ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ VÀ KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ RÔ PHI ĐỎ ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus sp. (Phần chính)

Bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. được báo cáo đầu tiên tại Nhật Bản vào năm 1958 trên loài cá hồi nuôi (Hoshina và ctv., 1958; trích bởi Yanong và Floyd, 2001) . Bệnh có tỉ lệ chết cao, có thể lên tới 100% trong vòng vài ngày phát bệnh. Hiện nay, bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. đã được phát hiện trên nhiều đối tượng nuôi và tại nhiều nơi trên khắp thế giới: Viễn Đông, Hoa Kỳ, Nam Phi, Trung Mỹ, Nhật, Israel, ...

1 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Xác định giới tính phơi động vật mang lại hiệu chăn nuôi, động vật cao sản bò sữa Nhờ xác định giới tính, ta định ni động vật có giới tính mong muốn để giảm chi phí chăn ni, góp phần phục hồi số lồi động vật q gặp khó khăn vấn đề sinh sản có nguy tiệt chủng Chính thế, nhà khoa học ln tìm cách xác định giới tính Cho đến ngày nay, nhiều phương pháp xác định giới tính thực Những phương pháp bao gồm lai chỗ phát huỳnh quang để xác định nhiễm sắc thể (NST) Y, phân tích NST xác định kháng nguyên H - Y có bề mặt tế bào phôi đực tiến hành nhiều Tuy vậy, phương pháp có độ tin cậy khơng cao bị hạn chế lượng mẫu dùng (đòi hỏi dùng lượng mẫu DNA q lớn mà phơi khó cung cấp được) Ngồi phương pháp trên, người ta phát phương pháp PCR (polymerase chain reaction) Đây phương pháp xác định giới tính cách khuếch đại đoạn DNA (deoxyribonucleic acid) đặc trưng cho giới tính đực diện NST Y Phương pháp có độ tin cậy cao nhạy tiến hành với lượng mẫu DNA ban đầu tương đối nhỏ Ở Việt Nam, tiềm phát triển chăn nuôi động vật lớn, gia súc, gia cầm Để phát triển chăn ni, định hướng ni gì, giới tính nào, số lượng quan trọng Việc tiền chọn lọc giới tính giúp cho ta hoạch định nuôi thú cung cấp sữa, thú cung cấp thịt giữ định hướng mà lại giảm thiểu đáng kể tổn thất kinh tế Hiện tại, Việt Nam cố gắng tạo đàn bị có số lượng chất lượng đủ đáp ứng thịt sữa cho người tiêu dùng nước, phần xuất Khi đó, việc nhập phôi đông lạnh tạo hàng loạt phôi phân biệt giới tính rõ ràng kỹ thuật chẩn đốn giới tính đại hai số giải pháp cho vấn đề Vì phơi đơng lạnh phân biệt giới tính trước q đắt, việc tạo phôi động vật nhân tạo hướng giải mang tầm chiến lược kinh tế khoa học Mặc khác, việc tạo phôi động vật cao sản vấn đề đơn giản Việt Nam thời điểm tại, sở nhỏ Do đó, để thiết lập qui trình xác định giới tính phơi gặp khó khăn nguồn mẫu Thế nhưng, khơng thiết lập qui trình xác định giới tính, đến tạo phơi khơng thể phân biệt giới tính Lúc đó, phải nhiều thời gian để tìm qui trình Chính thế, đề tài sử dụng nguồn mẫu cơ, lơng bị để thiết lập qui trình chẩn đốn giới tính Khi tạo phơi bị, lúc dùng qui trình để xác định giới tính phơi tạo Đó ý nghĩa cấp thiết đề tài 1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1.2.1 Mục tiêu Tìm qui trình PCR phù hợp để xác định giới tính giống bị ta Vàng, lai Sind bò sữa Hà Lan dựa khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt giới tính đực 1.2.2 Yêu cầu - Ly trích DNA từ mẫu lơng giống bị (ta Vàng, lai Sind bị sữa Hà Lan) - Xác định chu trình nhiệt cho qui trình PCR thành cơng - Thử nghiệm loại Taq polymerase dùng qui trình PCR - Ứng dụng qui trình PCR tìm để xác định giới tính ba giống bị ta Vàng, lai Sind, sữa Hà Lan PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI QUÁT VỀ NGUỒN MẪU CHIẾT XUẤT DNA 2.1.1 Đặc điểm ngoại hình giống bị Hiện tại, nước ta có nhiều giống bị ni Tuy nhiên, số lượng giống khác (Nguyễn Trọng Tiến ctv, 2001) Chủ yếu giống sau: - Bị ta Vàng: có nguồn gốc nước; lơng có màu vàng, vàng nhạt vàng đậm; nhỏ vóc, suất thấp, trọng lượng khoảng 160 - 220 kg - Bò lai Sind: tạo từ việc lai bò gốc Ấn Độ nhập vào Việt Nam lâu đời với bị nước Bị có lơng màu nâu cánh dán đến đậm, u vai cao, yếm rộng, trọng lượng khoảng 200 - 400 kg Bò thường dùng làm để phối với bò đực tốt từ nước ngồi - Bị sữa Hà Lan: thường dạng bò lai từ bò Holstein Friesian có nguồn gốc Hà Lan với bị nước (lai Sind) Bị có màu đen lẫn đốm trắng, trọng lượng trung bình 200 - 500 kg, khả cho sữa 15 - 20 lít / ngày Ở Việt Nam, bị ni có tỷ lệ đậu thai thấp (60%) Hơn nữa, bị Việt Nam có vóc nhỏ nên khó phối với bị đực ngoại vóc lớn Vì vậy, để có bị cần làm cho chúng lớn vóc lên Đây vấn đề lâu dài khó khăn công tác giống 2.1.2 Đặc điểm nguồn mô chiết xuất DNA 2.1.2.1 Một vài đặc điểm bị Cơ sử dụng q trình ly trích DNA vân Tế bào vân dạng tế bào đa nhân nên lượng DNA ly trích từ nhiều Protein vân chủ yếu actin, myosin myoglobin Trong đó, myoglobin loại protein thuộc nhóm chromoprotein giúp tạo màu đỏ bắp thịt (Nguyễn Phước Nhuận ctv, 2003) Myoglobin cấu tạo từ tiểu đơn vị globin gắn với nhóm heme Dù loại protein phức tạp dễ bị phân cắt proteinase cấu trúc khơng có liên kết disulfide 2.1.2.2 Một vài đặc điểm lơng bị Ở thú hữu nhũ, lông dạng cấu trúc phối hợp với da để tạo bề mặt phủ bên thể Lơng xuất phát từ nang lơng, có nguồn gốc từ lớp bì Xét cấu trúc cắt ngang, lơng gồm có lớp: lớp ngồi gọi lớp sừng, cấu tạo từ tế bào chết; lớp vỏ tạo màu sắc cho lông nhờ sắc tố melanin; lớp tuỷ Xét theo chiều dài, lơng cấu trúc bị keratin hố từ gốc dần lên Càng xa khỏi gốc mức độ keratin hố mạnh, tế bào dần DNA trở thành chuỗi protein phần Phần gốc lơng có chứa nhiều tế bào sống (Frandson ctv, 1969) Theo Nguyễn Phước Nhuận ctv (2003), keratin loại protein cứng thuộc nhóm albuminoid (scleroprotein) có đặc tính khơng tan dung dịch trung tính, hồ tan dung dịch acid lỗng hay kiềm tính Theo Lê Thị Mỹ Phước ctv (2002), keratin có trọng lượng phân tử khoảng 600.000 đơn vị carbon Thường có dạng keratin α-keratin β-keratin α-keratin có cấu trúc vịng với nhiều liên kết cystine Trong β-keratin có cấu trúc phiến xếp nếp Nét đặc biệt keratin hàm lượng cystine cao nên mạch polypeptide có nhiều liên kết ngang disulfide Vì keratin có tính bền vững cao có cấu trúc cấp hai khác Chính lý đó, chúng khó bị phân cắt enzyme proteinase khơng chun biệt Ngồi keratin, melanin loại protein khó bị loại khỏi DNA cần tách chiết Melanin có loại eumelanin (sắc tố nâu đen), phaomelanin (sắc tố nâu đỏ) allomelanin (sắc tố đen) (AIP congress, 2002) Màu sắc lông tùy thuộc vào loại melanin có lớp vỏ lơng Đơi lớp vỏ bị hết melanin làm cho lơng có màu trắng Sự hiểu biết melanin không nhiều Người ta thường đề cập đến melanin dạng polymer sinh học tự nhiên Nhiều đặc tính hoá học melanin chưa biết rõ nên khó cho việc tìm cách tách melanin khỏi dung dịch chứa DNA mẫu Theo trên, lông với cấu trúc đặc trưng chứa nhiều keratin melanin nên tạo nhiều khó khăn việc ly trích tinh DNA 2.2 CƠ SỞ XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH 2.2.1 Lịch sử khám phá chế xác định giới tính tự nhiên động vật Từ xưa, giới tính quan niệm sức nóng tinh dịch lạnh tử cung xác định Dần dần, quan điểm bổ sung thêm yếu tố ảnh hưởng từ môi trường dinh dưỡng, tuổi cha mẹ, thời gian giao phối,… Sau này, cơng trình Mendel (1900) khám phá NST giới tính (Mc Clung, 1902) xác nhận vai trị NST giới tính xác định giới tính Tuy nhiên, số lồi, có ảnh hưởng mơi trường việc xác định giới tính (Phan Kim Ngọc Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000) Năm 1905, Wilson cho cặp NST giới tính tạo nên khác biệt cá thể đực (Phạm Thành Hổ, 2000) Tiếp theo đó, nhiều cơng trình khoa học tiến hành để tìm chế xác định giới tính (trích dẫn Nguyễn Thị Thu Lan, 2002) Năm 1916, Bridges chứng minh ruồi giấm (Drosophila) có giới tính xác định dựa số lượng NST X dù NST Y có diện hay khơng Năm 1923, Painter chứng minh diện NST X Y người mặt tế bào học Năm 1959, Welshons Russeell xác định vai trò thiết yếu NST Y định giới tính phơi động vật hữu nhủ Sau đó, Jacobs phát phôi động vật hữu nhũ phát triển thành đực mang NST Y, Ford Welshons cho phơi thiếu NST Y phát triển thành Đến 1983, Whashburn Eichcher chứng minh q trình biệt hố giới tính cần có tham gia gen NST X, Y nhiều gen khác NST sinh dưỡng Ngày nay, người ta tìm gen nằm NST Y mà sản phẩm chúng điều khiển trực tiếp gián tiếp tồn chất giới tính động vật Những gen gọi chung TDF - testis determining factor (yếu tố xác định tinh hoàn) 2.2.2 Sơ lược NST giới tính Ở động vật hữu nhủ, giới tính xác định theo chế di truyền Trong phần lớn loài, cá thể có NST đồng hợp (2n, XX), cá thể đực có NST dị hợp (2n, XY) Theo Chiarelli ctv (1960), Sasaki Makino (1962), lồi bị, cá thể có số NST đơn bội 60 (trích dẫn Eldridge, 1985) Trong NST động vật hữu nhủ, NST X thường có kích thước lớn NST sinh dưỡng (có kích thước trung bình) Chúng chứa khoảng 5% số gen gen Trong đó, NST Y thường nhỏ NST sinh dưỡng có kích thước nhỏ Người ta ước chừng NST X có khoảng 1000 gen, cịn NST Y có khoảng 330 gen Cả hai loại NST cần cho phát triển hoạt động bình thường quan tạo giao tử (trích dẫn Nguyễn Thị Thu Lan, 2002) Theo Burgoyne (1998), NST X Y có vùng trình tự tương đồng với kích thước khoảng 2600 kb đầu cuối vai ngắn NST, gọi vùng giả NST Pseudo autosomal region (PAR) Trong xác định giới tính, gen nằm vùng PAR NST X Y với gen đặc biệt NST Y nằm vùng trình tự khơng bắt cặp với NST X đóng vai trị quan trọng Sau số gen quan trọng việc xác định giới tính 2.2.2.1 Các gen NST Y - Gen zfy (zinc finger, Y) Năm 1987, Page ctv khám phá gen zfy người Bằng phân tích chuyển vị NST nam XX nữ XY, nhà khoa học tìm thấy đoạn xác định tinh hoàn vùng giả NST NST Y (Yp 11.32) Trong vùng có gen với tính bảo tồn cao gọi zinc finger Y hay zfy mã hoá cho protein gắn kết DNA Gen giúp ngăn ngừa thiếu hụt tinh trùng trình sinh tinh Tương ứng với zfy, NST X có vùng zfx (Xp22.12) liên kết chéo với zfy NST Y Lúc này, người ta nghĩ TDF (trích dẫn Haqq Donahoe, 1998) Tuy nhiên, nghiên cứu tiếp sau cho thấy zfy TDF Người ta phát protein ZFY có biểu tế bào giao tử (đây tế bào khơng cần biệt hố tinh hồn) trình tự bắt nguồn từ NST Y thiếu zfy tìm thấy người đàn ông XX (trích dẫn Haqq Donahoe, 1998) Koopman ctv (1991) khẳng định zfx / zfy không yếu tố biệt hố xác định giới tính chủ yếu động vật hữu nhũ mà chúng số nhóm gen tham gia tích cực vào trình Ngày nay, người ta thường sử dụng zfy thị cho NST Y việc sàng lọc giới tính (trích dẫn Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003) - Gen sry ( sex determining region, Y) Năm 1959, nhà khoa học khám phá NST Y có mang sry người chuột Năm 1966, người ta xác định vị trí sry nằm vai ngắn NST Y Cuối thập niên 80, người ta xác định sry nằm vùng vai ngắn NST Y (Yp11.3) Năm 1990, Sinclair ctv phân lập gen sry từ khu vực (trích dẫn Josso ctv, 2003) Gen sry đóng vai trị chủ đạo cho việc xác định giới tính động vật hữu nhũ người Nhân tố điều khiển biệt hoá tuyến sinh dục phơi thành tinh hồn khơng phải buồng trứng Sau đó, tinh hồn sản xuất hormone sinh dục đực chịu trách nhiệm cho thể đặc tính thứ cấp cá thể đực (trích dẫn Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003) Hình 2.1: Sự phân bố gen NST X Y (Nguồn: Josso ctv, 2003) Cho đến nay, sry xem yếu tố đóng vai trị chủ đạo việc xác định giới tính động vật hữu nhũ người Ở động vật hữu nhũ, phát triển tinh hồn phơi phụ thuộc vào biểu gen xác định giới tính sry Xét mức độ hình thái học, hình thành ống dẫn tinh biệt hoá tế bào Sertoli tế bào Leydig đặc điểm đặc trưng cho thấy biểu gen sry tuyến sinh dục bình thường cá thể có NST dị hợp XY (Parma ctv, 1999; trích dẫn Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003) Xét mức độ phân tử, sry gen thuộc họ HMG box (high mobility group) mã hoá cho họ protein có khả gắn kết mạnh với DNA Chính vậy, sry xem cơng tắc đóng mở di truyền cho chương trình biệt hố giới tính liên quan đến số gen khác (Haqq Donahoe, 1998) Do đó, sry hoạt động dịng tế bào hỗ trợ cho biệt hố giới tính để hướng biệt hoá chúng thành tế bào Sertoli thành tế bào hạt đặc thù buồng trứng Ở người cắt bỏ đoạn sry ORF (open reading frame) trung thể thấy có giảm sút biểu gen sry (ở mào niệu sinh dục) dẫn đến đảo giới (Mc Elreavey ctv, 1992; Capel ctv, 1993; Ma ctv, 1993; Laval ctv, 1995; trích dẫn Haqq Donahoe, 1998) Ngoài chứng trên, người ta xét thấy nhiều đặc điểm mơ học, sinh hố sinh học phân tử chứng minh sry TDF chủ yếu (Haqq Donahoe, 1998; Delbridge Marshall Graves, 1999; Josso ctv, 2003) Ngồi ra, NST Y cịn có chứa số gen amh (anti-mullerian hormone), wt1 (Wilm’s Tumor supressor gene), azf (Azoospermia factor),…là gen có vai trị hỗ trợ cho q trình biệt hố giới tính đực cá thể Ngày nay, nhà khoa học quan tâm nghiên cứu gen để làm rõ chế xác định giới tính 2.2.2.2 Các gen NST X - Nhóm gen sox (SRY - liked HMG box) Đây nhóm gen diện NST X Chúng có 20 thành viên, ký hiệu sox1,…, sox20 Trong gen sox3 sox9 có tương tác mật thiết với gen sry chế xác định giới tính động vật hữu nhũ Ở người, đột biến sox9 dẫn đến chứng rối loạn tạo quan sinh dục sơ khai Theo đó, protein SOX9 biểu thời điểm mà mào niệu sinh dục phát triển để phối hợp với protein SRY việc xác định giới tính Những tế bào Sertoli biểu protein SRY biểu mạnh protein SOX9 (Campel ctv, 1995; Tommerup ctv, 1993; trích dẫn Haqq Donahoe, 1998) Ở người nữ, sox3 ức chế sox9 Do đó, biệt hố giới tính đực khơng xảy Khả có gen sox có chất HMG box nên gắn kết DNA Ở người nam, gen sox3 lại bị ức chế protein SRY nên gen sox9 hoạt động bình thường giúp biệt hố giới tính đực Chính vậy, sry xem tác nhân xác định giới tính gián tiếp Tuy nhiên, bên cạnh có giả thuyết cho sry xác định giới tính trực tiếp Do vậy, việc nằm bàn cãi (Foster Graves, 1994; trích dẫn Delbridge Marshall Graves, 1999) - Gen dax - (Dosage - sensitive sex reversal - adrenal hypoplasia congeneital critical region X chromosome 1: vùng nằm NST X gây giảm bẩm sinh số tế bào tuyến thượng thận nên làm biến đổi giới tính) Gen dax - 1, thành viên nhóm yếu tố phiên mã hormone steroid liên quan đến yếu tố sinh steroid 1, chịu trách nhiệm bệnh AHC (adrenal hypoplasia congenita) Người ta xác định dax - nằm khu vực Xp21.3 - 22.11 mà nhân đơi dẫn đến tượng đảo giới từ nam thành nữ Khu vực gọi DSS (dosage - sensitive sex reversal) (Muscatelli ctv, 1994; Zanaria ctv, 1994; trích dẫn Haqq Donahoe, 1998) Gen dax - tương tác với sry giai đoạn đầu xác định giới tính động vật hữu nhũ Tuy nhiên, nam, gen sry ức chế dax - làm biệt hố giới tính đực xảy Khi biểu dax - vượt qua sry đảo giới xảy Còn nữ, dax - hoạt động yếu tố kháng tinh hoàn (Jimenez Burgos, 1998; trích dẫn Delbridge Marshall Graves, 1999) 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH Cho đến nay, có nhiều phương pháp xác định giới tính động vật Mỗi phương pháp có ưu khuyết điểm riêng Tùy vào mục đích mà ta tận dụng ưu điểm phương pháp để đạt thành công cao Sau số phương pháp xác định giới tính phơi (trích dẫn Van Vliet ctv, 1989) 2.3.1 Kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST Cơ sở phương pháp biểu hoạt động gen NST X việc mã hoá enzyme, làm cho nồng độ enzyme (XX) cao nồng độ enzyme đực (XY) Tuy để cân hoạt động gen, NST X có ức chế để NST X biểu gen cái, ức chế thể giai đoạn định Trước đến giai đoạn đó, nồng độ enzyme loại phơi khác Dựa sở này, Williams ctv (1986), Monk ctv (1988) phân biệt phôi trước chuyển cấy từ chuột siêu nỗn Ở phương pháp Williams ctv, phơi dâu (morula) đến phôi nang (blastocyst) kiểm tra hoạt tính enzyme liên kết NST X (glucose phosphate dehydrogenase - G6PD) cách trực tiếp Còn với phương pháp Monk ctv, tế bào đơn phôi phân tách từ phôi tế bào kiểm tra hoạt tính enzyme hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) liên kết NST X Cả hai phương pháp kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST sinh dưỡng mẫu đối chứng để hạn chế thay đổi biến dưỡng phôi Kết đọc dựa theo màu đậm nhạt (đậm đực, nhạt cái) Phương pháp có số hạn chế Phương pháp Williams ctv có tính độc phơi nhuộm màu trực tiếp lên phơi Phương pháp Monk ctv cải thiện khuyết điểm lại dùng hạn chế phôi dâu nén phôi nang (không tách tế bào phôi đơn) Hạn chế khác giai đoạn bất hoạt NST X để 10 tạo cân biểu gen chưa biết xác nên dẫn đến chẩn đốn sai lầm Cuối cùng, đơi mRNA tạo tích trữ mà chưa biểu protein Đến mRNA biểu thành protein đánh giá Do vậy, hoạt tính enzyme lúc tích trữ hoạt động gen từ trước mà khơng phải hoạt động lúc Vì vậy, kết sai lệch Tuy nhiên, phương pháp giúp xác định tiêu đánh giá sống sót phôi nghiên cứu phương pháp khác 2.3.2 Phản ứng miễn dịch kháng nguyên chuyên biệt giới tính Năm 1971, Golberg ctv báo cáo phương pháp huyết học kháng nguyên H - Y (histocompatibility Y antigen – kháng nguyên Y tương thích mơ) Kháng thể kháng ngun phân lập từ huyết ghép mảnh da đực loại thải mảnh da Phương pháp dựa kháng nguyên H – Y tiến hành qua cách: phương pháp gây độc tế bào phương pháp miễn dịch huỳnh quang Ở phương pháp gây độc tế bào, thấy tế bào phôi bị dung giải cho vào kháng huyết H Y bổ thể (chỉ mức độ đó) phơi đực Phương pháp dễ gây hư hại phôi đực Với phương pháp miễn dịch huỳnh quang, phôi phản ứng với kháng thể H - Y sơ cấp 30 phút Sau lại tiếp tục phản ứng với kháng thể thứ cấp có gắn FITC (fluorescein isothiocyanate) Đánh giá giới tính phơi kính hiển vi huỳnh quang dựa diện đuôi FITC Khuyết điểm phương pháp kháng thể thứ cấp gắn không chuyên biệt (gắn với mảnh vỡ tế bào quanh nỗn hồng chẳng hạn) Bất lợi yếu phương pháp miễn dịch độ xác q thấp nhiều lí Thứ nhất, kháng nguyên H - Y kháng nguyên tương đối yếu kháng thể sinh chuyên biệt cách đầy đủ Kết gây phản ứng chéo kháng thể với kháng nguyên bề mặt tế bào khác Thứ hai, biểu kháng ngun H - Y khơng bị giới hạn độc phôi đực Thứ ba, tính chủ quan người làm thí nghiệm việc phán đốn mức độ huỳnh quang kháng thể Ngày nay, người ta cải tiến dần phương pháp để tăng tính ứng dụng ưu điểm lớn chuyển thành dạng kit để kiểm tra nhanh trước thời điểm chuyển phôi 23 DNA ly trích từ 54 mẫu so sánh với DNA từ 10 mẫu lông độ tinh hàm lượng DNA sau đo OD Bảng 4.2 Tỷ số OD hàm lượng DNA ly trích từ lơng Chỉ tiêu Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg /µl) Tổng số mẫu DNA 1,76 ± 0,03 0,37 ± 0,03 54 DNA lông 1,49 ± 0,1 0,03 ± 0,01 10 Sai biệt thống kê P = 0,001 P = 0,00 Biểu đồ 4.2 So sánh DNA ly trích từ lơng Qua kết bảng 4.2, DNA ly trích từ tinh có hàm lượng cao so với DNA ly trích từ lơng cách có ý nghĩa (p < 0,01) Cơ vân chứa tế bào đa nhân nên lượng DNA ly trích nhiều Hơn nữa, protein dễ bị phân hủy keratin lơng nên DNA ly trích có độ tinh cao DNA từ lơng Tuy nhiên, muốn có lượng DNA tinh này, thường phải giết chết vật lấy mẫu sinh thiết Chính cản trở làm cho việc ly trích DNA từ vật q thêm khó khăn Từ đó, việc tìm qui trình ly trích DNA từ lơng điều cần thiết 4.1.3 Kết ly trích DNA từ gốc lông lông Sau đo OD 10 mẫu DNA lông (5 mẫu gốc lông, mẫu lơng), chúng tơi tính tốn giá trị thống kê (xem bảng 4.3) Bảng 4.3 Tỷ số OD hàm lượng DNA ly trích từ gốc lơng lông Chỉ tiêu Tỷ số OD Gốc lông 1,77 ± 0,07 Ngọn lông 1,22 ± 0,03 Sai biệt thống kê P = 0,001 24 Hàm lượng DNA (µg / µl) Tổng số mẫu 0,03 ± 0,01 0,02 ± 0,01 P = 0,34 Biểu đồ 4.3 So sánh DNA ly trích từ lơng gốc lơng Như vậy, DNA ly trích từ gốc lơng có tỷ số OD trung bình 1,76, tinh so với DNA ly trích từ lơng cách có ý nghĩa (p < 0,01) Xét cấu trúc lông, mức độ keratin hố gốc lơng lông việc tách keratin khỏi dung dịch DNA ly trích từ lơng khó khăn so với gốc lông Kết cho thấy 0,15 g lơng cho khoảng 4,34 µg DNA (200 µl dung dịch DNA với nồng độ 0,02 µg / µl) Trong đó, với khối lượng trên, gốc lơng cho 6,5 µg DNA (200 µl dung dịch DNA với nồng độ 0,03 µg / µl) Tuy vậy, khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê (p > 0,05) Thực ra, phần lớn tế bào lông tế bào chết nên hết DNA, lượng DNA thu thập so với lượng DNA thu thập từ gốc lơng (nơi có nhiều tế bào sống) Tuy nhiên ly trích, chúng tơi dùng q lơng nên khác biệt khơng rõ ràng Như vậy, ly trích DNA từ gốc lơng tốt nhiều so với ly trích từ Tuy nhiên, nhu cầu đa dạng tiến hành thí nghiệm, đơi phải ly trích DNA từ lơng thú sống Do vậy, cần phải cải thiện qui trình ly trích DNA từ lơng (sử dụng loại enzyme phân cắt keratin, tạo điều kiện hoạt động cho enzyme tăng lượng lơng cần ly trích) 4.2 KẾT QUẢ PCR XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH 4.2.1 Kết xây dựng qui trình PCR 4.2.1.1 So sánh hai chu trình nhiệt Sau tiến hành xác định giới tính giống bị ta Vàng hai chu trình nhiệt khác nhau, nhận kết bảng 4.4 25 Bảng 4.4 Tỷ lệ thành công hai chu trình nhiệt Chu trình nhiệt I II Sai biệt thống kê Số mẫu thực Số mẫu thành công P = 0,002 Tỷ lệ thành công (%) 100 Kết xác định giới tính giống ta Vàng Taq ABgene 1,5 UI chu trình nhiệt II thành cơng nhiều so với chu trình nhiệt I (p < 0,01) Sự khác biệt chủ yếu chu trình nhiệt II so với chu trình nhiệt I tăng thời gian giai đoạn lên phút tất bước (biến tính, ủ bắt cặp kéo dài) Theo Sambrook Russell (2001), thời gian bước giai đoạn chạy chu kỳ ảnh hưởng định đến suất sản phẩm PCR Nếu thời gian biến tính khơng đủ lâu để cắt đứt hồn tồn liên kết hidro mạch đơi giai đoạn bắt cặp không đạt hiệu cao Thời gian kéo dài chuỗi gây kết khơng chun biệt Theo lý thuyết, tốc độ kéo dài chuỗi Taq polymerase 2000 nucleotide / phút Tuy nhiên, thực tế, người ta thường xem loại Taq kéo dài 1000 nucleotide vịng phút Theo chu trình Alves ctv (2003), thời gian bước giai đoạn 45 giây Nhóm tác giả xác định giới tính xác 100% tiến hành với chu trình nhiệt Nhưng thí nghiệm với chu trình họ, chúng tơi hồn tồn khơng thu kết mong muốn (chỉ band chuyên biệt NST X) Nhóm tác giả sử dụng hoá chất từ hãng Invitrogene Life Technologies hố chất dùng thử nghiệm có nguồn gốc từ hãng ABgene, IDT Có thể lý mà có khác hai qui trình 26 I: chu trình nhiệt I; II: chu trình nhiệt II Hình 4.1 Sản phẩm PCR từ hai chu trình nhiệt 4.2.1.2 Thử nghiệm ba loại Taq Quá trình thử nghiệm ba loại Taq ba hãng sản xuất Promega, Bio-rad ABgene với chu trình nhiệt II xác định giới tính bị ta Vàng cho kết bảng 4.5 Bảng 4.5 Tỷ lệ thành công PCR với ba loại Taq Loại Taq Promega Bio-rad ABgene Sai biệt thống kê Số mẫu thực Số mẫu thành công P < 0,001 Tỷ lệ thành công (%) 100 100 Kết từ bảng 4.5 cho thấy sử dụng Taq từ Bio-rad ABgene nồng độ 1,5 UI phản ứng PCR cho hiệu cao rõ rệt so với Taq Promega nồng độ 1,5 UI (100% so với 0%) Trước định chọn nồng độ 1,5 UI phản ứng, thử nghiệm nhiều nồng độ khác loại Taq xét thấy nồng độ 1,5 UI, ba loại Taq hoạt động tốt nồng độ khác Điểm khác lớn ba loại Taq việc sử dụng Tris - HCl phản ứng Theo Alves ctv (2003), buffer PCR cần 20 mM Tris - HCl phản ứng xác định giới tính bị Thực tế, buffer PCR Bio-rad ABgene đáp ứng điều buffer Promega có 10 mM Tris - HCl Do đó, chúng tơi phải bổ sung thêm 27 Tris - HCl (pH 8,3) để đạt nồng độ Tris - HCl buffer PCR 20 mM Nhưng bổ sung khơng mang lại hiệu Ngồi ra, loại Taq sản xuất hãng theo qui cách khác ảnh hưởng đến kết PCR Hình 4.2 Sản phẩm PCR từ ba loại Taq Như vậy, ta sử dụng hai loại Taq hãng Bio-rad ABgene để tiến hành phản ứng Tuy nhiên, Taq Bio-rad (3.773.783 VNĐ / 250 UI) so sánh giá thành với Taq ABgene (1.798.381 VNĐ / 250 UI) đắt gấp 2,5 lần Chính vậy, định chọn Taq ABgene để tiến hành xác định giới tính sau 28 4.2.2 Áp dụng qui trình PCR 4.2.2.1 Xác định giới tính ba giống bị với DNA từ Qui trình PCR với Taq ABgene 1,5 UI theo chu trình nhiệt II sử dụng để xác định giới tính ba giống bò ta Vàng, lai Sind sữa Hà Lan (DNA cơ) Bảng 4.6 Kết áp dụng PCR lên xác định giới tính ba giống bị Giống Ta Vàng Lai Sind Sữa Hà Lan Số mẫu tiến hành 13 10 Số mẫu thành công 13 10 Tỷ lệ thành công (%) 100 100 100 Kết từ bảng 4.6 cho thấy qui trình PCR áp dụng thành cơng khơng có khác biệt đáng kể xác định giới tính giống bò TV: ta Vàng; LS: lai Sind; HL: sữa Hà Lan Hình 4.3 Sản phẩm PCR chẩn đốn giới tính ba giống bò Theo Alves ctv (2003), áp dụng qui trình chẩn đốn giới tính PCR lên hai nhóm giống Bos taurus (Holstein, Jersey Simmental) Bos indicus (Guzera, Nelore Tebapua) kết thành công 100% Như vậy, kết phù hợp với kết nhóm tác giả 4.2.2.2 Kết PCR với DNA từ phơi khô theo hai mức độ 29 DNA từ làm khô theo mức độ I so với theo mức độ II khơng khác biệt độ tinh hàm lượng DNA (xem bảng 4.1) Tuy nhiên, sau tiến hành PCR, tỷ lệ thành công lại khác biệt lớn hai mức độ làm khô (bảng 4.7) Bảng 4.7 Hiệu PCR mẫu DNA làm khô theo hai mức độ Mức độ I II Sai biệt thống kê Số mẫu tiến hành 11 10 Số mẫu thành công 11 P = 0,001 Tỷ lệ thành công (%) 100 20 Như vậy, tỷ lệ thành công tiến hành PCR mẫu DNA làm khô mức độ I (100%) cao so với mẫu DNA làm khơ mức độ II (20%) cách có ý nghĩa (p < 0,01) V S Hình 4.4 Sản phẩm PCR từ hai mức độ làm khô DNA bò đực Theo Svaren ctv (1987), DNA làm khơ q đáng bị biến tính lớp vỏ ổn định phân tử nước gắn kết (trích dẫn Sambrook Russell, 2001) Ở đây, đa số mẫu làm khô đến mức độ II có biểu giảm sút độ ướt nghiêm trọng, vệt tủa thường bám chặt lên thành eppendorf mờ, nhìn khơng xác định vị trí vệt tủa Có thể lý mà DNA bị hỏng nhiều không đủ làm mẫu cho phản ứng nhân (kết band mờ, band chuyên biệt NST X không cho band nào) Tuy nhiên, để khẳng định điều này, 30 cần phải có nhiều nghiên cứu sâu tính chất DNA thực số mẫu nhiều 4.2.2.3 So sánh kết PCR DNA lông Sau tiến hành 10 phản ứng khuếch đại DNA mẫu lông ba giống, có mẫu thành cơng, mẫu cịn lại khơng phân biệt giới tính xác Tỷ lệ thành cơng mẫu lơng 20%, so với mẫu (100%) cách có ý nghĩa (p < 0,001) Trong đó, hai mẫu lông thành công mẫu lông gốc (đạt 40%), mẫu lơng khơng thành cơng (0%) Hình 4.5 Kết PCR từ lông gốc lông Theo Sambrook Russell (2001), độ tinh DNA ảnh hưởng lớn đến hiệu PCR DNA có tỷ số OD từ 1,8 – 2,0 xem (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002) Ở đây, mẫu lông có tỷ số OD trung bình 1,49 (xem bảng 4.2) Tỷ số thấp chứng tỏ lượng protein dịch DNA nhiều (nhất keratin) nên ức chế phản ứng khuếch đại DNA Mẫu lơng cịn có tỷ số OD trung bình thấp mẫu lơng gốc nhiều (xem bảng 4.3) nên kết PCR mẫu lông gốc không thành công Một yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến hiệu PCR nồng độ DNA mẫu chất ức chế khác (Sambrook Russell, 2001) Thông thường, DNA mẫu động vật hữu nhũ dùng khoảng 1µg phản ứng có xu hướng giảm xuống 31 cịn 0,1µg (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002) Ở đây, sử dụng 0,15 µg DNA mẫu phản ứng Ở mẫu cơ, nồng độ DNA ly trích cao (369,55 ng / µl) nên thường sử dụng < 1µl DNA mẫu thực phản ứng Trong đó, mẫu lơng có nồng độ DNA thấp (27,1 ng / µl) (xem bảng 4.2), nên chúng tơi phải sử dụng µl - 15 µl đủ lượng DNA mẫu cho phản ứng nhân Khi đó, lượng EDTA có TE 1X (buffer cho DNA mẫu) đưa vào phản ứng tăng theo Tuy nhiên, lượng EDTA diện nhiều phản ứng khuếch đại DNA ức chế phản ứng cách bẫy bắt Mg2+ - coenzyme Taq polymerase làm lập Mg2+ với Taq Chính vậy, PCR mẫu lơng có hiệu thấp, lông Một kinh nghiệm rút từ thất bại mẫu lông pha loãng DNA mẫu sau tủa cồn tuyệt đối lạnh phải pha với lượng nhỏ TE 1X để có dung dịch DNA có hàm lượng > 100 ng / µl 32 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - DNA ly trích từ tinh đạt suất cao DNA ly trích từ lơng - DNA ly trích từ gốc lơng có độ tinh cao DNA ly trích từ lơng - Qui trình PCR với chu trình nhiệt I (tăng thời gian phản ứng) Taq ABgene 1,5 UI xác định giới tính thành công ba giống ta Vàng, lai Sind sữa Hà Lan với tỷ lệ thành công 100% - Mức độ làm khô DNA giai đoạn thu hồi DNA ảnh hưởng đến hiệu PCR xác định giới tính - Sử dụng DNA ly trích từ lơng PCR xác định giới tính cho hiệu thấp so với sử dụng DNA ly trích từ 5.2 ĐỀ NGHỊ - Thiết lập qui trình ly trích DNA từ lông (nhất lông) để lượng DNA lớn tinh - Theo dõi thời gian biểu khơ DNA q trình thu hồi DNA sau ly trích - Áp dụng qui trình PCR xác định giới tính lên phơi bị ba giống ta Vàng, lai Sind, sữa Hà Lan 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003 Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh in vitro dùng pcr xác định giới tính phơi heo Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002 Sinh Học Phân Tử (Khái Niệm - Phương Pháp ứng Dụng) Tái lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh Tr 122 – tr 129 tr 190 - tr 197 Phạm Thành Hổ, 2000 Sinh Học Đại Cương NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh Tr 274 Nguyễn Thị Thu Lan, 2002 Thiết lập qui trình xác định giới tính heo (sus scrofa domestica) kỹ thuật pcr (polymerase chain reaction) Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Phan Kim Ngọc Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000 Sinh Học Của Sự Sinh Sản Tái lần thứ nhất, NXB Giáo Dục Tr 50 – tr 64 Nguyễn Phước Nhuận, Phan Thế Đồng, Lê Thị Phương Hồng, Đỗ Hiếu Liêm, Đinh Ngọc Loan, 2003 Giáo Trình Sinh Hóa Học (Phần I) NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh Tr 68 – tr 73 Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Lê Văn Bình, Bùi Thị Hồng Hạnh, 2002 Hóa Học Phục Vụ Cơng Nghệ Sinh Học II Giáo trình thực tập Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh Tr 36 Lê Thị Thu Phương, 2004 Phát gen halothane, gen thụ thể estrogen mối liên quan hai gen đến suất sinh sản heo nái Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Trọng Tiến, Nguyễn Xuân Trạch, Mai Thị Thơm, Lê Văn Ban, 2001 Giáo Trình Chăn Ni Trâu Bị NXB Nơng Nghiệp Tr 23 – tr 30 *Tài liệu nước 10 AIP Congress, 2002 Semiconducting photoactive biopolymers AIP Congress, Queensland University, Australia 20 pages 11 Alves A C B., Hossepian de Lima M F V., Teixera M C., Moreira-Filho A C., 2003 Use of primers derived from a new sequence of the bovine Y chromosome for sexing Bos taurus and Bos indicus embryos Theriogenology 59: 1415-1419 34 12 Bondioli K R., et al., 1989 The use of male – specific chromosomal DNA fragments to determine the sex of bovine preimplantation embryos Theriogenology 31: 95-104 13 Bredbacka P., et al., 1994 Survival of biopsied and sexed bovine demi embryos Theriogenology 41: 1023-1031 14 Burgoyne, 1998 The mammalian Y chromosome: a new perspective BioEssay 20: 363-366 15 Chen C M., Hu C L., Wang C H., Hung C M., Wu H K., Choo K B., and Cheng W T K., 1999 Gender determination in single bovine blastomere by polymerase chain reaction amplification of sex - specific polymorphic fragments in the Amelogenin gene Molecular reproduction and development 54: 209-214 16 Chen C Y., Huang L S., Cheng J B., Ding N S., Zhou L L., and Xiao H X., 2004 Establishing and optimizing the system for sex determination of bovine preimplantation embryos China Journal of Agricultural Biotechnology 1(1): 13-16 17 Delbrigde L M and Marshall Graves A J., 1999 Mammalian Y chromosome evolution and the male – specific functions of Y chromosome – borne genes Journal of Reproduction and Fertility 4: 101-109 18 Eldridge E F., 1985 Cytogenetics of livestock Avi publishing company, Wesport, Connecticut, USA p.115 – p 122 19 Frandson D R., 1969 Anatomy and physiology of farm animals Lea and Febiger, Philadelphia, USA Chapter 28, p 386 – p 389 20 Haqq M C and Donahoe K P., 1998 Regulation of sex dimorphism in Mammals Physiol Rev 78: 1-33 21 Josso N., Rey R and Gonzalès J., 2003 Sexual differentiation Ho Chi Minh city, Viet Nam, March 2005 22 Kitiyanant Y., Saikhun J., Siriaroonrat B., and Pavasuthipaisit K., 2000 Sex determination by polymerase chain reaction and karyotyping of bovine embryos at first cleavage in vitro Science Asia 26: 9-13 23 Page D C., Mosher R., Simpson E., Fisher E M C., Mardon G., Pollack J., Mc Gillivray B., De la chapelle A., and Brown L G., 1987 The sex determing region of the human Y chromosome encodes a finger protein Cell 36: 1091-1104 24 Pomp D., Good A B., Geisert D R., Corbin J C., and Conley J A., 1995 Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos J Anim., Sci 73: 1408- 1415 35 25 Sambrook Joseph and Russell W David, 2001 Molecular cloning (A laboratory manual) 3rd edition, Cold Spring Harbor laboratory press, New York, USA Vol.2: p 8.23, Vol.3: p A8.13 26 Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G I., 2000 Full flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the GOOD assay Nucleic Acids Research Vol.28, No.23 27 Schoder A., Miller R J., Thomsen D P., Roschlau K., Avery B., poulsen H P., Schmitt M., and Swerin M., 1990 Sex determination of bovine embryos using the polymerase chain reaction Animal Biotechnology 1(2): 121-133 28 Takara Bio Inc CycleavePCRTM Bovine Sexing Kit Ho Chi Minh city, Viet Nam, June 2005 29 Van Vliet A R., Gibbins V M A., and Walton S J., 1989 Livestock embryo sexing: a review of current methods, with emphasis on Y- Specific DNA probes Theriogenology 32(3): 421-438 36 PHỤ LỤC * Hoá chất dùng đề tài - Hoá chất ly trích DNA + Đệm ly trích lông (chỉnh pH đến 8) Tris - HCl 50 mM NaCl 20 mM EDTA (Ethylene diamine tetra - acetic acid) SDS (Sodium dodecyl sulfate) mM 1% + Proteinase K 20 mg / ml + Sodium acetate M; 0,2 M + Phenol: chloroform: isoamyl alcohol + Ethanol 25:24:1 100%; 70% + TE 1X (pH = 8) Tris - HCl 10 mM Na2EDTA mM - Hoá chất PCR PCR buffer MgCl2 Taq polymerase dNTP 1X 1,5 mM tùy phản ứng 200 μM / loại H2O cất lần, khử ion, vô trùng, chiếu tia UV 15 phút, pH 6,8 – 7,0 - Hoá chất điện di sản phẩm PCR + Agarose 1,5% + TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH = 8,3) Tris - base 44,5 mM Acid boric 44,5 mM Na2EDTA 1,5 mM + Loading dye X Bromophenol blue Sucrose 0,25 % 40 % 37 TE X vừa đủ 100 % + Ladder TAE 0,5 X (Tris acetate EDTA) 65 % Ladder 100 bp gốc 15 % Loading dye X 20 % + Ethidium bromide * Dụng cụ dùng đề tài - Pipetman loại 100 - 1000 μl; 10 - 100 μl; 0,5 - 10 μl - Đầu tip tương ứng với loại pipetman - Eppendorf loại 0,2 ml; 1,5 ml - Các chai lọ đựng hoá chất, vật mẫu - Kéo, kẹp, chày, cối, bao nilông… * Thiết bị sử dụng đề tài - Máy vortex (IKA Works) - Máy ly tâm (Sigma, Hettich) - Máy PCR (Eppendorf) - Bộ điện di (Biorad) - Máy chụp gel (Biorad) - Tủ ấm (Memmert) - Tủ trữ mẫu, hoá chất (Reetech, Brandt, Sanyo) - Microwave (Electrolux) - Cân (explorer- OHAUS) - Tủ sấy (Jencons - PLS) - Water bath (Memmert) - Máy cất nước, khử ion (Barnstead) - Autoclave (Tommy) - Quang phổ kế (Hewlett Packard) - Máy đo pH 30 μl / 300 ml TBE 0,5 X ... Phản ứng miễn dịch kháng nguyên chuyên biệt giới tính Năm 1971, Golberg ctv báo cáo phương pháp huyết học kháng nguyên H - Y (histocompatibility Y antigen – kháng nguyên Y tương thích mơ) Kháng. .. bào phôi bị dung giải cho vào kháng huyết H Y bổ thể (chỉ mức độ đó) phơi đực Phương pháp dễ gây hư hại phôi đực Với phương pháp miễn dịch huỳnh quang, phôi phản ứng với kháng thể H - Y sơ cấp 30... ta Vàng: có nguồn gốc nước; lơng có màu vàng, vàng nhạt vàng đậm; nhỏ vóc, suất thấp, trọng lượng khoảng 160 - 220 kg - Bò lai Sind: tạo từ vi? ??c lai bò gốc Ấn Độ nhập vào Vi? ??t Nam lâu đời với