PHÂN LẬP VI KHUẨN STREPTOCOCCUS AGALACTIAE TÝP 2 GÂY BỆNH PHÙ MẮT VÀ XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ ĐIÊU HỒNG OREOCHROMIS SP. Trương Quỳnh Như, Huỳnh Nguyễn Xuân Nghi và Đặng Thị Hoàng Oanh Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ; TÓM TẮT Chín chủng vi khuẩn Streptococcus phân lập từ cá điêu hồng bị bệnh phù mắt và xuất huyết được định danh là Streptococcus agalactiae bằng kít API 20 Strep (BioMerieux, Pháp). Chúng cho phản ứng âm tính với Esculin và Pyrrolidonyl Arylamidase, dương tính với Voges Proskauer, có khả năng thủy phân hippuric acid, không có khả năng acid hóa hầu hết tất cả các loại đường. Tuy nhiên, có 33,3% chủng vi khuẩn cho phản ứng Arginine Dihydrolase dương tính. Các chủng vi khuẩn S. agalactiae được xác định có kiểu sinh học (biotýp) là týp 2 bằng phương pháp ngưng kết miễn dịch sử dụng kít Strep-B-Latex (GBS) (Đan mạch) để nhận dạng kiểu huyết thanh (serotýp) Ib. Các chủng vi khuẩn được lập kháng sinh đồ với 12 loại kháng sinh phổ biến trong nuôi trông thủy sản. Kết quả cho thấy 100% nhạy với tetracylin, doxycyclin, florfernicol và amoxicillin trong khi 88,9% số chủng thử nghiệm kháng với norfloxacin. Từ khóa: cá Điêu Hồng, Streptococcus agalactiae, ngưng kết miễn dịch, API 20 Strep 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Nghề nuôi trồng thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long không ngừng phát triển trong những năm qua đã cải thiện được đời sống kinh tế cho người dân và góp phần nâng cao nguồn ngoại tệ cho đất nước. Bên cạnh việc nuôi và chế biến xuất khẩu cá da trơn thì cá điêu hồng cũng đang dần dần trở thành đối tượng nuôi đặc biệt được chú ý do đây là loài dễ nuôi, chất lượng thịt ngon, có khả năng thích ứng cao với các điều kiện môi trường. Xuất phát từ những nhu cầu về thị trường, nghề nuôi cá điêu hồng được thâm canh hóa với nhiều hình thức nuôi và nhất là nuôi với mật độ cao. Tuy nhiên sự thâm canh hóa cũng dẫn đấn tình trạng dịch bệnh xảy ra nhiều hơn và gây thiệt hại ngày càng nghiêm trọng hơn. Trong số các bệnh thường gặp ở cá rô phi nói chung và cá điêu hồng nói riêng thì bệnh phù mắt và xuất huyết do vi khuẩn Streptococcus gây ra, là một trong những bệnh nguy hiểm nhất. Vi khuẩn có thể tấn công ở mọi giai đoạn phát triển của cá (Amal và ctv., 2008). Streptococcus là một họ vi khuẩn có hình cầu, Gram dương rất đa dạng về thành phần loài và kiểu huyết thanh huyết thanh và dễ nhầm lẫn với những nhóm cầu khuẩn khác về kiểu hình và đặc tính sinh lý, sinh hóa. Việc quản lí dịch bệnh kém hiệu quả đang là vấn đề quan tâm hàng đầu của người nuôi cá. Một trong những ảnh hưởng lớn nhất đó là không xác định chính xác được tác nhân gây bệnh. Mặc dù có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, sinh hóa, kiểu huyết thanh và khả năng gây bệnh của vi khuẩn Streptococcus phân lập từ cá rô phi nuôi ở một số nước thuộc vùng Đông Nam Châu Á đã được công bố, nhưng thông tin về đặc điểm của vi khuẩn này ở Việt nam còn rất hạn chế. Do vậy, trong báo cáo này đặc điểm sinh hóa, kiểu huyết thanh và tính nhạy của vi khuẩn Streptococcus phân lập từ cá điêu hồng bị bệnh phù mắt và xuất huyết với một số loại thuốc kháng sinh được sử dụng phổ biến trong nuôi thủy sản được trình bày nhằm cung cấp thông tin cho việc phòng trị hiệu quả bệnh vi khuẩn ở cá điêu hồng. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chín chủng vi khuẩn được phân lập từ cá điêu hồng bị bệnh phù mắt và xuất huyết thu ở Trại nuôi cá điêu hồng thương phẩm ở huyện Cai Lây, tỉnh Tiền Giang. Vi khuẩn sau khi được tách ròng và kiểm tra một số đặc điểm đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa cơ bản được xác định là vi khuẩn thuộc họ Streptococcus. Vi khuẩn được trữ trong môi trường brain heart broth (BHB, Merck) có bổ sung 25% glycerol và giữ ở -80 o C. 2.2 Phương pháp nghiên cứu a) Xác định các đặc tính sinh hóa Đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn nghiên cứu được xác định bằng kit API 20 Strep (BioMerieux, Pháp) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bộ kit API 20 Strep chỉ được thực hiện với các chủng vi khuẩn hình cầu, Gram dương và cho phản ứng Catalase dương tính. Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường brain hear agar (Merck), ở 35- 37 o C trong 18 giờ. Phương pháp: Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm trong quá trình ủ. Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho vào ống nghiệm có 2ml nước cất hoặc nước muối sinh lý (0.85% NaCl) 2 ml, lắc đều, so màu với ống McFarland 4. Trong 10 ô đầu của bộ kit, dùng pipet với đầu col tiệt trùng hút 100 µl dung dịch vi khuẩn cho vào các ô từ VP đến LAP, đối với ô ADH cho vừa đủ. Chuyển phần dung dịch còn lại (khoảng 0.5 ml) vào dung dịch GP Medium, lắc đều. Cho vừa đủ dung dịch vi khuẩn mới này vào 10 ô còn lại (từ RIB đến GLYG). Cho dầu khoáng vào các ô từ ADH đến GLYG. Ủ trong tủ ấm ở 35-37 o C, đọc kết quả sau 4 giờ và sau 24 giờ. Đọc kết quả: Sau 4 giờ, VP: nhỏ 1 giọt của mỗi loại thuốc thử VP1 và VP2; HIP: nhỏ 2 giọt thuốc thử NIN; PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL và LAP: nhỏ 1 giọt cho mối loại thuốc thử Zyme A và Zyme B; các chỉ tiêu còn lại không cần sử dụng thuốc thử. Đọc kết quả sau 10 phút và đem ủ lại trong tủ ấm. Sau 24 giờ, đọc lại kết quả các ô ESC, ADH, và các ô từ RIB đến GLYG; không đọc lại các ô đã thử thuốc thử: VP, HIP, PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL và LAP. Kết quả được xác định là dương hay âm tính dựa trên sự chuyển màu ở các ô tương ứng. b) Xác định kiểu huyết thanh Kiểu huyết thanh của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp ngưng kết miễn dịch bằng kit Strep-B-Latex (GBS) (Statens Serum Institut, Đan mạch) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch latex được để ở nhiệt độ phòng và lắc đều trước khi sử dụng. Hai giọt dung dịch latex (khoảng 10 µl/giọt) được nhỏ lên hai lam. Dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng từ 3-5 khuẩn lạc cho vào 3ml nước muối sinh lý, lắc đều rồi nhỏ một giọt dung dịch vi khuẩn lên một lam. Một giọt nước muối sinh lý được nhỏ lên lam còn lại để làm đối chứng âm. Dùng tâm tiệt trùng trộn đều 2 dung dịch. Phản ứng dương tính sẽ có ngưng kết xuất hiện trong 5 – 10 giây. Kết quả dương tính khi sử dụng Strep-B-Latex giúp xác định vi khuẩn Streptococus có kiểu huyết thanh Ib (serotype Ib) hay kiểu sinh học 2 (biotype 2). c) Lập kháng sinh đồ Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn được xác định theo phương pháp của Geert và ctv (2005) có điều chỉnh. Vi khuẩn được cấy trên môi trường BHA (Merck) ở 35°C trong vòng 24 giờ. Tính ròng của vi khuẩn sau khi phục hồi được kiểm tra bằng cách quan sát sự đồng nhất về hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và nhuộm Gram. Các khuẩn lạc ở mỗi đĩa BHA sau 24 giờ nuôi cấy được nhặt bằng que cấy và cho vào ống nghiệm có chứa 5ml dung dịch 0.85% NaCl để tạo dung dịch vi khuẩn (mật độ khoảng 3x10E8 CFU/mL) có độ đục tương ứng với dung dịch chuẩn 1.0 McFarland. Sau đó, 100 L dung dịch vi khuẩn được tán đều trên bề mặt đĩa MHA (Muller hinton agar). Sau đó, 4 loại đĩa kháng sinh cần lập kháng sinh đồ được đặt trên mặt thạch và ủ ở 35°C. Sau 24 giờ, Đường kính vòng tròn vô trùng được đo bằng mm, dòng vi khuẩn trên đĩa ISA tương ứng sẽ được xác định là kháng, nhạy hay trung gian với kháng sinh thử nghiệm dựa theo hướng dẫn của NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). Các loại kháng sinh được lập kháng sinh đồ gồm có: ampicillin (AM/10µg), amoxicillin (AML/25µg), cefazolin (CZ/30µg), ciprofloxacin (CIP/5µg), doxycyclin (DO/30µg), enrofloxacine (ENR/5µg), florfenicol (FFC/30µg), gentamicin (GM/10µg), neomycin (N/30µg), Trimethoprim/sulfamethoxazole (SXT/1.25/23.75µg), norfloxacin (NOR/5µg), tetracyclin (TE/30µg). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep Vi khuẩn phân lập từ cá điêu hồng bị bệnh phù mắt và xuất huyết là vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, hơi mờ, kích thước khoảng 1mm, phát triển chậm trên môi trường BHA sau 48 giờ ở 30 o C. Chúng là vi khuẩn Gram dương, có hình dạng là hình song cầu hay liên cầu (hình 1), cho phản ứng catalase và oxidase âm tính và không có khả năng gây tan huyết. Hình 1. Hình dạng S. agalactiae (100X) Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng kit API 20 Strep (Bảng 1) cho thấy 100% (9/9 chủng) các chủng vi khuẩn cho phản ứng âm tính với Esculin và Pyrrolidonyl Arylamidase, dương tính với Voges Proskauer, có khả năng thủy phân hippuric acid, không có khả năng acid hóa hầu hết tất cả các loại đường. Tuy nhiên, có 33,3% (3/9 chủng) chủng vi khuẩn cho phản ứng Arginine Dihydrolase dương tính. Dựa trên các chỉ tiêu sinh hóa và căn cứ vào mã số định danh của kit API 20 Strep, tất cả 9 chủng vi khuẩn được định danh là Streptococcus agalactiae. Kết quả này tương tự như kết quả của Buller (2004) khi định danh vi khuẩn S. agalactiae dựa trên các phản ứng sinh hóa của kit API 20 Strep. Ngoài ra, Salvador và ctv. (2005) cũng định danh S. agalactiae với các chỉ tiêu tương tự. Bảng 1. Kết quả kiểm tra bằng kit API 20 Strep 9 chủng vi khuẩn Chỉ tiêu Chủng vi khuẩn ĐH1 Não ĐH1 Thận ĐH3 Não ĐH3 Thận ĐH3 Gan ĐH4 Thận ĐH4 Não ĐH5 Thận ĐH5 Não Voges Proskauer + + + + + + + + + Hippurate hydrolysis + + + + + + + + + Bile-esculin tolerance - - - - - - - - - Pyrrolidonyl arylamidase - - - - - - - - - α-galactosidase - - - - - - - - - β-glucuronidase - - - - - - - - - β-galactosidase - - - - - - - - - Alkaline phosphatase + + + + + + + + + Leucine AminoPeptidase + + + + + + + + + Arginine Dihydrolase - + + - + - - - - Ribose - - - - - - - - + Arabinose - - - - - - - - - Manitol - - - - - - - - - Sorbitol - - - - - - - - - Lactose - - - - - - - - - Trehalose - - - - - - - - + Inulin - - - - - - - - - Raffinose - - - - - - - - - Amidon - - - - - - - - - Glycogen - - - - - - - - - Ghi chú: (-) âm tính; (+) dương tính 3.2 Kết quả ngưng kết miễn dịch Phản ứng ngưng kết miễn dịch dựa trên nguyên tắc của sự liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể có thể nhìn thấy được ở dạng kết khối (Gella và ctv, 1991). Trong nghiên cứu này, phản ứng ngưng kết miễn dịch giúp phát hiện nhanh và nhận dạng kiểu huyết thanh (serotýp) Ib của vi khuẩn S. agalactiae. Kết quả đáng chú ý là tất cả các chủng (9/9 chủng) được kiểm tra đều cho phản ứng ngưng kết serotýp Ib dương tính (Hình 2), chứng tỏ rằng tất cả các chủng vi khuẩn này đều là S. agalactiae týp 2. Hình 2. Kết quả phản ứng ngưng kết miễn dịch của các chủng vi khuẩn S. agalactiae thử nghiệm. A) Phản ứng âm tính và B) Phản ứng dương tính. 3.3 Kết quả kháng sinh đồ Kết quả kháng sinh đồ cho thấy tất cả 9 chủng vi khuẩn S. agalactiae đều nhạy với hai loại thuốc kháng sinh thuộc nhóm tetracyclin là tetracylin và doxycyclin. Đồng thời, florfernicol và amoxicillin cũng cho kết quả nhạy 100%. Hầu hết các chủng vi khuẩn đều nhạy với ampicillin và cefazolin, với kết quả 88,9% cho mỗi loại. Riêng đối với hai loại kháng sinh gentamicin và trimethorime+sulfamethoxazol cho kết quả nhạy thấp hơn, khoảng 70% mỗi loại. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn S. agalactiae đã kháng cao với norfloxacin (88,9%) tương đương 8/9 chủng. Bảng 2. Tỷ lệ phần trăm nhạy, nhạy trung bình và kháng của 9 chủng vi khuẩn S. agalactiae với 12 loại kháng sinh STT Kháng sinh Nhạy (%) Nhạy trung bình (%) Kháng (%) Beta-lactanin 1 Ampicilin 88,9 0 11,1 2 Amoxicillin 100 0 0 3 Cefazoline 88,9 0 11,1 Fenicol 4 Florfenicol 100 0 0 Aminoglycoside 5 Gentamicin 66,7 22,2 11,1 6 Neomycin 0 88,9 11,1 Tetracyclin 7 Tetracyclin 100 0 0 8 Doxycyclin 100 0 0 Quinolon 9 Ciprofloxacin 88,9 0 11,1 10 Enrofloxacin 33,3 66,7 11,1 11 Norfloxacin 11,1 0 88,9 Khác 12 Trimethorime+sulfamethoxazol 66,7 0 33,3 AM: ampicillin (10µg), AML: amoxicillin (25µg), CZ: cefazolin (30µg), CIP: ciprofloxacin (5µg), DO: doxycyclin (30µg), ENR: enrofloxacine (5µg), FFC: florfenicol (30µg), GM: gentamicin (10µg), N: neomycin (30µg), SXT: Trimethoprim/sulfamethoxazole (1.25/23.75µg), NOR: norfloxacin (5µg), TE: tetracyclin (30µg). 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Sử dụng kit API 20 Strep kết hợp với phương pháp ngưng kết miễn dịch đã định danh được 9 chủng vi khuẩn gây bệnh phù mắt và xuất huyết trên cá điêu hồng là vi khuẩn S. agalactiae týp 2. Phương pháp ngưng kết miễn dịch giúp xác định nhanh và xác định kiểu serotýp của loài vi khuẩn này để kịp thời phòng trị bệnh. Hầu hết tất cả các chủng vi khuẩn đều nhạy với các loại thuốc kháng sinh thuộc nhóm Beta-lactanin, Fenicol, Tetracyclin nhưng phần lớn kháng với norfloxacin. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Amal, A.M.N. , N. Nazifah, A.S. Zahrah, M.V. Sabri, M.Z. Saad, 2008. Determination of LD 50 for Streptococcus agalactiae infections in red tilapia and gift. 8 th International Symposium on Tilapia in Aquaculture. 1245-1251. 2. Buller, N.B., 2004. Bacteria from fish and other aquatic animals: a practice identification manual, 361 pp. 3. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)., 2006a. Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests of bacteria isolate from aquatic animals; approve standard, third edition, M31-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, NJ. 4. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)., 2006b. Methods for broth dilution susceptibility testing of bacteria isolate from aquatic animals; informational supplement, M49-A. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, NJ. 5. Rogério Salvador, Ernst Eckehardt Muller, Julio César de Freitas, Julio Hermann Leonhadt, Lucienne Garcia Pretto-Giordano, Juliana Alves Dias, 2005. Isolation and characterization of Streptococcus spp. group B in Nile tilapias (Oreochromis niloticus) reared in hapas nets and earth nurseries in the northern region of Parana State, Brazil. Ciência Rural, Santa Maria, v.35, n.6, p.1374-1378. 6. F. Javier Gella, Josep Serra and Juan Gener, 1991. Latex agglutination procedures in Immunodiagnosis. Pure&App/. Chem.,Vol.63, No.8, pp. 1131-1134. ABSTRACT Nine Streptococcus bacterial strains were isolated from diseased red tilapia (Oreochromis sp) which displayed popeye and small skin haemorrhage as clinical signs. These bacteria were identified as Streptococcus agalactiae by using API 20 Strep test kit (BioMerieux, Pháp). The bacteria gave negative reaction with Esculin and Pyrrolidonyl Arylamidase, positive reaction with Voges Proskauer and hippuric acid, unable to produce acid from most of carbohydrates and some of the strains exposed positive Arginine Dihydrolase (33,3%). All strains were determined to belong biotype 2 by slide agglutination test using Strep-B-Latex kit (GBS) (Denmark) which was detected serotype Ib. Strains were subjected to antibiotic sensitivity test with 12 common antibiotic in aquaculture. The result showed that all isolates were susceptive to tetracylin, doxycyclin , florfernicol, amoxicillin, where as most of isolates showed resistance to norfloxacin (88,9%). Key words: Orreochromis sp, Streptococcus agalactiae, latex agglutination, API 20 Strep. . PHÂN LẬP VI KHUẨN STREPTOCOCCUS AGALACTIAE TÝP 2 GÂY BỆNH PHÙ MẮT VÀ XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ ĐIÊU HỒNG OREOCHROMIS SP. Trương Quỳnh Như, Huỳnh Nguyễn Xuân Nghi và Đặng Thị Hoàng. vi c phòng trị hiệu quả bệnh vi khuẩn ở cá điêu hồng. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1 Vật liệu nghiên cứu Chín chủng vi khuẩn được phân lập từ cá điêu hồng bị bệnh phù mắt và xuất. vi khuẩn gây bệnh phù mắt và xuất huyết trên cá điêu hồng là vi khuẩn S. agalactiae týp 2. Phương pháp ngưng kết miễn dịch giúp xác định nhanh và xác định kiểu serotýp của loài vi khuẩn này