy, cá chết ở các bể thí nghiệm không phải do tác động của protein OmpN mà do quá trình tiêm hoặc các tác động môi trường trong quá trình nuôi.
Từ những thí nghiệm trên, chúng tôi có thể kết luận: protein OmpN tinh sạch không có độc tính mạnh đối với cá tra. OmpN tiêm với nồng độ 10-30ug/cá không gây độc trên cá giống. Do đó, có thể sử dụng để khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá, nhằm làm cơ sở cho việc sản xuất vaccine tiêu phần.
b. Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá tra đối với protein OmpN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo nguyên tác của phương pháp double sandwich ELISA được trình bày ở phần b, mục 2.2.1.3, chúng tôi thiết kế các thí nghiệm thích hợp. Kết quả phản ứng tạo màu ở phương pháp ELISA được đo OD ở bước sóng 450 nm, và được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Kết quảđo OD của phản ứng tạo màu trong ELISA
Thí nghiệm OD 10µg/100µl 30µg/100µl. Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Thí nghiệm 1 1.847 1.839 1.856 1.636 1.562 1.596 TB = 1.847 TB = 1.598 Đối chứng 1 0.217 0.22 0.248 0.181 0.236 0.185 TB = 0.228 TB = 0.2 Thí nghiệm 2 1.92 1.861 1.82 1.825 1.829 1.834 TB = 1.867 TB = 1.829 Đối chứng 2 0.244 0.215 0.226 0.263 0.256 0.227 TB = 0.228 TB = 0.249
Thí nghiệm 1: Huyết thanh cá tiêm OmpN tinh sạch không bổ sung Aluminium phosphate ở
các nồng độ 10µg/100µl và 30µg/100µl.
55
Thí nghiệm 2: Huyết thanh cá tiêm OmpN tinh sạch có bổ sung Aluminium phosphate ở
các nồng độ 10µg/100µl và 30µg/100µl.
Đối chứng 2: không cho kháng nguyên OmpN vào phản ứng ELISA
Dựa vào kết quả thu được ở bảng 3.4, chúng tôi thấy ở thí nghiệm 1, kết quả OD ở nồng độ 10µg/100µl cao hơn ở 30µg/100µl, tuy nhiên chênh lệch không đáng kể. Trong khi đó, ở thí nghiệm 2, kết quả OD đo được ở cả 2 nồng độ là tương đương nhau.
Đối với mẫu huyết thanh cá tiêm OmpN tinh sạch có bổ sung adjuvant Aluminium phosphate, OD đo được ở cả 2 nồng độ không chênh lệch nhiều so với mẫu huyết thanh cá tiêm OmpN không bổ sung Aluminium phosphate.
Và tất cả kết quả OD đo được ở các thí nghiệm đều cao hơn nhiều so với các phản ứng đối chứng.
Có thể kết luận rằng, protein OmpN tinh sạch không gây độc cho cá, và khi tiêm OmpN nồng độ 10µg/100µl cho cá thì đã xảy ra phản ứng đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với protein OmpN.
Từ kết quả trên, chúng tôi có thể sử dụng protein OmpN đã tinh sạch để kích thích đáp ứng miễn dịch cho cá. Tuy nhiên đáp ứng miễn dịch này có khả năng tăng sức đề kháng cho cá tra hay không thì cần phải có các nghiên cứu sâu hơn để có thể kết luận có thể sử dụng hay không OmpN như một vaccine tiểu phân.
Để có thể đưa vào ứng dụng OmpN tái tổ hợp cần được biểu hiện trong hệ thống an toàn hơn E.coli nhằm có thể sử dụng dịch lên men không cần qua tinh sạch cho cá ăn. Chúng tôi thử biểu hiện OmpN trong hệ thống nấm nem Pichia Pastoris.
3.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN
3.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang plasmid PIC9K nối với đoạn gen OmpN.
3.2.1.1. Thu nhận đoạn gen OmpN và pPIC9K từ chủng E. coli DH5α
Khi nhận được chủng E. coli BL21 mang đoạn gen OmpN nối với plasmid pGEX4T1 chúng tôi tiến hành tách plasmid và biến nạp vào E. coli DH5α theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.2.2.1.
Sau khi biến nạp thành công pGEX4T1:: OmpN vào E. coli DH5α, thu nhận những khuẩn lạc mọc trên đĩa LB agar có chứa kháng sinh ampicilline, tăng sinh
56
giữ chủng và tách plasmid để kiểm tra cũng và sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo.
Đồng thời, chúng tôi tiến hành tách pPIC9k từ E. coli DH5α bằng bộ kit Miniprep của hãng Qiagen. Sau đó, thực hiện các phản ứng cắt plasmid pGEX4T1:: OmpN và pPIC9K bằng 2 enzyme NotI và EcoRI theo công thức ở phần c, mục 2.2.2.1 và ủ trong 3 giờở 370C.
Kiểm tra kết quả phản ứng cắt bằng điện di trên gel agarose 1%
Hình 3.11. Kết quả điện di trên gel agarose1% plasmid pGEX4T1::OmpN (A)(Giếng1: thang DNA, Giếng 2: plasmid pGEX4T1::OmpN, Giếng 3: plasmid đã được cắt bằng enzyme NotI và EcoRI) và pPICK9K (B)(Giếng 1: thang DNA, Giếng 2: pPIC9k, Giếng 3: pPIC9K được cắt bởi NotI và EcoRI)
Kết quảở hình 3.11 (A) cho thấy giếng 3 có 2 vạch, kích thước tương ứng với kích thước của gen OmpN (~1209 bp) và plasmid pGEX4T1 (~ 4969 bp). Ngoài ra không có vạch phụ xuất hiện, vậy phản ứng cắt đã được thực hiện hoàn toàn.
Ở giếng thứ 3, hình 3.11 (B), xuất hiện một vạch khoảng 9263 bp, tương ứng với kích thước của pPIC9k bị cắt mất một đoạn 13 bp bởi 2 enzyme NotI và EcoRI. Chứng tỏ phản ứng cắt pPIC9K cũng đã được thực hiện hoàn toàn.
Khi các phản ứng cắt đã được thực hiện thành công, tiến hành thu nhận và tinh sạch đoạn gen OmpN bằng bộ kit Gel Extraction Kit của hãng Qiagen. Sản phẩm sau khi tinh sạch được điện di trên gel agarose để kiểm tra
1 2 3 B 1000 bp 1500 bp 4000 bp 5000 bp 10000 bp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
57
Hình 3.12. Kết quảđiện di trên gel agarose 1% đoạn gen OmpN đã được tinh sạch;
Giếng1: OmpN đã tinh sạch, Giếng 2: thang DNA
Trên hình 3.12 ta thấy, ở giếng 1 xuất hiện một vạch có kích thước tương ứng với kích thước của gen OmpN (1209 bp). Vạch khá rõ và không xuất hiện vạch phụ. Vậy, đoạn gen OmpN đã được tách và tinh sạch rất tốt, có thể dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1.2. Tạo dòng chủng E. coli DH5α mang đoạn gen OmpN nối với pPIC9K
Đoạn gen OmpN sau khi tinh sạch sẽ được đem nối với pPIC9K đã được cắt bởi 2 enzyme NotI và EcoRI theo công thức nối đã trình bày ở phần d, mục 2.2.2.1. Sau đó đem biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α khả nạp và nuôi tế bào trên đĩa LB agar có bổ sung 50µg/ml kana và 50µg/ml amp.
Bắt ngẫu nhiên 20 khuẩn lạc, đánh dấu từ N1 đến N20, kiểm tra kết quả tạo dòng bằng PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi 3’AOX1 và 5’AOX1 đặc trưng của pPIC9K. Nếu quá trình biến nạp thành công thì kết quả điện di agarose sẽ cho thấy những vach có kích thước khoảng 1706bp.
1 2
1000 bp 1500 bp
58
Hình 3.13. Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi 3’AOX1 và 5’AOX1; Giếng 1-20: các khuẩn lạc N1 - N20
Kết quả ở hình 3.13 cho thấy, sản phẩm PCR ở các giếng 3,5,7 (hình A) và giếng 11, 12 (hình B) cho vạch có kích thước khoảng 1706 bp, tương ứng với đoạn gen OmpN.
Để khẳng định chính xác kết quả tạo dòng trong pPIC9k, chúng tôi tiến hành tách plasmid từ những tế bào đã được kiểm tra PCR khuẩn lạc, sau đó sử dụng 2 enzyme NotI và EcoRI cắt để kiểm tra. Kết quảđược thể hiện ở hình 3. 14
B 1500 bp 1000 bp 2000 bp 10000 bp 1000 bp 2000 bp 10000 bp 1500 bp
59
Hình 3.14. pPIC9k được tách từ các chủng E. coli DH5α đã kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc (A) ( Giếng 1,2,3: plasmid tách từ các chủng N3, N5, N7,Giếng 4: thang DNA) và sản phẩm cắt pPIC9K::OmpN bằng NotI và EcoRI (B) ( Giếng 1: tháng DNA, Giếng 2,3,4: sản phẩm cắt plasmid từ các chủng N3, N5, N7) được điện di trên gel agarose 1%
Ở các giếng 2,3,4 ở hình 3.14 B ta đều thấy xuất hiện 1 vạch với kích thước khoảng 9263 bp, tương ứng với kích thước của pPIC9k và 1 vạch có kích thước tương ứng với kích thước của đoạn gen OmpN, khoảng 1209 bp.
Kết luận: Đã tạo dòng thành công chủng E. coli DH5α mang đoạn gen OmpN được nối với pPIC9k.
3.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN
Tiến hành 2 phản ứng cắt pPIC9k::OmpN bởi 2 enzyme BglII và SalI.
1 2 3 4 A 1000 bp 1500 bp B 10000 bp
60
Hình 3.15. Kết quả cắt pPIC9K::OmpN bằng SalI và BglII được điện di trên gel agarose 1%; Giếng 1: thang DNA, Giếng 2: plasmid trước khi cắt,
Giếng 3: cắt bằng SalI, Giếng4: cắt bằng BglII
Trên pPIC9k có 1 vị trí cắt của enzyme SalI và 2 vị trí cắt của enzyme BglII. Kết quả ở hình 3.15 cho thấy, ở giếng 3, mẫu plasmid được cắt bởi enzyme SalI, xuất hiện một vạch kích thước khoảng 10.5 kb, phù hợp với kích thước dự kiến. Trong khi đó, ở giếng thứ 4, mẫu plasmid cắt bởi enzyme BglII, xuất hiện 2 vạch với kích thước khoảng 2.9 kb và 7.5 kb, phù hợp với kích thước dự kiến. Chứng tỏ các phản ứng cắt đã được thực hiện thành công.
Sau đó, tiến hành thu nhận và tinh sạch plasmid đã cắt thành công bằng kit Gel Extraction kit của hãng Qiagen, rồi điện di bằng gel agarose 1% để kiểm tra. Kết quả tinh sạch được trình bày ở hình 3.16
10000 bp
1 2 3 4
2000bp 7000bp 3000 bp
61 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.16. Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt pPIC9k:: OmpN được điện di trên gel agarose 1%; Giếng 1: thang DNA,Giếng 2: plasmid trước khi cắt,
Giếng 3: cắt bằng SalI, Giếng4: cắt bằng BglII
Biến nạp các plamid đã được tinh sạch vào trong tế bào P. pastoris khả nạp đã được chuẩn bị theo mục 2.2.2.2. Sau đó nuôi cấy tế bào trên môi trường MD, ủ từ 2- 3 ngày ở 280C.
Hình 3.17. Các khuẩn lạc Pichia pastoris mọc trên đĩa môi trường MD sau khi biến nạp pPIC9K::OmpN; A: biến nạp plasmid được cắt bởi SalI, B: biến nạp plasmid được cắt bởi BglII
Sau 2-3 ngày ủ trong 280C, trong đĩa môi trường MD agar đã có khá nhiều khuẩn lạc phát triển. Hình 3. 17 cho thấy, các khuẩn lạc có màu trắng ngà, hình tròn, không tạo răng cưa ở mép. Các khuẩn lạc biến nạp plasmid được cắt bởi
A B
1 2 3 4
2000bp 7000bp 3000 bp
62
enzyme SalI phát triển tốt hơn và nhiều hơn so với các khuẩn lạc biến nạp plasmid được cắt bởi BglII.
Để khẳng định chính xác kết quả, chúng tôi tiến hành tách bộ gen của các dòng P. pastoris và PCR với cặp mồi 3’AOX1 và 5’AOX1 để kiểm tra.