Nguyên liệu và phơng pháp 2.1 Nguyên liệu
2.2.7.Phơng pháp biến nạp
2.2.7.1 Biến nạp vào E. coli
+ Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Lấy một khuẩn lạc E. coli (DH 5α) nuôi trong 10 ml LB lỏng ở 370C qua đêm, lắc 250v/p.
- Hút 0,5ml dịch tế bào cho vào 50ml LB lỏng nuôi trong 4h ở 370C, lắc 250v/p. - Thu dịch tế bào làm lạnh trong đá 10'
- Ly tâm 4000v/p ở 40C trong 5', thu kết tủa.
- Tan tủa tế bào trong 5ml CaCl2 0,1M ( để lạnh sẵn ở 00C), ly tâm thu tủa. - Tan tủa tế bào trong 0,85ml CaCl2 0,1M ( để lạnh sẵn ở 00C) và 0,15 ml glycerol , chia nhỏ 200à1 vào ống eppendof
- Làm lạnh nhanh trong N2 lỏng, giữ ở -850C. + Biến nạp:
- giữ ấm ống đựng tế bào khả biến cho tan băng và đặt ngay vào đá. - Thêm ~50ng dung dịch plasmid vào ống tế bào, ủ 30' trong đá. - Sốc nhiệt ở 420C trong 90'', chuyển sang nớc đá 2'-3'.
- Trộn thêm 800à1 dung dịch SOC ủ 1h ở 370C.
- Hút 50à1 và 100à1 dịch tế bào cấy trải trên môi trờng LB đặc bổ sung 50mg/l Kanamixin, đặt qua đêm ở 370C và chọn lọc khuẩn lạc đợc biến nạp
2.2.7.2 Biến nạp vào agrobacterium
+ Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Lấy một khuẩn lạc agrobacterium nuôi trong 10 ml LB lỏng ở 290C qua đêm, lắc 250v/p. - Hút 4ml dịch tế bào cho vào 100ml LB lỏng nuôi trong 4h ở 290C, lắc 250v/p. - Ly tâm 4000v/p ở 40C trong 5', thu kết tủa.
- Tan tủa tế bào trong 0,85ml môi trờng LB lỏng và 0,15 ml glycerol , chia nhỏ 200à1 vào ống eppendof
- Làm lạnh nhanh trong N2 lỏng, giữ ở -850C. + Biến nạp:
- giữ ấm ống đựng tế bào khả biến cho tan băng và đặt ngay vào đá. - Thêm ~50ng dung dịch plasmid vào ống tế bào, làm lạnh nhanh trong N2 lỏng
- Sốc nhiệt ở 370C trong 5 phút.
- Trộn thêm 800à1 dung dịch SOC ủ 2h ở 280C.
- Hút 50à1 và 100à1 dịch tế bào cấy trải trên môi trờng LB đặc bổ sung 50mg/l Kanamycin, đặt ở 280C từ hai đến ba ngày và chọn lọc khuẩn lạc đợc biến nạp.
LB: 10g/l Trypton; 10 g/l NaCl; 5g/l extrac yeast, pH 7,0
SOC: 20g/l Trypton; 5g/l extrac yeast; 0,5g/l NaCl; 10ml/l KCl 0,25M và 5ml/l MgCl2 2M; pH 7,0