Kết quả và thảo luận
3.6 Kiểm tra trình tự gen PRSVN nhận đợc bằng cắt với các enzim giới hạn
sử dụng chơng trình Mapdraw của phần mềm DNAstar để phân tích bản đồ
enzim cắt hạn chế của gen PRSVN. Trình tự gen PRSVN chứa hơn 140 vị trí nhận biết của các enzim khác nhau. Nhng chúng tôi chỉ chọn một số enzim Xba I (2), Dra I (278), Nru I (592), Nde I (728), Ban II (717, 905) and Sac I (905) để kiểm tra sự chính xác của trình tự gen nhận đợc.
ảnh 5: Kiểm tra trình tự gen PRSVN nhận đợc bằng cắt với các enzim giới hạn Dòng M: Marker 1Kb
Dòng 1: pCR2.1-PRSVN đợc cát với Xba I & Sac I Dòng 2: pCR2.1-PRSVN đợc cát với Dra I & Sac I Dòng 3: pCR2.1-PRSVN đợc cát với Xba I & Ban II Dòng 4: pCR2.1-PRSVN đợc cát với Xba I & Nde I Dòng 5: pCR2.1-PRSVN không cắt
ở dòng 1, băng ADN ~900bp đã quan sát đợc. Đó là băng ADN của gen PRSVN. Trong các dòng 2, 3, 4 các băng ADN khác nhau cũng đã nhận đợc tơng ứng với kích thứơc ~630bp, ~715bp và ~725bp. Các băng này đợc cắt từ gen PRSVN theo đúng nh trình tự gen qui định. Điều này chứng tỏ trình tự gen nhận đ- ợc là chính xác.
3.7 Thiết kế vector chuyển gen mang gen PRSVN
Trớc tiên gen PRSVN đợc tách bằng cắt với hai enzim Xba I và Sac I, rồi đợc
đa vào vector p2K7 bằng T4 ligase để tạo ra cấu trúc với 35S promoter và Nos terminator. Vector tái tổ hợp này đợc biến nạp vào E. coli TOP 10F' và đợc chọn lọc bằng khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trờng LB đặc có 50mg/l kanamycin. Các khuẩn lạc tiếp tục đợc sàng lọc bằng PCR và tách plasmid để cắt với enzim giới hạn (ảnh 6).
Dòng 1, chúng tôi đã nhận băng ADN ~900bp và ~ 6Kb. Băng 900bp là gen PRSVN và 6Kb là phần của vector p2K7. Trong các dòng 3, 4, 5 các băng ADN cũng đã nhận đợc tơng ứng ~630bp, ~725 và ~ 590 là các băng đợc cắt ra từ gen PRSVN. Dòng 6 có băng ADN ~ 2,8Kb là gen PRSVN gắn với 35S promoter và Nos terminater. Kết quả này cho thấy gen PRSVN đã đợc gắn 35S promoter và Nos terminator trong p2K7 vector.
ảnh 6: Phân tích enzim giới hạn để kiểm tra cấu trúc vector p2K7 có chứa gen PRSVN
Dòng M: Marker 1Kb
Dòng 1: p2k7-PRSVN đợc cắt với Xba I & Sac I Dòng 2: p2k7-PRSVN đợc cắt với Xba I & Ban II Dòng 3: p2k7-PRSVN đợc cắt với Dra I & Sac I Dòng 4: p2k7-PRSVN đợc cắt với Xba I & Nde I Dòng 5: p2k7-PRSVN đợc cắt với Xba I & Nru I Dòng 6: p2k7-PRSVN đợc cắt với Hind III & Kpn I Dòng 7: p2k7-PRSVN không cắt
Cấu trúc 35S pro - gen PRSVN - Nos ter (băng 2,8Kb) đã đợc tinh sạch và đợc đa tiếp vào vector chuyển gen pCAMBIA đã mở bằng enzim Hind III và Kpn I. Vector tái tổ hợp này đợc biến nạp vào Agrobacterium và đợc chọn lọc bằng khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trờng LB đặc có 50mg/l kanamycin. Các khuẩn lạc tiếp tục đợc sàng lọc bằng PCR và tách plasmid để cắt với enzim giới hạn (ảnh 7).
ảnh 7: kết quả cắt với enzim giới hạn để kiểm tra cấu trúc vector pCAMBIA2300 có chứa gen PRSVN
Dòng M: Marker 1Kb
Dòng 1: p2300-PRSVN đợc cắt với Xba I & Sac I Dòng 2: p2300-PRSVN đợc cắt với Xba I & Nru I Dòng 3: p2300-PRSVN đợc cắt với Hind III & Kpn I
Dòng 1, chúng tôi đã nhận đợc băng ADN ~900bp, ~9,6Kb và băng ~800bp. Băng ADN 900bp là gen PRSVN còn lại hai băng 9,6Kb và 800bp đợc cắt ra từ vector pCAMBIA2300, 35S pro và Nos ter. ở dòng 2 có băng ~590bp là đợc cắt từ gen PRSVN. ở dòng 3 nhận đợc băng 2,8Kb là cấu trúc 35S pro- gen PRSVN - Nos ter. Nh vậy vector chuyển gen đã đợc tạo ra với một cấu trúc đúng.