Nguyên liệu và phơng pháp 2.1 Nguyên liệu
2.2.2 Phơng pháp điện d
2.2.2.1. Kỹ thuật điện di phân tích DNA bằng gel agarose Hoá chất
- Agarose 0,8 - 1%;
- Dung dịch TBE 5X: Tris base 54g/l; a xít boric 27,5g/l; EDTE 0,5M 20 ml/l, pH 8,0 - Ethidium bromide(EtBr) 10mg/ml.
- Đệm tra mẫu: 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3 ml glicerol 100% và dẫn nớc đến 1ml.
Qui trình
- Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8 hoặc 1 g agarose hoà trong 100ml dung dịch TBE 0,5X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn (Nếu quá trình đun bị mất nhiều nớc thì phải thêm nớc cho đủ 100ml). Để nguội xuống khoảng 50- 60
0C , đổ dung dịch vào khay gel điện di có cài sẵn răng lợc. Sau 30 - 60 phút , khi gel agarose đã đông cứng gỡ khay gel và đặt vào bể điện di. Đổ TBE 0,5X ngập mặt gel ~2mm., tháo lợc ra khỏi bản gel.
- Tra mẫu: Mẫu DNA đợc trộn với đệm tra mẫu theo tỉ lệ 1V mẫu : 1V đệm 1X và nhỏ vào các giếng tra mẫu trên bản gel.
- Chạy điện di: điện thế từ 60 -80 V. DNA di chuyển từ cực âm sang cự dơng. Quan sát sự di chuyển bằng màu bromophenol blue để biết lúc nào ngừng điện di. - Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel đợc lấy ra khỏi khay và ngâm vào dung dịch EtBr 0,5 mg/l trong thời gian khoảng 15 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó rửa bản gel bằng nớc và soi dới ánh sáng tử ngoại 300nm trên máy soi DNA, chụp ảnh bằng phim polaroit.
2.2.2.2 Phơng pháp điện di protein bằng gel acrylamide Hoá chất:
- Dung dịch hỗn hợp acrylamide: 30% acrylamide: 0,8%bisacrylamide - Dung dịch đệm gel tách: 1,5M Tris-HCl; 10% SDS, pH 8,8
- Dung dịch đệm gel cô: 1M Tris-HCl; 10%SDS, pH6,8 - 10% ammonium persulfate
- TEMED
- Đệm tra mẫu: 50mM Tris-HCL pH6,8; 100mM dithiothreitol; 2%SDS; 1% Bromophenol blue; 10% glycerol
- Đệm điện di: 25mM Tris-HCl; 250mM glycine; 0,1% SDS, pH8,5
- Dung dịch Coomassie Brilliant Blue: 0,25g Coomassie Brilliant Blue tan trong hỗn hợp 45ml metanol : 45ml H2O : 10ml axit acetic
- Dung dịch rửa gel: 30% metanol : 10% axit acetic
Qui trình:
- Chuẩn bị gel tách 12% acrylamide: Hoá chất đợc làm ấm ở nhiệt độ phòng và đợc trộn theo thứ tự trong bảng: Thành phần Nồng độ gel 12% (10ml/gel) H2O Dung dịch hỗn hợp acrylamide Dung dịch đệm gel tách 4,55ml 3,30ml 1,25ml
Ammonium persulfate
TEMED 100àl
5àl
Trộn đều và đổ hỗn hợp gel tách vào khuôn tránh tạo bọt khí trong gel, lấp đầy bề mặt bằng nớc cất và giữ nguyên vị trí trong 30' cho gel đông. Sau khi gel đông, đổ bỏ nớc cất trên mặt trên gel, thấm khô bằng giấy thấm và tiếp tục đổ gel cô. Hỗn hợp gel cô đợc trộn theo thứ tự bảng sau
Thành phần Nồng độ gel 5% (3ml/gel)
H2O
Dung dịch hỗn hợp acrylamide Dung dịch đệm gel cô
Ammonium persulfate TEMED 1,80ml 0,40ml 0,75ml 30àl 3àl
Đổ hỗn hợp vào khuôn gel bên trên gel tách, đặt răng lợc tránh tạo bọt và giữ nguyên vị trí bản gel cho đến khi gel đông (khoảng 30'). Sau đó tháo lợc khỏi bản gel, lắp bản gel vào máy điện di và đổ đầy đệm điện di và tra mẫu. Mẫu đợc trộn với đệm tra mẫu theo tỉ lệ 1:1 và đợc tra vào giếng tra mẫu bằng sylanh.
Máy điện di đợc nối với nguồn điện với hiệu điện thế ~60-80V, cho đến khi vạch mầu di chuyển gần hết bản gel (khoảng 90'). Tháo gel khỏi khuôn và đặt vào dung dịch nhuộm lắc nhẹ trong 4h ở nhiệt độ phòng
Lấy gel khỏi dịch nhuộm và lắc rửa trong dung dịch rửa cho đến khi bản gel trở lên trắng. Lấy gel quan sát và chụp ảnh