Nguyên liệu và phơng pháp 2.1 Nguyên liệu
2.2.8.Kiểm tra khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp bằng PCR
- Lấy một phần khuẩn lạc chuyển vào ống Eppendorf có chứa sẵn 45àl ddH2O khử trùng. Đun sôi trong 5 phút.
- Ly tâm nhanh, chuyển 41,75 àl sang ống Eppendorf 0,5 ml có chứa sẵn các thành phần cho phản ứng PCR: dNTP(10mM) 1 àl Đệm PCR x10 5 àl Mồi 1 1 àl Mồi 2 1 àl Taq polymerase 0,25 à l Σ thể tích 8,25 àl - Chu trình nhiệt là: 940C: 1 phút; (940C: 1 phút, 560C: 1 phút, 720C: 1 phút 20 giây) lặp lại 25 chu kỳ; 720C: 10 phút.
- Kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR trên gel agarose 1%, (15 àl/mẫu).
2.2.9. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli
Hoá chất
- Dung dịch I: glucose 50mM; Tris-HCl 25mM, EDTA 10mM, pH 8,0 - Dung dịch II: NaOH 0,2N; SDS 1%
- Dung dịch III: 60ml Potassium acetat 5M : 11,5ml axit acetic : 28,5ml H2O - Natri acetat 3M pH 5,2
Qui trình
- Cấy chuyển một khuẩn lạc vào trong ống nghiệm chứa 3 ml môi trờng LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi cấy lắc qua đêm ở 370C, 200 vòng/phút.
- Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào trong ống Eppendorf loại 1,5 ml và đem ly tâm 6000 vòng/phút, 6 phút để thu tế bào. Loại bỏ dịch nổi.
- Cặn đợc hoà trong 100 àl dung dịch I bằng máy vortex.
- Bổ sung ngay 200 àl dung dịch II. Đảo ống Eppendorf nhẹ nhàng, giữ trong 5 phút. Hỗn hợp trở nên trong suốt và quánh.
- Bổ sung tiếp 150 àl dung dịch III và đảo nhẹ nhàng, giữ trong 3 phút. Trong hỗn hợp sẽ xuất hiện kết tủa trắng.
- Đem ly tâm 10 phút ở tốc độ 10000 vòng/phút.
- Chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf mới. Bổ sung 450 dung dịch Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1), trộn thật đều và đem ly tâm 10000 vòng/phút, 15 phút để loại protein và DNA nhiễm sắc thể.
- Hút nhẹ nhàng pha trên sang ống Eppendorf moi và lặp lại bớc trên với 400 àl dung dịch hỗn hợp Chloroform: Isoamyl Alcohol (24:1) để loại bỏ lợng nhỏ phenol còn sót lại khỏi dung dịch DNA plasmid.
- Hút nhẹ nhàng pha trên sang ống Eppendorf mới (tránh làm vẩn pha dới). Tủa dịch thu đợc với 2 lần thể tích cồn tuyệt đối có thêm dung dịch muối Natri axetat tới nồng độ cuối cùng 0,3 M. Để dung dịch DNA kết tủa ở -200C qua đêm hoặc ở -750C trong 2 giờ.
- Thu DNA kết tủa trong dung dịch bằng cách đem ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Phần kết tủa đợc rửa với cồn 700C và thu lại bằng cách ly tâm 14000 vòng/phút ở trong 10 phút.
- Hoà tan DNA thu đợc vào trong 30àl dung dịch TE hoặc nớc cất hai lần khử trùng. Giữ trong -200C.
- Chạy điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.