ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU (DIAZAN 10H) LÊN SỨC ĐỀ KHÁNG CỦA CÁ RÔ PHI ĐỎ ĐỐI VỚI STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

Cùng một nồng độ thuốc 30,2 ppm, trong những khoảng thời gian khác nhau thì không ảnh hưởng đến sức đề kháng của cá thí nghiệm.. Rất có thể với một nồng độ thuốc nhất định, một khoảng th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU (DIAZAN 10H) LÊN SỨC ĐỀ KHÁNG CỦA CÁ RÔ PHI ĐỎ ĐỐI VỚI

STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

Sinh viên thực hiện: HỒ THÀNH TÂM Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Chuyên ngành: NGƯ Y

Niên khóa: 2005 – 2009

ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU (DIAZAN 10H) LÊN SỨC ĐỀ KHÁNG CỦA CÁ RÔ PHI ĐỎ ĐỐI VỚI

Giáo viên hướng dẫn:

NGUYỄN VĂN TƯ

Tháng 09 năm 2009

CẢM TẠ

Chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý Nhà Trường, Quý Khoa, Quý Thầy Cô đã dìu dắt chúng tôi trong suốt khóa học và tạo điều kiện cho chúng tôi hoàn thành tốt khóa luận

Đặc biệt, tôi xin cảm ơn Thầy Nguyễn Văn Tư đã cho phép và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng gửi lời cảm ơn đến Thầy Nguyễn Hữu Thịnh, Thầy Ngô Văn Ngọc, Thầy Nguyễn Hoàng Nam Kha, Cô Lưu Thị Thanh Trúc, Cô Hồ Thị Trường Thy đã tạo điều kiện cho tôi và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu trong khóa luận này

Cảm ơn các thầy, các anh và các bạn ở Trại thực nghiệm thủy sản đã tận tình hỗ trợ chúng tôi trong thời gian qua

Cảm ơn gia đình và các bạn lớp DH05NY đã là nguồn động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập để có kết quả như ngày hôm nay

Chân thành cảm ơn!

Xác định LC50-48h của Diazan 10H đối với cá thí nghiệm

Sử dụng liều ½ LC50-48h để gây nhiễm cho cá trong những khoảng thời gian khác nhau (12, 24, 48 giờ) Sau đó, gây bệnh thực nghiệm cho cá đã nhiễm thuốc với vi

khuẩn Streptococcus agalactiae

Sau thời gian thực hiện đề tài chúng tôi thu được kết quả sau:

LC50-48h của Diazan 10H đối với cá thí nghiệm là 59 ppm (5,9 ppm hoạt chất) Cùng một nồng độ thuốc (30,2 ppm), trong những khoảng thời gian khác nhau thì không ảnh hưởng đến sức đề kháng của cá thí nghiệm

Rất có thể với một nồng độ thuốc nhất định, một khoảng thời gian cảm nhiễm xác

định sẽ làm tăng khả năng kháng bệnh của cá thí nghiệm với Streptococcus agalactiae

Và có thể vấn đề này sẽ được nghiên cứu sâu hơn trong những đề tài tiếp theo

ABTRACT

The problem of residue of pesticides in environment become more serious, to assess impacts of the pesticide residue an cultured fish, we carried out a study on:

“Effects of diazan 10H to the resistance of red tilapia to Streptococcus agalactiae”

The size of studied fish was from 6 to 8 gram The pesticide was diazan 10H with active diazinon

The first trial was to define LC50-48h of dizan 10H to the fish The second trial was

to treat the fish with ½ LC50-48h diazan 10H for 12, 24, 48 hours Then, the treated fish

was challenged with Streptococcus agalactiae bacteria

Results of the study were following:

The LC50-48h of diazan 10H of the fish was 50 ppm (5,9 ppm diazinon)

At the same concentration of the pesticide (30,2 ppm), but at different treated periods the lethal rates of the fish were not statistically different

With the pesticide concentration determined, it might be able to increase the

resistance of red tilapia to Streptococcus agalactiae This needs to be examined further

in the future

MỤC LỤC

Trang tựa i

Cảm tạ ii

Tóm tắt iii

Abtract iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng và sơ đồ x

Danh sách các đồ thị xi

Danh sách các hình xii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đặc điểm sinh học cá rô phi đỏ 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.2.1 Phân bố 3

2.1.2.2 Nguồn gốc 4

2.1.3 Đặc điểm hình thái 4

2.1.4 Đặc điểm sinh thái 4

2.1.4.1 Nhiệt độ 5

2.1.4.2 pH 5

2.1.4.3 Ôxy hòa tan (DO) 5

2.1.4.4 Độ mặn 5

2.1.4.5 Ammonia (NH3-N) và nitrite (NO2-N) 5

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng 6

2.1.6 Đặc điểm sinh sản 6

2.1.6.1 Chu kỳ sinh sản 6

2.1.6.2 Phân biêt đực cái 6

2.1.6.3 Sinh sản 7

2.1.7 Đặc điểm dinh dưỡng 8

2.1.8 Tính phân đàn 8

2.2 Liên cầu khuẩn Streptococcus agalactiae 9

2.2.1 Đặc điểm phân loại 9

2.2.2 Dịch tễ của bệnh 10

2.2.3 Triệu chứng bệnh tích 10

2.2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh 11

2.2.5 Phương pháp phòng và trị bệnh 12

2.3 Sơ lược về thuốc trừ sâu sử dụng trong nghiên cứu 12

2.3.1 Lược sử về nhóm thuốc gốc lân hữu cơ 12

2.3.2 Các dạng chế phẩm và cấu tạo hóa học tổng quát 12

2.3.2.1 Các dạng chế phẩm 12

2.3.2.2 Cấu tạo hóa học 13

2.3.3 Vấn đề sử dụng thuốc 13

2.3.4 Ảnh hưởng của thuốc lên cơ thể sinh vật 14

2.3.4.1 Cơ chế tác động 14

2.3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến độc tính của TBVTV 15

2.3.4.3 Tính mẫn cảm và tính chống chịu của sinh vật đối với tác động của thuốc 15

2.3.5 Sơ lược về hoạt chất diazinon 16

2.3.6 Thông tin về loại thuốc sử dụng trong nghiên cứu (Diazan 10H) 17

2.4 Sơ lược về LD50 và LC50 17

2.5 Sơ lược về bộ test PastorexTM Strep của hãng Biorad 19

2.5.1 Nguyên tắc 19

2.5.2 Các bước thực hiện 20

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.2 Vật liệu, trang thiết bị và hóa chất 22

3.2.4 Hóa chất và môi trường 22

3.3 Phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 23

3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Xác định LC50-48h 23

3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng cảm nhiễm Streptococcus agalactiae của cá thí nghiệm sau khi ngâm thuốc trừ sâu ở các khoảng thời gian khác nhau 25

3.3.2 Một số phương pháp khác được sử dụng trong nghiên cứu 27

3.3.2.1 Phương pháp kiểm tra dấu hiệu bên ngoài và mổ khám bệnh tích 27

3.3.2.2 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm (phương pháp ngâm) 28

3.3.2.3 Phương pháp phân lập, định danh sơ bộ và giữ giống vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm 30

3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 31

3.4.1 Phương pháp xác định LC50-48h 31

3.4.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Diazan 10H lên sức đề kháng của cá rô phi đỏ đối với Streptococcus agalactiae 31

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Một số chỉ tiêu chất lượng nước trong quá trình thí nghiệm 32

4.1.1 Nhiệt độ 32

4.1.2 pH 34

4.1.3 Ôxy hòa tan (DO) 34

4.1.4 Ammonia 35

4.2 Thí nghiệm 1: Xác định LC50-48h 35

4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Diazan lên sức đề kháng của cá rô phi đỏ đối với liên cầu khuẩn Streptococcus agalactiae 40

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 50

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACh: Acetylcholine

AChE: Acetylcholinesterase

BHIA: Brain Heart Infusion Agar

BHIB: Brain Heart Infusion Broth

CĐCN: Cường độ cảm nhiễm

GIFT: Genetically Improved Farmed Tilapia

LC50: Median Lethal Concentration

LC50-48h: Median Lethal Concentration in 48h

LD50: Median Lethal Dose

mg ai/kg: mg active ingredient/kg

PCR: Polymerase Chain Reaction

TBVTV: Thuốc bảo vệ thực vật

TEPP: Tetraethyl Pyrophosphate

THBA: Todd Hewitt Broth Agar

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 2.1: Phân biệt giới tính cá rô phi đỏ 7

Sơ đồ 3.1: Trật tự bố trí thí nghiệm xác định LC50-48h 24

Sơ đồ 3.2: Trật tự bố trí thí nghiệm 2 26

Sơ đồ 3.3: Các bước gây bệnh thực nghiệm 28

Sơ đồ 3.4: Các bước đếm vi khuẩn 29

Sơ đồ 3.5: Các bước định danh vi khuẩn 31

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1: Biến động của nhiệt độ nước trong quá trình thí nghiệm 1 33

Đồ thị 4.2: Biến động của nhiệt độ nước trong quá trình thí nghiệm 2 (phần 1) 33

Đồ thị 4.3: Biến động của nhiệt độ nước trong quá trình thí nghiệm 2 (phần 2) 34

Đồ thị 4.4: Tỷ lệ cá chết dồn theo thời gian ở thí nghiệm thăm dò, thí nghiệm 1 36

Đồ thị 4.5: Tỷ lệ cá chết dồn theo thời gian ở thí nghiệm 1 37

Đồ thị 4.6: Mối tương quan giữa nồng độ và tỷ lệ chết của cá lồng 10 38

Đồ thị 4.7: Mối tương quan giữa tỷ lệ chết dồn (y) và nồng độ thuốc trừ sâu 39

Đồ thị 4.8: Tỷ lệ chết dồn theo từng nghiệm thức ở thí nghiệm 2 41

Đồ thị 4.9: Tỷ lệ chết dồn theo thời gian của từng nghiệm ở thí nghiệm 2 41

Đồ thị 4.10: Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm 42

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Hình thái ngoài cá rô phi đỏ 3

Hình 2.2: Thức ăn tự nhiên của cá rô phi 8

Hình 2.3: Hình dạng khuẩn lạc sau một ngày cấy thuần 10

Hình 2.4: Sự tương tác giữa AChE và ACh tại chỗ nối synapse hoặc cơ thần kinh 15

Hình 2.5: Sản phẩm Diazan 10H 17

Hình 2.6: Các vật liệu chính trong bộ test Pastorex Strep 19

Hình 2.7: Phản ứng dương tính (C), và âm tính (D) 20

Hình 2.8: Các ống nghiệm sử dụng 20

Hình 2.9: Tấm ngưng kết trong bộ test Pastorex Strep 21

Hình 2.10: Các que khuấy vô trùng 21

Hình 3.1: Cân điện tử 23

Hình 3.2: Bố trí thí nghiệm xác định LC50-48h 25

Hình 3.3: Ngâm thuốc trừ sâu (trong túi nilon) 26

Hình 3.4: Cảm nhiễm vi khuẩn bằng phương pháp ngâm (trong các xô nhựa) 27

Hình 3.5: Mổ xoang bụng 28

Hình 3.6: Mổ sọ não 28

Hình 3.7: Các thao tác tăng sinh vi khuẩn 29

Hình 3.8: Thao tác cấy trang vi khuẩn 30

Hình 4.1: Ảnh chụp, bảng kết quả đo NH4 + /NH3 35

Hình 4.2: Các biểu hiện của cá nhiễm thuốc trừ sâu 39

Hình 4.3: Những biểu hiện bên trong và bên ngoài của cá bệnh 42

Hình 4.4: Khuẩn lạc vi khuẩn trước ánh sáng 43

Hình 4.5: Kết quả định danh bằng Pastorex Strep 43

Hình 4.6: Mang cá nhiễm thuốc trừ sâu chlorpyrifos 45

Hình 4.7: Gan cá nhiễm thuốc trừ sâu chlorpyrifos 45 Hình phụ lục 1: Thao tác nhuộm gram và kết quả

Trong vài chục năm trở lại đây, người ta đã tìm thấy một dòng cá rô phi mới – là

con lai giữa các loài cá rô phi thuộc giống Oreochromis; dựa vào màu sắc và xuất xứ

mà người ta gọi dòng cá mới này là cá rô phi đỏ

Ở Việt Nam, cá rô phi đỏ còn được mọi người biết đến với tên “cá điêu hồng” vào năm 1997 Với tên thương mại mới, màu sắc hấp dẫn, tăng trưởng nhanh, tỷ lệ phi lê lớn; nhu cầu về cá rô phi đỏ gia tăng đáng kể Hơn thế nữa, cùng với cá rô phi dòng GIFT, cá rô phi đỏ đã được Bộ Thủy Sản (cũ) chọn làm đối tượng nuôi trong chương trình nuôi cá rô phi xuất khẩu

Tiềm năng phát triển nghề nuôi cá rô phi đỏ là rất lớn Nhưng không thể không kể đến các vấn đề có thể gây ảnh hưởng đến tiềm năng đó như: chính sách phát triển của Nhà nước, quản lý môi trường, phòng ngừa dịch bệnh,… Trong đó, quản lý môi trường nước là một công việc hết sức cần thiết; và vấn đề chúng tôi đang muốn nhắc đến chính là dư lượng thuốc trừ sâu có trong môi trường nước

Ngày nay, việc sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật trong nông nghiệp đã đem lại những vụ mùa bội thu cho các hộ nông dân, phát triển kinh tế hộ gia đình Bên cạnh

đó, việc sử dụng tràn lan, không đúng cách, không đúng liều lượng các loại thuốc này,

đã góp phần gia tăng dư lượng thuốc trong đất, nước, không khí,… Mặt khác, sau

có ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và bùng phát dịch bệnh của các loài thủy sản trong khu vực đã nhiễm thuốc, đặc biệt là cá rô phi đỏ Được sự phân công và hỗ trợ của ban chủ nhiệm khoa, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu

Diazan 10H lên sức đề kháng của cá rô phi đỏ đối với Streptococcus agalactiae”

1.2 Mục tiêu đề tài

- Xác định LC50-48h của thuốc trừ sâu Diazan 10H đối với cá thí nghiệm

- Xác định khả năng cảm nhiễm Streptococcus agalactiae của cá thí nghiệm sau

khi ngâm thuốc trừ sâu ở các khoảng thời gian khác nhau

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học cá rô phi đỏ

Loài: Oreochromis spp (Trawavas, 1982)

Tên tiếng Anh: Red tilapia

Tên tiếng Việt: Cá rô phi đỏ, cá điêu hồng

Hình 2.1: Hình thái ngoài cá rô phi đỏ

Hiện nay, nước ta có 2 loài cá rô phi được nuôi phổ biến là:

- Cá rô phi đen: Oreochromis mossambicus được du nhập vào năm 1953 từ Thái

Giống Oreochromis phân bố rộng rãi ở phía đông Châu Phi và thường xuyên xuất

hiện trong các ao hồ Rô phi đã được đưa vào Kenya năm 1924 và hiện nay nó được nuôi khắp nơi trên thế giới Ở Châu Á, cá được nuôi phổ biến tại nhiều nước như Thái Lan, Philippine, Indonesia,Việt Nam

2.1.2.2 Nguồn gốc

Theo Popma và Masser (1999), cá rô phi đỏ là con lai giữa nhiều loài cá rô phi, là kết quả của đột biến gen trong những phép lai trên Có 3 dòng nguyên gốc đều mang

tên Oreochromis:

Dòng cá rô phi đỏ đầu tiên được sản xuất ở Đài Loan vào cuối năm 1960 là con lai

giữa cá cái O mossambicus và cá đực O niloticus, được gọi là cá rô phi đỏ Đài Loan Dòng thứ 2 được phát triển ở Florida vào những năm 1970 lai tạo giữa cá cái O

zanzibar và cá đực O mossambicus màu đỏ vàng

Dòng thứ 3 được phát triển ở Israel do lai tạo giữa cá O niloticus và một loài cá rô phi khác thuộc giống Oreochromis

Dòng cá này được nhập vào nước ta năm 1985 (Phương Thanh, 2009) từ các nước: Đài Loan, Thái Lan, Singapore, Israel; Malaysia (Trung Tâm Khuyến Ngư Kiên Giang, 2006) Chính vì nguồn gốc xuất xứ dòng cá này đa dạng và phức tạp nên việc nhận dạng các cá thể dòng này trở nên khó khăn hơn

Năm 1997, một công ty ở Đài Loan nhập cá rô phi đỏ vào nước ta và nuôi thử nghiệm ở tỉnh Bình Dương Sau đó cá được đưa tới các nhà hàng ở thành phố Hồ Chí Minh với tên gọi khá hấp dẫn: cá điêu hồng

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Cá rô phi đỏ có thân bầu dục, dẹp bên, mõm nhọn và ngắn, hàm dưới nhô ra Vây lưng liền, tia vây cứng ở vây hậu môn và vây lưng rất phát triển Đường bên đứt đoạn Toàn thân cá rô phi đỏ phủ vẩy, có màu sáng hồng Lớp da (ngoài cùng) trên thân

có màu vàng nhạt hoặc vàng đậm hoặc hồng phấn, cũng có thể gặp những cá thể màu vàng, màu hồng xen lẫn màu đen nhạt

2.1.4 Đặc điểm sinh thái

Nhìn chung các loài cá rô phi ở nước ta có đặc điểm hình thái gần giống nhau Ngoài các đặc điểm cơ bản, cá rô phi đỏ còn có thêm một số đặc điểm nổi bật sau:

2.1.4.2 pH

Cá có thể sống trong môi trường nước có độ pH từ 4 – 10, tuy nhiên khi pH < 5 sẽ ngăn cản sự kết hợp giữa máu với ôxy ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cá,

pH bình thường từ 5 – 9; tốt nhất 6,8 – 8,3

2.1.4.3 Ôxy hòa tan (DO)

Cá có thể sống được trong môi trường thiếu ôxy với hàm lượng chất hữu cơ cao trong nhiều giờ, chịu được ngưỡng ôxy thấp tới 0,4 mg/L (Ngô Trọng Lư và Thái Bá

Hồ, 2005; trích bởi Nguyễn Tùng Chi và Nguyễn Thị Kiều Tuyên, 2008)

Theo Popma và Masser (1999), cá có thể sống được ở DO thấp hơn 0,3 mg/L; tuy nhiên các ao nuôi nên quản lý và duy trì ở lượng DO khoảng 1 mg/L Nếu để thấp hơn mức này lâu, sức đề kháng bệnh của cá sẽ giảm và chậm lớn, ngoài ra sự tăng trưởng cũng không được cải thiện hơn nếu duy trì DO ở khoảng 2 – 2,5 mg/L

2.1.4.5 Ammonia (NH 3 -N) và nitrite (NO 2 -N)

Ammonia rất độc cho cá, nhưng một số nghiên cứu cho thấy cá có khả năng chịu

chịu đựng với nitrite tốt hơn so với các loài cá nước ngọt khác (Popma và Masser, 1999)

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng

Do tính ăn tạp và khả năng bắt mồi lớn nên cá rô phi đỏ có tốc độ tăng trưởng nhanh và có kích thước lớn hơn các loài cá rô phi khác (ngoại trừ cá rô phi vằn) trong điều kiện bình thường Ngoài ra, tốc độ tăng trưởng của chúng còn phụ thuộc vào nhiệt

độ môi trường, thức ăn, mật độ thả và kỹ thuật chăm sóc Khi nuôi thâm canh, cá lớn nhanh hơn khi nuôi bán thâm canh và nuôi ghép với các loài cá khác

Cá đực lớn nhanh hơn cá cái 2 lần (Popma và Masser, 1999) Cá có thể đạt 120 –

200 g/con trong 4 tháng khi nuôi lồng (Balarin và Haller, 1982; trích bởi Nguyễn Tùng Chi và Nguyễn Thị Kiều Tuyên, 2008) Trong thực tế, cá có thể đạt trọng lượng 600 –

800 g/con, có khi đạt đến 1 – 1,2 kg/con (tỷ lệ thấp) khi nuôi trong bè trên sông với trọng lượng cá giống thả nuôi từ 33 – 40 g/con trong khoảng 3,5 – 4 tháng thả nuôi Nếu so sánh về mức tăng trưởng thì cá rô phi vằn (rô phi Đài Loan) và cá rô phi đỏ lớn nhanh hơn và có kích thước lớn hơn các loài cá rô phi khác

2.1.6 Đặc điểm sinh sản

2.1.6.1 Chu kỳ sinh sản

Hầu hết các loài cá rô phi trong giống Oreochromis đều tham gia sinh sản nhiều lần

trong năm Trong điều kiện khí hậu ấm áp cá rô phi đẻ quanh năm (10 – 11 lứa ở các tỉnh phía Nam; 5 – 7 lứa ở các tỉnh phía Bắc) Quan sát buồng trứng cá rô phi cho thấy: trong buồng trứng lúc nào cũng có tất cả các loại trứng, từ loại non nhất đến loại chín sẵn sàng rụng để đẻ Vì vậy trong tự nhiên ở các ao nuôi cá rô phi chúng ta gặp rất nhiều cá con ở các cỡ khác nhau (trừ ao nuôi cá rô phi đơn tính) Trung bình cá đẻ

từ 1000 – 2000 trứng, cỡ cá lớn có thể đẻ với số lượng trứng nhiều hơn Chu kỳ sinh sản của cá rô phi tùy thuộc vào tuổi cá, nhiệt độ, loại thức ăn,… thường kéo dài từ 3 –

4 tuần (tính từ lần đẻ này đến lần đẻ tiếp theo)

2.1.6.2 Phân biệt đực cái

Cá rô phi đỏ thành thục sinh dục chậm hơn các loài cá rô phi khác, tới 6 – 8 tháng

Có thể phân biệt được giới tính khi cá được 6 – 7 cm bằng cách quan sát một số đặc điểm bên ngoài như bảng sau:

Bảng 2.1: Phân biệt giới tính cá rô phi đỏ

Ðặc điểm phân

trứng và cá con Màu sắc (lúc

Dạng tròn, hơi lồi và không nhọn như ở cá đực

2.1.6.3 Sinh sản

Trước khi đẻ cá đực đào tổ gần bờ ao, nơi có nền đáy cứng, độ sâu mực nước 50 –

60 cm Tổ hình lòng chảo, đường kính tổ đẻ từ 30 – 40 cm, sâu 7 – 10 cm Cá cái đẻ trứng vào tổ, cá đực tưới tinh dịch để thụ tinh; sau khi thụ tinh cá cái ngậm hết trứng vào miệng để ấp

- Ở nhiệt độ 30oC thời gian ấp khoảng 2 – 3 ngày

- Ở nhiệt độ 28oC thời gian ấp khoảng 4 ngày

- Ở nhiệt độ 20oC thời gian ấp khoảng 6 ngày

Cá bột ngay sau khi nở, lượng noãn hoàng lớn, cá rất yếu, cá cái giữ chúng trong miệng đến khi tiêu hết noãn hoàng và tự kiếm được thức ăn bên ngoài Sau 4 – 5 ngày,

cá con tự tách khỏi mẹ, cá mẹ lại chuẩn bị cho chu kỳ sinh sản mới

Khi còn nhỏ cá thường bơi thành đàn xung quanh ao, có thể quan sát được vào lúc sáng sớm

2.1.7 Đặc điểm dinh dưỡng

Hình 2.2: Thức ăn tự nhiên của cá rô phi: ÐVPD, TVPD và động vật đáy (nguồn:

Vấn đề này nếu không được khắc phục ngay, có thể dẫn đến việc bùng phát dịch bệnh do cá bị stress trong thời gian dài (thiếu ăn), khả năng lan truyền bệnh cao (cá truy đuổi và ăn thịt đồng loại) Chính vì thế mà chúng ta cần có biện pháp hợp lý để hạn chế tình trạng trên như: kiểm tra định kỳ trọng lượng cá để cho ăn đủ lượng đủ chất, nếu có điều kiện phải tiến hành phân cỡ định kỳ, giảm mật độ nuôi,…

2.2 Liên cầu khuẩn Streptococcus agalactiae

2.2.1 Đặc điểm phân loại

Giống: Streptococcus (Rosenbach, 1884)

Loài: Streptococcus agalactiae (Lehmann and Neumann, 1896)

Cầu khuẩn Gram dương, đứng riêng lẻ, thành từng đôi hay tạo thành chuỗi dài từ 3 – 5 tế bào đến 10 – 15 tế bào do vi khuẩn nhân đôi bằng cách phân chia trong mặt phẳng thẳng góc với trục của chuỗi (Đỗ Khoa Nam, 2007), nên được gọi là liên cầu khuẩn, là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi, không di động, oxydase (-), catalase (-), không sinh bào tử

Vi khuẩn không phát triển ở điều kiện nhiệt độ 10oC và 45oC (Buller, 2004) Nhiệt

độ nuôi cấy thích hợp từ 25 – 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, hình tròn hơi lồi; ngoại lệ có một số chủng tạo khuẩn lạc màu trắng trong, có tính nhầy sau 24 giờ nuôi cấy Lớp chất nhày đó là mucopolysaccharide

do chủng này tiết ra, và thể hiện độc lực của nó, tức là lớp nhầy càng dày thì độc lực của vi khuẩn càng cao Tuy nhiên, rất khó duy trì được chủng này lâu, vì qua nhiều lần cấy chuyền ta sẽ thu được khuẩn lạc màu trắng đục như những chủng thông thường

Vi khuẩn có khả năng gây dung huyết β, trên môi trường thạch máu tạo khuẩn lạc

có vòng dung huyết β nhỏ, trong suốt, rìa không rõ

Hình 2.3: Hình dạng khuẩn lạc sau một ngày cấy thuần (A) Streptococcus agalactiae

bắt màu tím đậm của crystal violet (B)

2.2.2 Dịch tễ của bệnh

Bệnh thường xảy ra trên cá cỡ lớn, tỷ lệ cá chết rất cao ở những thời gian nhiệt độ nước cao trong năm tập trung vào các tháng cuối mùa hè và đầu mùa thu Ở những thời điểm khác trong năm cá chết rải rác Khi nhiệt độ nước xuống thấp vào những tháng mùa đông ở các nước ôn đới không thấy xuất hiện bệnh

Bệnh xảy ra do cá bị stress trong thời gian dài, bởi một số nguyên nhân do nhiệt độ nước tăng cao (30,5 – 32oC), DO thấp, mật độ nuôi dày

Bệnh lây lan theo chiều ngang do hiện tượng ăn nhau, khi cá bị trầy sướt trên da tạo điều kiện cho vi khuẩn từ môi trường nước xâm nhập trực tiếp vào cơ thể cá, hay

vi khuẩn xâm nhập qua niêm mạc (khứu giác)

Bệnh truyền từ cá thể này sang cá thể khác, từ cá chết sang cá hấp hối và cá khỏe,

có thể ở thể cấp tính tỷ lệ chết cao trên 50% trong 2 – 3 tuần Bệnh bộc phát vài lần, sau đó trở nên mãn tính, cá chết kéo dài trong nhiều tuần

2.2.3 Triệu chứng bệnh tích của cá bị bệnh Streptococcus agalactiae

Cá bệnh có triệu chứng chung khá điển hình trên nhiều loài với những biểu hiện bất thường như: bơi lội thất thường, cong thân, không thèm ăn, lờ đờ; mắt xuất huyết, lồi

và mờ đục; trướng bụng, dạ dày và ruột trống rỗng hoặc tích dịch hơi vàng (Springer, 2007) Gan sưng, thận và lách có hiện tượng sung huyết, tích dịch xoang bụng

(Duremdez và ctv., 2004; trích bởi Springer, 2007)

Có ổ mủ ở hàm dưới, gốc vây, ổ mủ vỡ ra thành loét Xuất huyết điểm ở gốc vây

và hậu môn, viêm phúc mạc nên viêm dính nội quan với nhau và viêm dính thành bụng, có hiện tượng xuất huyết não (Nguyễn Hữu Thịnh, 2006)

tăng số lượng vi khuẩn sau khi đã phân lập thuần Streptococcus sp sinh trưởng tốt

trên môi trường TSA (Tryptic Soy Agar) có thêm 0,5% glucose Ngoài ra có thể dùng môi trường BHIB (Brain Heart Infusion Broth) Mục đích của việc tăng sinh có thể để gây bệnh thực nghiệm hoặc giữ giống vi khuẩn mới tìm được

Định danh vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hóa (phương pháp truyền thống), API

20 strep, API rapid ID 32 strep, Strep grouping antisera (G.B) (Buller, 2004), sử dụng

kỹ thuật PCR (Nguyễn Tùng Chi và Nguyễn Thị Kiều Tuyên, 2008) Tuy nhiên trong thực tế, các kết quả thu được từ các phản ứng sinh hóa cũng như các test kít đôi lúc không trùng lắp với nhau Nguyên nhân của kết quả này không tránh khỏi sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, mà cụ thể là nhiệt độ ủ trong khi tiến hành phản ứng trên các test Ví dụ như: phản ứng hippurate có thể dương tính ở 25oC nhưng lại âm tính ở 37oC (Buller, 2004) Hay là, Phương pháp VP theo nguyên tắc là cho kết quả âm

tính, nhưng lại dương tính ở test API rapid ID32 (Vandamme và ctv., 1997; trích bởi Buller, 2004) Tương tự, S agalactiae phân lập được trong đợt dịch bệnh ở Kuwait

trên cá chẽm, và cá đối hoang đã có một số phản ứng sinh hóa khác với các chủng đối

chứng trong ATCC (Evan và ctv., 2002; trích bởi Buller, 2004) Qua đây, ta có thể kết

luận được rằng: nếu trong quá trình định danh phát hiện một số phản ứng sinh hóa sai khác với phương pháp chuẩn (phương pháp truyền thống) thì ta cần kết hợp nhiều yếu

2.2.5 Phương pháp phòng và trị bệnh

Áp dụng phương pháp phòng bệnh chung, giảm mật độ nuôi, tránh cho ăn thừa, thường xuyên vệ sinh bể nuôi Giảm cho ăn và hạn chế đến mức tối đa các hoạt động chia đàn, phân cỡ, chuyển đàn trong thời gian dịch bệnh thường xảy ra; vớt cá bệnh, cá chết ra khỏi ao nhằm tránh lây lan bệnh…

Sử dụng các loại kháng sinh phổ rộng hay kháng sinh diệt khuẩn gram dương như: erythromycin, oxytetracyclin, doxycyclin,… để trị bệnh Dùng phương pháp trộn kháng sinh vào thức ăn như dùng erythromycin, ciprofloxacin, enrofloxacin liều 25 –

50 mg/kg cá/ngày, sử dụng liên tục trong 4 – 7 ngày

2.3 Sơ lược về thuốc trừ sâu sử dụng trong nghiên cứu (Nguyễn Hữu Trúc, 2008) 2.3.1 Lược sử về nhóm thuốc gốc lân hữu cơ

Nhóm thuốc gốc lân hữu cơ (LHC) do Lange và Von Kreuger tìm ra vào đầu những năm 1930 (dimethyl và diethyl phosphorofluoridate) Đến 1936, Gerhard Schrader chủ trì một dự án nghiên cứu và tìm ra nhiều chất khác như dimefox, octamethyl pyrophosphoramidate (schradan) và tetraethyl pyrophosphate (TEPP) Cuối thế chiến thứ II, chất parathion ra đời và tồn tại trong hơn 40 năm Cho đến nay

đã có hàng ngàn chất LHC được tổng hợp và đánh giá, trong số đó đã có khoảng 100 chất khác nhau được đưa vào thương mại hóa (diazinon, chlorpyrifos, malathion, dimethoate…) Đây là nhóm thuốc hữu cơ quan trọng nhất hiện dùng Schrader được xem là ông tổ của các thuốc lân hữu cơ

2.3.2 Các dạng chế phẩm và cấu tạo hóa học tổng quát

2.3.2.1 Các dạng chế phẩm

Sở dĩ có khái niệm “chế phẩm” là vì: thuốc trừ sâu ở dạng nguyên chất hoặc dạng thô quá đậm đặc, khó hòa tan vào nước, không được bền nên các nhà sản xuất thường thêm vào các chất khác để cải thiện khả năng tồn trữ, thao tác vận chuyển và sử dụng

an toàn hơn Sản phẩm cuối cùng được gọi là chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật (TBVTV) Bao gồm: chất hoạt động, chất mang như các loại dung môi hoặc khoáng sét, các chất tác động bề mặt (chất dính và chất trải), các chất khác (chất ổn định, chất nhuộm, các hóa chất để cải thiện hoặc tăng cường tác động của TBVTV) Lượng TBVTV thực sự chứa bên trong chế phẩm được biểu thị theo phần trăm hoạt chất Ví dụ: Diazan 10H tức là thuốc dạng hạt (H) có 10% hoạt chất là diazinon

Trên thị trường có các dạng chế phẩm sau đây: bột, nhũ dầu, hạt, viên, dung dịch, bột thấm nước, thể tích cực nhỏ, thể tích nhỏ, bột nhão, bột hòa nước,…

2.3.2.2 Cấu tạo hóa học

LHC là những chất có ít nhất một nguyên tử phosphore bốn hóa trị, hầu hết các LHC là những ester có cấu trúc như sau:

Trong đó: R: methyl hoặc ethyl

R’: alkoxy, alkyl, aryl, amino hoặc các amino có nhóm thế

Sự tích lũy tăng bội sinh học là một quá trình trong đó các sinh vật gia tăng sự tích lũy thuốc, tùy theo vị trí của chúng trong chuỗi thức ăn Trong hệ sinh thái đất và nước, chuỗi thức ăn có thể được diễn tả tóm lược như sau:

Sự tích lũy thường gắn liền với các loại thuốc có tính tồn lưu trong đất và nước Trong đất, thuốc bị rễ cây hút vào Trong nước, thuốc thường tập trung trong các thủy thực vật (chủ yếu là phiêu sinh thực) vì ái lực của thuốc đối với thực vật cao hơn nước Sau đó các động vật nhỏ ăn phiêu sinh thực vật, thuốc lại được tích lũy trong động vật

do ái lực cao của thuốc đối với các mô bào động vật Sự tích lũy này tăng dần lên trong chuỗi thức ăn Do hiện tượng này mà rất nhiều sinh vật không phải là đối tượng

xử lý trực tiếp của thuốc vẫn bị tích lũy một hàm lượng thuốc cao Nếu quá ngưỡng tử vong sinh vật sẽ bị chết Ở dưới ngưỡng tử vong, sẽ xảy ra một số hậu quả như: vỏ trứng bị mỏng, gan bị hoại tử từng vùng, sinh sản bất bình thường, quá mẫn cảm,… Cá thường rất nhạy cảm với nhiều TBVTV có trong nước ngay cả ở nồng độ thấp Chúng

Acetylcholine là một trong số các chất dẫn truyền luồng thần kinh quan trọng, chi phối sự truyền các xung thần kinh dọc qua các chỗ nối synaptic và trong một số trường hợp qua các chỗ nối cơ thần kinh

Vai trò của AChE trong việc điều phối truyền động luồng thần kinh được diễn tả trong hình sau:

Các động vật không xương sống nhỏ

Cá lớn

Cá nhỏ Các loài chim ăn thịt Phiêu sinh

Hình 2.4: Sự tương tác giữa AChE và ACh tại chỗ nối synapse hoặc cơ thần kinh

Khi xung thần kinh di chuyển dọc theo trục và tiến đến điểm cuối của nối synapse hoặc cơ thần kinh, các ACh có sẵn trong các túi sẽ được phóng thích ra ngoài nhanh chóng, sau đó tương tác với màng sau synaptic gây kích thích cơ hoặc sợi thần kinh AChE điều chỉnh sự truyền thần kinh bằng cách giảm nồng độ ACh tại chỗ nối bằng phản ứng thủy phân men, biến ACh thành choline và acid acetic

2.3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến độc tính của TBVTV

Có nhiều yếu tố làm tăng hoặc giảm khả năng phòng diệt của TBVTV đối với các địch hại; gồm có: nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, gió, mưa, yếu tố di truyền, tuổi và thể trạng của sinh vật Thời gian cần có để mất đi một nửa lượng thuốc ban đầu gọi là

“bán sinh” của thuốc Bán sinh của thuốc tùy thuộc vào đặc điểm của hóa chất và dạng bào chế, vi sinh vật đất, tia UV, chất lượng nước pha thuốc cũng như các chất lẫn tạp trong thuốc Trộn các loại TBVTV lại với nhau có thể làm tăng hoặc giảm bán sinh

2.3.4.3 Tính mẫn cảm và tính chống chịu của sinh vật đối với tác động của thuốc

Đối với cùng một loài sinh vật thì tính mẫn cảm đối với cùng một loại chất độc cũng khác nhau, tùy theo từng giai đoạn phát triển Hồ Thị Ngọc Hà (2005) trong thí nghiệm ảnh hưởng của diazinon trên cá rô phi dòng GIFT, có kết luận: nồng độ gây

Tính chống chịu thay đổi trong ngày tùy trạng thái sinh lý: càng hoạt động càng mẫn cảm

Tính chống chịu khác biệt theo giới tính

Cùng một loài, cùng một lứa tuổi, khi bị đói hoặc ăn thức ăn không thích hợp thì cá thể sẽ trở nên mẫn cảm hơn

Nguyên nhân gây ra tính chống chịu:

+ Thành phần và hoạt tính của các men

2.3.5 Sơ lược về hoạt chất diazinon

Diazinon là một trong các dẫn xuất dị vòng trong nhóm lân hữu cơ, xuất hiện năm 1952; là một chất tương đối khá an toàn và có nhiều công dụng Trong phân tử các thuốc dị vòng, các cấu trúc vòng có nhiều carbon bị ôxy hoặc nitơ thế chỗ Đó là phân

tử phức hợp và có tính tồn lưu cao Chính vì cấu trúc phức tạp, nên khi phân rã sẽ tạo

ra nhiều sản phẩm khó có thể xác định hoàn toàn chính xác

Cơ chế tác động: gây độc synap hệ thần kinh trung ương

Có tính di động loại II, tức là có thể di chuyển chút ít trong đất Cho thấy nó có khả năng gây ô nhiễm nguồn nước ngầm

Cấu trúc phân tử diazinon như sau:

Một số chế phẩm có chứa diazinon thông dụng: basudin 40EC, diazan 10H…

2.3.6 Thông tin về loại thuốc sử dụng trong nghiên cứu (Diazan 10H)

Hình 2.5: Sản phẩm DIAZAN 10H

Hãng sản xuất: Công ty cổ phần Bảo vệ Thực vật An Giang 23, Hà Hoàng Hổ, Tp Long Xuyên, An Giang Điện thoại: (076)3.840748 – 3.841272 Fax: (076)841498 Hoạt chất: 10% diazinon

Quy cách: 1 kg, 5 kg

Độ độc: nhóm 3

Cơ chế tác động: nội hấp, tiếp xúc, vị độc, xông hơi và thấm sâu

Công dụng: thuốc hạt dùng để rải, đặc trị sâu đục thân hại lúa, mía, bắp,… và trừ côn trùng nằm trong đất và nằm trong cây gây hại cây trồng

Lưu ý khi sử dụng:

- Nên rắc vào lúc nắng ráo, tránh thuốc dính vào lá cây trồng

- Đối với lúa, khi rắc đều lên mặt ruộng cần giữ mực nước sâu 5 – 7 cm

- Đối với cây trồng cạn, cần vùi thuốc sâu trong đất từ 3 – 5 cm

dạng lỏng hòa tan trong nước sông, suối hay nồng độ hơi hoặc bụi trong môi trường không khí ô nhiễm có thể gây chết 50% số động vật thí nghiệm (Lê Huy Bá, 2006)

Có nhiều quy ước phân loại các chất độc dựa vào LD50 của chúng như sau (Lê Huy

2.5 Sơ lược về bộ test Pastorex TM Strep của hãng Biorad (Đỗ Khoa Nam, 2007)

Hình 2.6: Các vật liệu chính trong bộ test Pastorex Strep: dung dịch men ly trích (a),

ống đối chứng (b), ống chứa hạt latex để định vi khuẩn nhóm A, B, C, D, F, G tương

ứng trên hình Pastorex Strep là bộ test kit dùng để định danh nhanh các liên cầu khuẩn dựa trên phản ứng kháng nguyên kháng thể sau khi đã tiến hành các bước định danh sơ bộ (phản ứng oxydase, catalase, xem di động, nhuộm gram, hình thái và màu sắc khuẩn lạc…)

2.5.1 Nguyên tắc

Pastorex strep là một thử nghiệm ngưng kết nhanh để định nhóm liên cầu khuẩn theo phân loại của Lancefield Thử nghiệm sử dụng huyền trọc latex chuyên biệt cho các nhóm A, B, C, D, F, G Pastorex strep sử dụng một loại men để ly trích kháng nguyên nhóm Kháng nguyên sau khi ly trích sẽ được định danh bằng cách sử dụng hạt latex có gắn kháng thể chuyên biệt nhóm Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên tương ứng, hạt latex sẽ ngưng kết (hình C) Nếu không có sự hiện diện của kháng nguyên tương ứng sẽ không có ngưng kết (hình D)

Hình 2.7: Phản ứng dương tính (C), và âm tính (D) 2.5.2 Các bước thực hiện

- Cho 0,3 ml dung dịch men ly trích vào một ống nghiệm nhỏ (cho mỗi chủng liên cầu khuẩn)

Hình 2.8: Các ống nghiệm sử dụng

- Cho 5 – 10 khóm vi khuẩn vào ống nghiệm

- Khuấy hỗn hợp trong ống nghiệm cho tan đều

- Đem ủ ống nghiệm ở 37oC trong 30 phút

- Lắc đều ống chứa hạt latex rồi nhỏ một giọt latex lên các vòng tròn của tấm ngưng kết (agglutination card)

Hình 2.9: Tấm ngưng kết trong bộ test Pastorex Strep

- Nhỏ một giọt dung dịch ly trích (từ ống nghiệm đã ủ được 30 phút) vào mỗi vòng tròn của tấm ngưng kết

- Khuấy đều các thành phần trong mỗi vòng tròn bằng các que khuấy đã vô trùng (có sẵn trong bộ test)

Hình 2.10: Các que khuấy vô trùng

- Lắc đều tấm ngưng kết tối đa 1 phút

- Đọc kết quả

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu bắt đầu từ 27/04/2009 đến 05/08/2009

Địa điểm tiến hành tại Phòng bệnh học (Trại thực nghiệm thủy sản), phân tích mẫu

và làm thí nghiệm thăm dò (thí nghiệm 1) tại Phòng thí nghiệm bệnh học thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu, trang thiết bị và hóa chất

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá rô phi đỏ với cỡ cá thí nghiệm là 6 – 8 g/con

Thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ: Diazan 10H

3.2.2 Hệ thống bể thí nghiệm

Sử dụng hệ thống bể nhựa, mỗi bể có thể tích tối đa là 85 lít nước; các bể kiếng tại phòng thí nghiệm bệnh học thủy sản, với kích cỡ mỗi bể là 30×30×40 cm

Bên cạnh đó dùng máy sục khí với công suất 210 lít/phút để sục khí đều cho từng

bể trong suốt quá trình thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Xác định LC50-48h của diazan 10H đối với cá rô phi đỏ được bố trí trong 18 bể, mật độ 10 con/bể (40 lít nước)

Thí nghiệm 2: Xác định khả năng cảm nhiễm Streptococcus agalactiae của cá thí

nghiệm sau khi ngâm thuốc trừ sâu ở các khoảng thời gian khác nhau Được bố trí trong 15 bể với mật độ 20 con/bể (40 lít nước)

3.2.3 Dụng cụ

Tủ lạnh, tủ đông (-20oC), tủ cấy vi khuẩn, máy votex, autoclave, kính hiển vi, cân điện tử, máy ảnh, dụng cụ tiểu phẩu, máy sục khí, nhiệt kế, máy đo DO, test đo chất lượng nước hiệu SERA của Đức

Bao nilon (50x100 cm) dùng trong thí nghiệm 2 (phần 1) Bể kiếng (30×30×40 cm) (dùng trong thí nghiệm thăm dò, thí nghiệm 1) Bể nhựa (85 lít)

Ống nghiệm, ống giữ giống, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, lame, lamelle, pipet và các dụng cụ cần thiết khác

3.2.4 Hóa chất và môi trường

PCA (Plate Count Agar): nuôi cấy, phân lập, đếm vi khuẩn

NB (Nutrient Broth): tăng sinh và giữ giống vi khuẩn

BHIA (Brain Heart Infusion Agar)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Trước khi bố trí thí nghiệm, ta xét nghiệm bệnh ký sinh trùng trên cá thí nghiệm Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách, não (đối với thí nghiệm 2) Mục đích của công việc này nhằm đảm bảo cá thí nghiệm khỏe mạnh hoàn toàn, kết quả thí nghiệm chính xác hơn

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Sử dụng phương pháp bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên

Sục khí đều trong suốt quá trình thí nghiệm

3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Xác định LC50-48h của thuốc Diazan 10H đối với cá thí nghiệm bằng phương pháp thử nghiệm cấp tính (sử dụng liều cao và tiến hành trong thời gian ngắn)

Thuốc trừ sâu được cân bằng cân điện tử với trọng lượng cân tối đa là 210 g (d = 0,1 mg) Sau đó pha vào nước để tan đều mới cho cá vào ngâm

a Thí nghiệm thăm dò

Trước khi xác định LC50-48h, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm thăm dò để xác định nồng độ thuốc ảnh hưởng đến cá thí nghiệm (EC) và nồng độ gây chết 100% cá thí nghiệm sau 48 giờ

Bố trí 7 nghiệm thức (một đối chứng và 6 nồng độ thuốc), không lặp lại, mỗi bể bố trí 10 cá/20 lít nước

Ngưng cho cá ăn 1 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm

Tiến hành pha thuốc vào nước với các nồng độ đã tính trước, chờ khoảng 30 phút cho thuốc tan hoàn toàn, sau đó cho cá vào Theo dõi các dấu hiệu bên ngoài của cá, ghi nhận số cá chết tại các mốc thời gian (giờ): 3, 6, 12, 24, 48 tính từ lúc bắt đầu cho

Sau 48 giờ thí nghiệm, chúng tôi chọn nồng độ thuốc cao nhất mà tại đó không có

cá chết; cá sống và hoạt động bình thường khi cho vào nước sạch Và chọn nồng độ thuốc thấp nhất mà tại đó 100% cá chết sau 48 giờ thí nghiệm

Từ hai nồng độ trên ta thiết lập một dãy 5 nồng độ thuốc tăng dần, để tiến hành thí nghiệm xác định LC50-48h

b Thí nghiệm xác định LC 50-48h

Thí nghiệm được tiến hành với 6 nghiệm thức (một đối chứng và 5 nồng độ thuốc) tương ứng với dãy nồng độ (ppm): 0 – 45 – 55 – 65 – 85 – 125 Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, với 10 cá/bể (40 lít nước)

II.1 V.1 V.3 IV.1 III.3 III.1 IV.3 ĐC3 I.2 V.2 I.1 ĐC2 ĐC1 IV.2 II.3 I.3 III.2 II.2

Sơ đồ 3.1: Trật tự bố trí thí nghiệm xác định LC

Hình 3.2: Bố trí thí nghiệm xác định LC50-48hCác điều kiện thí nghiệm được giữ như nhau ở các nghiệm thức (mật độ, thể tích nước, sục khí, thay nước (trong những ngày trữ cá))

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Nhiệt độ được đo mỗi ngày 2 lần: sáng (6 – 7 giờ) và chiều (13 – 14 giờ)

- pH và NH3: đo một lần vào mỗi buổi sáng

- Ôxy hòa tan (DO): chỉ đo một lần trước khi ngâm thuốc bằng máy đo DO Vì với điều kiện sục khí liên tục, mật độ 20 – 30 con/bể (40 lít nước) thì DO dao động từ 6,5 – 7,8 mg/lít không nằm trong mức gây hại đến cá thí nghiệm

- Ghi nhận số lượng cá chết trong từng bể theo các mốc thời gian như trong thí nghiệm thăm dò

3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Xác định khả năng cảm nhiễm Streptococcus agalactiae của cá

thí nghiệm sau khi ngâm thuốc trừ sâu ở các khoảng thời gian khác nhau

Cũng như ở thí nghiệm 1, trong thí nghiệm này chúng tôi cũng tiến hành thăm dò liều LD50 của Streptococcus agalactiae đối với cá thí nghiệm (tại Trại thực nghiệm

thủy sản), trên cơ sở kết quả LD50 là 7,3 × 104 cfu/ml trong phương pháp tiêm (Nguyễn Tùng Chi và Nguyễn Thị Kiều Tuyên, 2008) Thí nghiệm tiến hành trong khoảng 14 ngày

Sau đó, ta tiến hành bố trí gây bệnh thực nghiệm Cụ thể:

Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức Trong đó có 2 lô đối chứng và 3 lô thí nghiệm, được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại

ĐCI.1 ĐCII.2 I.1 ĐCI.3 ĐCII.3 I.3 III.2 III.1 II.3 II.1 III.3 ĐCI.2 II.2 I.2 ĐCI.1

Sơ đồ 3.2: Trật tự bố trí thí nghiệm 2

a Phần 1: Ngâm cá với thuốc trừ sâu Diazan 10H trong 3 khoảng thời gian ngâm

khác nhau là 12, 24, 48 giờ, với nồng độ thuốc là 50% LC50-48h

Hình 3.3: Ngâm thuốc trừ sâu (trong túi nilon)

Cụ thể:

NT ĐC1 và ĐC2 không ngâm thuốc

NT1 ngâm thuốc với thời gian 12 giờ

NT2 ngâm thuốc với thời gian 24 giờ

NT3 ngâm thuốc với thời gian 48 giờ

b Phần 2: Gây cảm nhiễm thực nghiệm bằng Streptococcus agalactiae với liều LD50

thăm dò được

Cụ thể: sau khi ngâm thuốc với các thời gian định sẵn ở phần 1, ta chuyển cá sang các xô thí nghiệm có sẵn vi khuẩn, và ngâm trong khoảng 1 giờ

Hình 3.4: Cảm nhiễm vi khuẩn bằng phương pháp ngâm (trong các xô nhựa)

ĐC1 (đối chứng âm) không ngâm thuốc không gây bệnh

ĐC2 (đối chứng dương) không ngâm thuốc và gây bệnh với liều LD50

NT1, NT2, NT3 đã ngâm thuốc và gây bệnh với liều LD50

Tiến hành theo dõi cá thí nghiệm trong khoảng 14 ngày, cho cá ăn với khẩu phần 5% trọng lượng cơ thể

Mỗi ngày làm vệ sinh thành bể, xi phông đáy, thay nước và đo các chỉ tiêu chất lượng nước: nhiệt độ, pH, NH3, riêng DO ta cũng chỉ đo một lần như ở thí nghiệm 1, ghi nhận số cá chết, các biểu hiện bệnh, giải phẩu, phân lập, định danh vi khuẩn để kiểm chứng có phải vi khuẩn đã gây cảm nhiễm thực nghiệm không

Thu thập số liệu cá chết và xử lý kết quả bằng trắc nghiệm Tukey’s

3.3.2 Một số phương pháp khác được sử dụng trong nghiên cứu

3.3.2.1 Phương pháp kiểm tra dấu hiệu bên ngoài và mổ khám bệnh tích

Kiểm tra bệnh tích bên ngoài: quan sát cách cá bơi, mắt, da, vây bụng, hậu môn và mang của cá bệnh, nhận định sự khác biệt so với cá bình thường

Mổ khám bệnh tích: do thí nghiệm tiến hành trên cá nhỏ nên ta không cần làm sạch vẩy tại vị trí cần mổ mà chỉ cần sát trùng toàn thân cá bằng cồn 70o để tránh sự nhiễm tạp các vi khuẩn bên ngoài

Mổ xoang bụng cá bằng 3 đường cắt (Nguyễn Tùng Chi và Nguyễn Thị Kiều Tuyên, 2008)

Đường thứ nhất: bắt đầu từ trước hậu môn, theo đường giữa thành bụng đến phần