HNTS 2012 18 xác ĐỊNH LIỀU LD50 và KHẢ NĂNG đáp ỨNG MIỄN DỊCH của cá rô PHI đỏ đối với STREPTOCOCCUS AGALACTIAE KHI sử DỤNG THỨC ăn có bổ SUNG β GLUCAN

Các nghiệm thức gây bệnh tiêm 0,1 mL vi khuẩn với liều LD50 đã xác định ở thí sốc cảm nhiễm để xác định khả năng xâm nhập của vi khuẩn Streptococcus agalactiae quan sát và ghi nhận những

XÁC ĐỊNH LIỀU LD 50 VÀ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ RÔ PHI ĐỎ

ĐỐI VỚI STREPTOCOCCUS AGALACTIAE KHI SỬ DỤNG THỨC ĂN CÓ BỔ SUNG Β

GLUCAN

Trần Ngọc Thiên Kim (1) , Nguyễn Thị Kiều Tuyên (1) , Nguyễn Tùng Chi (2) ,

(1) Bộ môn Bệnh học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Đại học Nông Lâm TPHCM

(2) Trung tâm KNKN – sở NN PTNT Khánh Hòa

1 GIỚI THIỆU

Giá trị sản xuất nông lâm nghiệp và thủy sản năm 2010 đạt 232,700 tỷ đồng, tăng 4.7% so với năm 2009 Trong đó thủy sản đạt 56,900 tỷ đồng tăng 6.1% với cá đạt 3,848.000 tấn tăng 4.8% Nghề nuôi thủy sản nước ngọt mà đặc biệt là rô phi đỏ đã được Bộ Thủy Sản xác định là một trong những đối tượng nuôi quan trọng trong quá trình phát triển nuôi trồng thủy sản trong

10 năm trở lại đây

Việt Nam là nước trong khu vực Đông Nam Á, có khí hậu ấm áp và có đủ điều kiện để sản xuất cá rô phi hướng tới xuất khẩu Tuy nhiên, do việc mở rộng khu vực nuôi không theo quy hoạch cùng với việc nuôi với mật độ cao làm cho nghề nuôi bị thiệt hại nhiều do dịch bệnh Tác nhân gây bệnh trên cá rô phi nói chung và rô phi đỏ nói riêng thường là vi khuẩn, virus, hoặc

protozoa trong đó đáng chú ý nhất là bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp.

Do đó việc tìm hiểu ảnh hưởng của bệnh gây ra bởi Streptococcus sp trên cá rô phi đỏ

đồng thời cải thiện sức khoẻ cá nuôi để cá có sức đề kháng tự nhiên tốt với dịch bệnh mà không cần sử dụng kháng sinh đang là một nhu cầu cấp thiết

Mục tiêu của đề tài nhằm xác định liều LD50 và khả năng đáp ứng miễn dịch của cá rô phi

đỏ đối với Streptococcus agalactiae khi sử dụng thức ăn có bổ sung β-glucan Để đạt mục tiêuglucan Để đạt mục tiêu

trên, lần lượt các nội dung sau sẽ được tiến hành

-glucan Để đạt mục tiêu Xác định liều LD50 (lethal dose 50) trên cá rô phi đỏ bằng vi khuẩn Streptococcus

agalactiae.

-glucan Để đạt mục tiêu Xác định khả năng miễn dịch của cá rô phi đỏ ở các khẩu phần ăn khác nhau có bổ sung β-glucan Để đạt mục tiêuglucan

-glucan Để đạt mục tiêu Thử nghiệm kháng sinh đồ trên Streptococcus agalactiae.

-glucan Để đạt mục tiêu Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration

MIC) trên Streptococcus agalactiae.

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

-glucan Để đạt mục tiêu Cá rô phi đỏ cỡ cá 10 – 15 g/con

-glucan Để đạt mục tiêu Streptococcus agalactiae phân lập từ khu vực nuôi cá rô phi ở quận 9 TPHCM

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Phương pháp

Thí nghiệm 1: Xác định LD50

Streptococcus agalactiae ở những độ pha loãng khác nhau 105, 106, 107, 108 để xác định liều gây chết 50% số cá thí nghiệm

lượng đạm 30%, với tỷ lệ 2% trọng lượng thân/ngày

Bảng 1: Liều vi khuẩn gây bệnh ở các nghiệm thức trong thí nghiệm 1

Ngâm N0 NI NII NIII NIV

Sau khi gây bệnh, theo dõi và ghi nhận các biểu hiện của cá trong bể, nếu cá chết trong vòng 24 giờ sau khi tiêm là vì cá bị sốc do tiêm Sau 2 đến 3 ngày gây nhiễm, ghi nhận số lượng

cá chết mỗi ngày ở mỗi nghiệm thức để xác định LD50 Quan sát và ghi nhận những biểu hiện bất thường của cá, các dấu hiệu bên ngoài và bên trong, phân lập vi khuẩn từ gan thận lách và não, định danh để xác định mức độ cảm nhiễm của cá đối với mầm bệnh

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏglucan lên đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ

ăn khác nhau, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

Bảng 2: Khẩu phần thức ăn ở các nghiệm thức

β-glucan Để đạt mục tiêuglucan Protein

Nghiệm thức

ngày cho cá ăn 2 lần vào lúc 8 giờ sáng và 4 giờ chiều Cho cá ăn tối đa Sau đó tiến hành gây cảm nhiễm Các nghiệm thức gây bệnh tiêm 0,1 mL vi khuẩn với liều LD50 đã xác định ở thí

sốc

cảm nhiễm để xác định khả năng xâm nhập của vi khuẩn Streptococcus agalactiae quan sát và

ghi nhận những biểu hiện bất thường của cá, các dấu hiệu bên ngoài và bên trong, phân lập để xác định mức độ cảm nhiễm của cá đối với mầm bệnh

Thí nghiệm 3: Thử nghiệm kháng sinh đồ trên vi khuẩn Streptococcus agalactiae

gentamycin, kanamycin, spectinomycin, erythromycin, tylosin, tetracyclin, doxycyclin, oxytetracyclin, norfloxacin, nitrofurantoin, rifampin

Thí nghiệm 4: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của một số loại kháng sinh trên vi khuẩn Streptococcus agalacitae

Bảng 3: Phương pháp pha loãng kháng sinh

Kháng sinh (mL) 2 2 2 2 2 mL nước cất

Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Xác định LD50 của Reed và Muench (1938)

50% gần nhất

pd = (> 50% -glucan Để đạt mục tiêu 50%)/(> 50% -glucan Để đạt mục tiêu < 50%)

LD50 = pd x (độ pha loãng thấp hơn 50% -glucan Để đạt mục tiêu độ pha loãng) + độ pha loãng cao hơn 50%

Hoặc logLD50 = [log (> 50%)] + [log (10-glucan Để đạt mục tiêu1) x pd] = y →LD50 = 10y

Phương pháp xác định ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏglucan lên đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ

Tỷ lệ sống của cá theo thí nghiệm(%)

Nt: Số lượng cá sau thí nghiệm Tăng trọng

Phương pháp xác định kháng sinh đồ

Các số liệu đường kính vòng vô khuẩn được đo trong thí nghiệm và biện luận tính kháng, tính nhạy trung gian và tính nhạy của vi khuẩn đối với các kháng sinh thử nghiệm

Phương pháp tính MIC

Nồng độ tối thiểu của kháng sinh ngăn cản sự tăng trường của vi khuẩn (MIC) là tích số của nồng độ kháng sinh ban đầu với tỷ lệ pha loãng của kháng sinh ở ống trong cuối cùng trong dãy ống nghiệm

MIC = C M x 1/2 n

Trong đó:

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn

Quá trình phân lập vi khuẩn trên cá chết và cá lờ đờ đều cho những khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, bóng, lồi thấp, rìa đều, tâm đậm hơn rìa

Qua định danh sơ bộ cho phản ứng oxidase (-glucan Để đạt mục tiêu), catalase (-glucan Để đạt mục tiêu) Vi khuẩn bắt màu tím, Gram dương hình cầu thành từng đôi, có khi đứng riêng lẻ (trên môi trường thạch), tạo thành chuỗi dài (trong môi trường tăng sinh)

(a): Vi khuần hình cầu (môi trường thạch) (b): Vi khuẩn dạng chuỗi (môi trường tăng sinh)

Hình 1: Hình thái của vi khuẩn Xác định LD 50

Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh ở phương pháp tiêm và ngâm

Mặc dù trong cùng điều kiện chăm sóc, quản lý như nhau ở hai phương pháp ngâm và tiêm nhưng thời điểm phát sinh bệnh khác nhau ở mỗi nghiệm thức Cả ba lần lặp lại thì nghiệm

cả phương pháp tiêm và ngâm thì dấu hiệu bệnh lý xuất hiện sau 21 giờ từ lúc gây cảm nhiễm Với thời gian biểu hiện này cho thấy tính nhạy cảm của ký chủ và khả năng gây bệnh của chủng này

Bảng 4: Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh

Ghi chú: (-) không có biểu hiện bệnh

Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng ngang nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P > 0.05)

Đối với phương pháp tiêm và ngâm chúng tôi thấy rằng thời gian cá bắt đầu biểu hiện dấu hiệu bệnh lý ở các nghiệm thức là có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ tin cậy 95% (P < 0.05)

Tỷ lệ cá chết, các dấu hiệu bệnh lý, kết quả tái phân lập

bơi lờ đờ trên mặt bể, bụng trương, mắt lồi, mù mắt, xuất huyết các gốc vây, toàn thân Khi giải phẫu thấy có hiện tượng tích dịch xoang bụng, gan nhạt màu, đôi khi xuất huyết, lách, thận và mật sưng, bóng khí phình to, não bị xuất huyết

Hình 2: Cá thí nghiệm bị mù mắt

và trương bụng sau 4 ngày gây

bệnh

Hình 3: Cá thí nghiệm bị mù mắt

và trương bụng sau 4 ngày gây

bệnh

(b) (a)

Bảng 5: Kết quả tỷ lệ cá chết và tái phân lập

Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng dọc nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P > 0.05)

Ở phương pháp ngâm và tiêm, tỷ lệ chết ở nghiệm thức đối chứng thấp hơn có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ tin cậy 95% (P < 0.05) so với các nghiệm thức còn lại Cá chết ở nghiệm thức đối chứng là do một số cá đã bị xây xát trong quá trình vận chuyển cá vào các bể thí nghiệm

và bị sốc do tiêm Khi tái phân lập thì ở nghiệm thức đối chứng hoàn toàn không phân lập được

vi khuẩn, ở các nghiệm thức còn lại vi khuẩn luôn được phân lập từ các thực thể thí nghiệm

Mặc dù tỷ lệ cá chết tăng dần theo mật độ vi khuẩn thí nghiệm, tuy nhiên không có sự khác biệt về tỷ lệ chết giữa hai phương pháp gây cảm nhiễm bệnh tiêm và ngâm (P>0.05) Tuy nhiên, kết quả cho thấy mật độ vi khuẩn càng cao thì tỉ lệ cá chết càng nhiều Ở nghiệm thức có

46.67% ở phương pháp ngâm

Liều LD50 của vi khuẩn Streptococcus agalactiae

Trong quá trình nuôi, đến ngày thứ 10, bắt đầu xuất hiện bể có 50% số cá chết

Vi khuẩn luôn được tái phân lập từ các thực thể thí nghiệm nên thể hiện vai trò của vi khuẩn trong quá trình diễn tiến bệnh lý của cá

Bảng 6: Kết quả LD 50 của vi khuẩn Streptococcus agalactiae

Ghi chú: (-) không xác định được LD 50

Hình 2: Cá thí nghiệm bị mù mắt

và trương bụng sau 4 ngày gây

bệnh

Hình 3: Cá thí nghiệm bị mù mắt

và trương bụng sau 4 ngày gây

bệnh

Nghiệm

thức

Ở phương pháp ngâm, thời gian để vi khuẩn làm chết 50% số cá thí nghiệm là 14 ngày chậm hơn phương pháp tiêm 2 ngày, đồng thời liều vi khuẩn gây chết 50% số cá thí nghiệm của

trong cùng điều kiện thí nghiệm, do ở phương pháp tiêm vi khuẩn được đưa trực tiếp vào cơ thể

cá, trong khi đó ở phương pháp ngâm vi khuẩn được pha vào nước cần có thời gian xâm nhập vào cơ thể ký chủ, quá trình này còn phụ thuộc vào khả năng đề kháng của cá

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch của cá

Tăng trọng của cá thí nghiệm

Tăng trọng của cá ăn khẩu phần 55% Protein cao hơn có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại Nghiệm thức 50% Protein cho sự tăng trọng của cá thấp nhất có ý nghĩa

về mặt thống kê (P>0.05) Điều này cho thấy sự khác biệt hàm lượng protein tác động đến tăng trọng của cá thí nghiệm, tuy nhiên việc bổ sung β glucan ảnh hưởng không đáng kể đến tăng trọng cá thí nghiệm trong 14 ngày nuôi Ở cá ăn khẩu phần proetin 50%, sự bổ sung β-glucan Để đạt mục tiêuglucan cho thấy sự tăng trọng cao hơn với khẩu phần không bổ sung β-glucan Để đạt mục tiêuglucan (1.11 so với 0.75) Khẩu phần thức ăn bổ sung β-glucan Để đạt mục tiêuglucan thương mại như EcoActiva cho thấy sự tăng trưởng rõ ràng trên

cá pink snapper (Cook et al., 2001), cá Rohu (Misra et al., 2006), large yellow croaker (Ai et al., 2007)

Tỷ lệ cá sống là 100% giữa các nghiệm thức Điều này chứng tỏ việc bổ sung β glucan không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của cá

Bảng 7: Tăng trọng của cá thí nghiệm

Chỉ tiêu

Nghiệm thức 50%P + β-glucan Để đạt mục tiêuglucan 50%P 55%P + β-glucan Để đạt mục tiêuglucan 55%P

Ghi chú: Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng ngang nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P>0.05)

Kết quả đáp ứng miễn dịch của cá

Gây cảm nhiễm bệnh cho cá nuôi thí nghiệm sau 14 ngày cho ăn β–glucan để xem khả

mL (đã được xác định ở thí nghiệm 1) cho 4 nghiệm thức Thí nghiệm được theo dõi trong 14 ngày, cá chết hay hấp hối đều được ghi nhận và mổ khám bệnh tích Các dấu hiệu ở các nghiệm

thường có biểu hiện bên ngoài là xuất huyết toàn thân, vây ngực, vây đuôi, một số con bị lồi mắt Bệnh tích bên trong ghi nhận được là gan nhạt màu, thận sưng, lách sưng, tích dịch xoang bụng,

có trường hợp bóng khí phình to Sau khi mổ khám bệnh tích, các mẫu gan, thận, lách được cấy trên đĩa môi trường BHIA và định danh sơ bộ

Bảng 8: Kết quả cá chết và tái phân lập giữa các nghiệm thức

Ghi chú: Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng dọc nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P > 0.05)

Ở cá ăn sử dụng khẩu phần có bổ sung β-glucan Để đạt mục tiêuglucan (nghiệm thức T I và T III) đều cho tỉ lệ

cá chết thấp nhất có ý nghĩa thống kê (P<0.05) Điều này chứng tỏ β-glucan Để đạt mục tiêuglucan có tác động làm tăng khả năng đề kháng của cá với mầm bệnh Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Dharmendra (2012), khẩu phần có bổ sung β-glucan Để đạt mục tiêuglucan cho thấy sự cải thiện về sức khỏe, và tăng trưởng ở nhiều nhóm động vật khác nhau như tôm, cá và những động vật trên cạn khác Theo Ai và cộng sự (2007), β-glucan Để đạt mục tiêuglucan có khả năng tăng cường khả năng bảo vệ cho cá croaker đề kháng vi khuẩn

Vibrio harveyi Tương tự, β-glucan Để đạt mục tiêuglucan tăng cường sức đề kháng cho cá da trơn (Aisan catfish) với vi

khuẩn Aeromonas hydrophila (Kumari and Sahoo, 2006), cá Rohu với vi khuẩn Edwardsiella

tarda (Sahoo and Mukherjee, 2001).

Hàm lượng protein 50 và 55% không cho thấy sự sai khác về mặt thống kê ở tỉ lệ chết (nghiệm thức T II và T IV) Kết quả này cho thấy hàm lượng đạm trong thức ăn không có tác động làm tăng khả năng đề kháng của cá với mầm bệnh

Thí nghiệm 3: Thử nghiệm kháng sinh đồ

Tiến hành thử nghiệm với 15 loại kháng sinh penicillin (Pn), ampicilin (Am), ceftriaxone (Cx), cefaclor (Cr), gentamycin( Ge), kanamycin (Kn), spectinomycin (Sp), erythromycin (Er), tylosin (Ty), tetracycline (Te), doxycyclin (Dx), oxytetracyclin (Ox), norfloxacin (Nr), nitrofurantoin (Fr), rifampin (Rf)

Bảng 9: Đường kính vòng vô khuẩn trung bình

Kháng

sinh

Đường kính vòng kháng khuẩn đo được

Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình

Nhận xét Lần lặp lại thứ

Hình 4: Vi khuẩn phân lập từ cá bệnh cấy thuần trên đĩa thạch sau 24 giờ ủ ở 30 o C

Am 22 21 21.5 Kháng

Kết quả thu được như sau:

Vi khuẩn Streptococcus agalactiae kháng với các loại kháng sinh sau: Pn, Am, Ty.

Vi khuẩn Streptococcus agalactiae nhạy với các loại kháng sinh sau: Cr, Ge, Kn, Te, Ox, Dx,

Rf, Cx, Nr, Sp và ít nhạy với kháng sinh: Er và Fr

Hình 5: Vòng kháng khuẩn các kháng sinh Thí nghiệm 4: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC

Từ kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán kháng sinh, một số

loại kháng sinh cho kết quả nhạy và ít nhạy trên Streptococcus agalactiae để tiếp tục thử nghiệm

kháng sinh đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp, nhằm xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh có thể ngăn cản sự tăng trưởng của vi khuẩn

Bảng 10: Kết quả thử nghiệm xác định MIC của một số kháng sinh trên vi khuẩn

Streptococcus agalactiae

Oxytetracycli

Kết quả cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của các loại kháng sinh trong thí nghiệm trên

vi khuẩn Streptococcus agalactiae là khác nhau, trong đó nồng độ của kháng sinh cefaclor là cao

nhất (8.192 µg/mL), nồng độ của kháng sinh erythromycin là thấp nhất (0.512 µg/mL)

Có nhiều dạng kháng thuốc như: đề kháng tự nhiên, đề kháng sinh học, đề kháng điều

trị… Nhưng trong nghiên cứu này, khả năng đề kháng tự nhiên của Streptococcus agalactiae

được loại trừ Đề kháng tự nhiên được hiểu là hiện tượng mỗi loài sinh vật sẽ có khả năng không

bị ức chế hoặc tiêu diệt bởi một số kháng sinh nhất định Ví dụ như nấm, virus, nguyên sinh động vật, do trên thành tế bào không có lớp peptidoglucan nên không chịu tác động của kháng sinh β-glucan Để đạt mục tiêulactam (cefalor) Khả năng đề kháng sinh học là sự đề kháng ngẫu nhiên của vi sinh vật gây bệnh đã hình thành trong quần thể vi sinh vật gây bệnh trước khi tiếp xúc với môi trường chứa chất kháng sinh Đây là hiện tượng xảy ra không phổ biến, nguyên nhân có thể do đột biến ngẫu nhiên nhiễm sắc thể nên trong quần thể vi sinh vật gây bệnh sẽ xuất hiện một (hoặc vài tế bào) có khả năng kháng thuốc Do đó, ở lần điều trị bệnh đầu tiên sẽ có dấu hiệu giảm nhưng sẽ bùng phát trở lại ngay sau đó vì chỉ có tế bào vi sinh vật thường bị tiêu diệt, còn các tế bào vi sinh vật kháng thuốc vẫn còn sống sót, tiếp tục sinh trưởng bù đắp cho tế bào đã bị tiêu diệt Hậu quả là chúng làm thay đổi bản chất của vi sinh vật gây bệnh và vô hiệu hóa tác dụng điều trị của thuốc kháng sinh đó trong tất cả các lần điều trị sau này Như vậy, với tình hình bệnh trên cá rô

phi đỏ do Streptococcus sp thì Streptococcus sp không có đề kháng sinh học với các loại kháng

sinh trên Từ đó, khả năng điều trị được cân nhắc đến Thực tế cho thấy, khả năng đề kháng điều trị của vi sinh vật gây bệnh xuất hiện rất phổ biến sau khi tiếp xúc nhiều với một loại kháng sinh

Hiện nay, đa số người nuôi sử dụng nhóm β-glucan Để đạt mục tiêulactamine (kháng sinh cefalor) và nhóm aminoglycoside (gồm gentamycin và kanamycin) trong việc điều trị bệnh Chính vì vậy, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu của cefalor là cao nhất (8.192 µg/mL), kế tiếp là kanamycin (6.827 µg/mL), và gentamycin (5.461 µg/mL) Trong khi đó, các nhóm kháng sinh còn lại ít được lựa chọn trong việc trị bệnh như rifampin (có tác dụng gắn với enzyme mRNA polymerasa ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA) Vì vậy, nồng độ ức chế tối thiểu của

rifampin khá thấp (1.024 µg/mL) Như vậy, kết quả của MIC đối với chủng Streptococcus

agaalactiae trong phòng thí nghiệm khá phù hợp với thực tế sử dụng thuốc của người dân (Đạt

and Tuyền, 2005, Uyên, 2005) Tuy nhiên, mặc dù nhóm Macrolide (kháng sinh erythromycin)

là một trong những kháng sinh được người dân lựa chọn khá nhiều trong việc điều trị nhưng vẫn cho nồng độ MIC thấp (0,512 µg/mL) Điều này có thể được giải thích rằng nhóm Macrolide có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp protein, chúng gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã của các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide, nên việc điều trị khá hiệu quả và khả năng kháng thuốc thấp

Tóm lại, kết quả nồng độ MIC của các loại kháng sinh đối với chủng Streptococcus

agaalactiae phân lập ở khu vực Quận 9 TPHCM cho kết quả khá phù hợp với những cuộc điều

tra về việc sử dụng thuốc của người dân trong việc điều trị cá rô phi đỏ Để giải quyết tình trạng