a. Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris khả nạp
- Cấy chủng P. pastoris trên đĩa YPD và ủở 280C trong 2 ngày
- Tăng sinh một khuẩn lạc trong 15ml YPD, ủ lắc ở 280C, 250vòng/phút qua đêm
- Hút 2,5ml dịch nuôi cấy cho vào 250ml/erlen và lắc ở 280C qua đêm cho đến khi OD600 =1.3 – 1.5
- Ly tâm thu sinh khối tế bào (1500g, ở 40C trong 5 phút)
- Hòa lại sinh khối tế bào với 250ml nước lạnh, vô trùng. Sau đó ly tâm thu sinh khối (1500g, ở 40C trong 5 phút)
- Tiếp tục hòa sinh khối tế bào với 150ml nước lạnh, vô trùng. Sau đó ly tâm thu sinh khối (1500g, ở 40C trong 5 phút)
- Tiếp tục hòa sinh với 10ml Sorbitol 1M lạnh, dùng pipet trộn đều và chia nhỏ 80µl/ eppendorf.
Các quá trình trên được thực hiện trong đá lạnh, và tế bào P. pastoris khả nạp được sử dụng ngay trong ngày
39
- Tách plasmid pPIC9K mang đoạn gen OmpN từ chủng E.coli DH5α bằng bộ kit tách chiết plasmid của Qiagen
- Cắt plasmid bằng 2 enzyme BglII và SalI (cắt bằng 2 phản ứng cắt riêng biệt). Sau đó tinh sạch và thu nhận plasmid được cắt bằng enzyme BglII và plasmid được cắt bằng SalI
- Trộn đều 80µl tế bào P. pastoris khả nạp với 10µg plasmid đã được cắt bằng enzyme và chuyển tất cả hỗn hợp sang cuvette điện biến nạp (cuvette đã được khử trùng và giữở nhiệt độ lạnh)
- Ủ dịch tế bào trong cuvette ởđá lạnh khoảng 5 phút - Chuyển cuvette có chứa tế bào vào máy điện biến nạp - Tiến hành sốc (shock) điện ở hiệu điện thế 1800V
- Thêm 1ml sorbitol 1M vào cuvette ngay sau khi điện biến nạp
- Chuyển hết hỗn hợp tế bào có trong cuvette sang eppendorf 1.5ml và ủ ở 280C trong 1h.
- Trải dịch tế bào trên đĩa môi trường MD và ủ ở 280C khoảng 3 ngày (hoặc đến khi thấy khuẩn lạc mọc)
- Thu được 2 dòng Pichia Mut+ (cắt bằng SalI) và MutS (cắt bằng BglII)
c. Sàng lọc dòng tế bào nấm men P. pastoris có khả năng biểu hiện ompN cao.
- Chuẩn bịđĩa môi trường YPD bổ sung kháng sinh G418 với nồng độ lần lượt là 0.25 mg/ml, 2mg/ml, 4mg/ml và 6mg/ml.
- Mỗi dòng chọn 20 khuẩn lạc, chấm vào đĩa môi trường (từ nồng độ thấp đến nồng độ cao)
- Chọn những khuẩn lạc có thể mọc được trên đĩa YPD có G418 nồng độ 6mg/ml để tiến hành lên men biểu hiện protein OmpN.
40
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN