KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ TÍNH AN TOÀN SAU TIÊM VACXIN DỊCH TẢ HEO TẾ BÀO TRÊN HEO SƠ SINH, TRÊN NÁI MANG THAI VÀ NÁI HẬU BỊ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y ***************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ TÍNH AN TỒN SAU TIÊM VACXIN DỊCH TẢ HEO TẾ BÀO TRÊN HEO SƠ SINH, TRÊN NÁI MANG THAI VÀ NÁI HẬU BỊ Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN TUÂN Lớp : DH05TY Ngành: Thú Y Niên khóa: 2005 – 2010 Tháng 08/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y **************** NGUYỄN VĂN TUÂN KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ TÍNH AN TOÀN SAU TIÊM VACXIN DỊCH TẢ HEO TẾ BÀO TRÊN HEO SƠ SINH, TRÊN NÁI MANG THAI VÀ NÁI HẬU BỊ Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Bác sỹ Thú Y Giáo viên hướng dẫn TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH ThS NGUYỄN THỊ THU HỒNG Tháng 08/2010 i XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên thực tập: Nguyễn Văn Tuân Tên khóa luận: “Khảo sát đáp ứng miễn dịch tính an tồn sau tiêm vacxin DTH tế bào heo hậu bị, nái mang thai heo sơ sinh”Đã hồn thành khóa luận theo u cầu giáo viên hướng dẫn Giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Thị Phước Ninh ii LỜI CẢM TẠ Con xin cảm ơn ba má có cơng sinh thành dưỡng dục hy sinh nhiều có ngày hôm Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Phước Ninh hết lòng hỗ trợ, dẫn dắt hướng dẫn em hoàn tất tốt đề tài Con xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thu Hồng trưởng môn siêu vi trùng, Ths Lê Thị Thu Phương, Đặng Hùng môn siêu vi trùng, tồn thể cán cơng nhân viên công ty NAVETCO quan tâm, hướng dẫn tạo điều kiện học tập tốt cho suốt thời gian qua Xin chân thành cảm ơn Đỗ Văn Trong, Nguyễn Ngọc Dũng, Võ Đình Đạt, tồn thể cán cơng nhân viên cơng ty cổ phần chăn nuôi Phú Sơn tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực tập Em xin cảm ơn thầy cô khoa Chăn ni – Thú y tận tình truyền dạy kiến thức cho em trình học tập trường Xin cảm ơn bạn lớp DH05TY gắn bó giúp đỡ suốt năm đại học iii TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát đáp ứng miễn dịch tính an tồn sau tiêm vacxin DTH tế bào heo hậu bị, nái mang thai heo sơ sinh” thực trại heo Phú Sơn Bộ môn siêu vi trùng – Công ty NAVETCO từ 8/3/2010 đến 10/8/2010 Chúng tơi xin tóm tắt nội dung đề tài: Hai lơ vacxin dùng thí nghiệm heo nái có liều TCID50 104,33 /liều lô 104 /liều lô Vacxin DTH heo tế bào chủng C NAVETCO sản xuất an toàn heo hậu bị, heo nái mang thai heo sơ sinh Heo hậu bị heo nái mang thai chủng vacxin có đáp ứng miễn dịch tương tự chủng vacxin ngoại khác dùng làm đối chứng thí nghiệm Tiêm vacxin cho heo sơ sinh ngày tuổi có KTTĐ đáp ứng KT không rõ ràng iv MỤC LỤC Trang Trang tựa i Xác nhận giáo viên hướng dẫn ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh mục chữ viết tắt ix Danh mục bảng x Danh mục sơ đồ xi Danh mục hình xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Chương CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Lịch sử bệnh DTH 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Tình hình nhiễm bệnh DTH giới 2.2.1 Nguồn bệnh phương pháp lây lan 2.2.2.3 Mùa vụ mắc bệnh 2.2.5 Đường xâm nhập 2.2.6 Cách sinh bệnh 2.3 Căn bệnh 2.3.2 Phân loại 2.3.3 Nuôi cấy 2.3.3.1 Động vật thí nghiệm 2.3.3.2 Môi trường nuôi cấy 2.3.4 Sức đề kháng virus DTH v 2.4 Triệu chứng bệnh tích 2.4.1.1 Thể cấp 10 2.4.1.4 Thể không điển hình 10 2.4.2 Bệnh tích 11 2.4.2.1 Bệnh tích đại thể 11 2.4.2.2 Bệnh tích vi thể 11 2.5 Chẩn đoán 11 2.5.1 Chẩn đoán lâm sàng mổ khám 12 2.5.2 Chẩn đoán phân biệt 12 2.5.3 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 14 2.5.3.1 Phương pháp trung hòa thỏ 14 2.5.3.2 Phương pháp tiêm truyền qua heo 14 2.5.3.3 Phương pháp phân lập virus DTH nuôi cấy tế bào PK-15 14 2.5.3.4 Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch kết nối enzyme ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) 14 2.5.3.5 Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch (IHC: Immunohistochemical Staining) 15 2.5.3.6 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang 15 5.3.7 Phương pháp PCR (Polymerase Chains Reaction) 16 2.6 Miễn dịch bệnh DTH 17 2.6.1 Miễn dịch trình nhiễm virus DTH 17 2.6.2 Đáp ứng miễn dịch tiêm phòng vacxin DTH 17 2.6.2.1 Miễn dịch qua trung gian tế bào 18 2.6.2.2 Miễn dịch dịch thể 18 2.7 Điều trị 20 2.8 Phòng bệnh 20 2.8.1 Phòng công bệnh DTH 20 2.8.2 Phòng bệnh vacxin 21 2.8.2.1 Vacxin chết 21 vi 2.8.2.2 Vaccine nhược độc 22 2.8.2.3 Vacxin hệ 22 Chương NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Thời gian địa điểm 24 3.2 Vật liệu thí nghiệm 24 3.2.1 Heo thí nghiệm 24 3.2.3 Vật liệu dung phản ứng trung hịa (NPLA) mơi trường tế bào PK-15 kỹ thuật nhuộm miễn dịch Peroxidase (IPx) phịng thí nghiệm thú y Úc AAHL (Australia Animal Health Laboratory) cung cấp 24 3.4 Phương pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Bố trí thí nghiệm 25 3.4.1.1 Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy lô vacxin A B 25 3.4.1.3 Bố trí thí nghiệm 27 3.4.2 Phương pháp xét nghiệm 29 3.4.2.1 Phương pháp trung hòa gắn kết enzym NPLA (Neutralization Peroxidase Linked Assay) 29 3.4.2.2 Phương pháp ELISA phát kháng nguyên DTH 32 3.4.3 Các cơng thức tính phương pháp xử lý số liệu 37 3.4.3.1 Các cơng thức tính 37 3.4.3.2 Xử lý số liệu 37 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy lô vacxin A B 38 4.2 Kết thí nghiệm nái hậu bị 39 4.2.1 Kết theo dõi phản ứng phụ 39 4.2.2 Kết đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin 40 4.3 Kết thí nghiệm nái mang thai 41 4.3.1 Kết theo dõi phần ứng phụ 41 4.3.2 Kết đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin 41 4.3.3 Kết theo dõi tiêu suất sinh sản 42 vii 4.3.4 Kết theo dõi diện kháng thể heo trước bú sữa đầu 44 4.4 Kết thí nghiệm heo 44 4.4.1 Kết theo dõi phản ứng phụ 44 4.4.2 Kết đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 52 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AAHL Australian Animal Health Laboratory BDV Border Disease Virus BVDV Bovine Viral Diarrhea Virus CPE Cyto Pathogenic Effect DTH Dịch tả heo ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay HGKT Hiệu giá kháng thể HCV Hog cholera Virus IPx Immuno - Peroxidase KN Kháng nguyên KT Kháng thể KTTĐ Kháng thể thụ động Mab Monoclone Antibody MEM Minimum Essential Media NAVETCO National Veterinary Company NPLA Neutralization Peroxidase Linked Assay OD Optical Density OIE Office International Epizooties PBSA Phosphate Buffered Saline PBST Phosphate Buffered Saline + 0,5 % Tween RT – PCR Reverse Transcription – Polymaerase chains reaction TCID Tissue Culture Infected Dose TMB 3,3’,5,5’ - Tetremethylbenzidine WHO World Health Organization ix Giá trị tương ứng với liều TCID50 103,33 Nhưng liều virus gây nhiễm vào giếng 100 µl (0,1ml) nên giá trị thực tế 104,33/ml Như liều gây nhiễm 50% virus vacxin thuộc lô A 104,33/liều vacxin Bảng 4.2 Kết chuẩn độ virus vacxin lô B Số giếng có phản ứng IPx Độ pha lỗng huyễn dịch virus Dương tính Âm tính 10-1 10-2 10-3 cộng dồn số giếng có phản ứng IPx Số dương dồn / tổng số Dương Âm tính tính Tỷ lệ dương tính 10/10 100% 6/6 100% 2 2/4 50% 0/6 0% 10 0/10 0% 14 0/14 0% 10 0 2 10-4 10-5 10-6 Cũng với cách tính trên, liều gây nhiễm 50% virus vacxin thuộc lô B 104/liều vacxin Như liều TCID50 hai lô vacxin tương đương đạt tiêu chuẩn cho phép (103,5/liều) 4.2 Kết thí nghiệm nái hậu bị 4.2.1 Kết theo dõi phản ứng phụ Trước tiêm vacxin heo hậu bị có biểu giảm ăn, mệt mỏi, lại Nguyên nhân trước ngày heo bị stress q trình lấy máu làm xáo trộn đàn Sau tiêm vacxin ngày, heo khơng cịn biểu stress nêu suốt tuần sau chúng tơi khơng ghi nhận thêm biểu bất thường Như bị heo bị stress việc tiêm chủng 39 vacxin DTH tế bào không gây phản ứng phụ bất lợi cho heo Florent ctv (1969) ghi nhận, khơng có phản ứng bất lợi sau tiêm vacxin DTH chủng C heo bị stress heo sử dụng chất ức chế miễn dịch 4.2.2 Kết đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin Heo nái hậu bị tiêm vacxin DTH thí nghiệm lúc 205 ngày tuổi, lần tiêm tiêm nhắc lại trước tháng heo tiêm vacxin DTH lúc 56 ngày tuổi theo quy trình trại Heo nái hậu bị kiểm tra kháng nguyên P125 trước tiêm vacxin DTH thí nghiệm, tất heo hậu bị âm tính với kháng nguyên P125 HGKT kiểm tra trước tiêm vacxin sau tiêm vacxin tháng Kết HGKT thu nhận Bảng 4.3 Bảng 4.3 HGKT nái hậu bị số tai Lơ thí nghiệm HGKT trước tiêm vc (log2) HGKT sau tiêm vc tháng (log2) số tai Lô đối chứng HGKT trước tiêm vc (log2) HGKT sau tiêm vc tháng (log2) 3673 3709 3230 3492 3755 3746 3749 3732 TB 4 5 5 9 6,13 - - - TB 3672 1786 3473 3181 3738 - - - 3,8 - - - 6,4 Ghi : HGKT: hiệu giá kháng thể, vc: vacxin Torlone ctv (1967) ghi nhận sau tiêm vacxin DTH chủng C HGKT tăng dần đạt đỉnh cao lúc – tháng`và sau tồn số, heo chống lại cơng cường độc lúc ngày đến 16 tháng sau tiêm vacxin Điều có nghĩa HGKT lúc tháng sau tiêm đỉnh cao từ lúc trở HGKT ngang thấp Qua Bảng 4.3 nhận thấy sau 40 tiêm vacxin DTH nhắc lại, hàm lượng kháng thể hai lơ thí nghiệm đối chứng tăng rõ rệt 2,13log2 lô thí nghiệm 2,6log2 lơ đối chứng Như heo nái hậu bị có đáp ứng tốt vacxin thí nghiệm 4.3 Kết thí nghiệm nái mang thai 4.3.1 Kết theo dõi phản ứng phụ Sau tiêm vacxin DTH theo theo dõi thời gian tuần không ghi nhận phản ứng phụ xảy Bognar Meszaros (1963) báo cáo vacxin DTH chủng C có khả phịng bệnh không độc hại nái mang thai heo Như kết phù hợp 4.3.2 Kết đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin Chúng tiến hành lấy máu kháng đông để kiểm tra kháng nguyên P125 trước tiêm vacxin Kết âm tính cho lơ thí nghiệm lần 1, lơ thí nghiệm lần lơ đối chứng Tiến hành lấy máu (huyết thanh) để xác định hiệu giá kháng thể trước tiêm vacxin sau tiêm vacxin 45 ngày (sau sinh ngày) Lần tiêm vacxin tiêm nhắc lại trước heo nái tiêm vacxin theo quy trình trại, với vacxin thương mại chủng C công ty khác sản xuất Kết ghi nhận Bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết HGKT trung bình heo nái mang thai Lơ Số nái theo dõi (con) HGKT trung bình trước tiêm vacxin (log2) HGKT trung bình sau tiêm vacxin 45 ngày (log2) Biến thiên HGKT (log2) Thí nhiệm 30 5,67 5,97 +0,30 Thí nhiệm 24 5,96 7,13 +1,17 Đối chứng 11 6,18 6,40 +0,22 Ghi chú: HGKT: hiệu giá kháng thể Từ Bảng 4.4 nhận thấy HGKT lơ thí nghiệm lơ đối chứng gia tăng khơng đồng có chênh lệch lơ thí nghiệm lơ thí 41 nghiệm 1; lơ thí nghiệm lơ đối chứng Kết lơ thí nghiệm lơ đối chứng tương đương với kết Terstra Tielen (1976) tháng sau tiêm nhắc lại, hiệu giá kháng thể tăng 0,36log2 heo nái tiêm vacxin DTH chủng C năm trước Hiệu giá kháng thể lơ thí nghiệm tăng rõ 1,17log2 Sự gia tăng hiệu giá kháng thể lơ thí nghiệm lơ thí nghiệm cho thấy heo nái mang thai có đáp ứng miễn dịch vacxin thí nghiệm 4.3.3 Kết theo dõi tiêu suất sinh sản Sau tiêm vacxin nái mang thai tiến hành khảo sát tiêu sinh sản Trong tiến hành thí nghiệm có nái thuộc lơ thí nghiệm bị đẻ non lúc mang thai 106 ngày, lấy mẫu lách thai non máu kháng đông heo mẹ để kiểm tra kháng nguyên P125 kết âm tính Vì chúng tơi khẳng định lý nái đẻ non bệnh dịch tả heo chúng tơi định loại nái khỏi thí nghiệm Các tiêu khác ghi nhận Bảng 4.5 4.6 Bảng 4.5 Kết tiêu sinh sản heo nái mang thai Số thai chết trung bình/ổ Số nái khảo sát Tỷ lệ xảy thai DTH Tỷ lệ đẻ non DTH Số sinh cịn sống trung bình/ổ Số chọn ni trung bình/ổ 30 0% 0% 10,80 9,73 0,27 0,40 0,67 24 0% 0% 9,79 9,29 0,17 0,38 0,55 đối chứng 11 0% 0% 10,73 10,18 0,09 0,45 0,54 P - - - >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Lơ thí nghiệm lần thí nghiệm lần 42 Số thai Số thai Tổng số chết chết thai chết khô tươi trung trung trung bình/ổ bình/ổ bình/ổ Tỷ lệ xảy thai tỷ lệ đẻ non virus vacxin DTH tất lơ %, chúng tơi khẳng định vacxin không ảnh hưởng xấu đến tiêu Qua Bảng 4.5 nhận thấy số sinh cịn sống/ổ lơ thí nghiệm lần lơ thí nghiệm lần 10,80 9,79 So với kết khảo sát Xí nghiệp chăn ni heo Phú Sơn nái không sử dụng loại vacxin DTH thí nghiệm này, Hồng Thanh Vân (2005) ghi nhận số sống ổ 9,4 con/ổ, Nguyễn Thị Kiều Anh (2001) – 11 con/ổ Như kết tương đương với khảo sát Số chọn nuôi số heo sinh sống đạt trọng lượng lớn 700 gr không bị dị tật Kết ghi nhận số chọn nuôi lơ thí nghiệm lần lơ thí nghiệm lần 9,73 9,29 cao khảo sát Nguyễn Thanh Tuyền (2005) khảo sát Xí nghiệp heo giống Cấp I (8,78 con/ổ) tương đương kết Lư Ngọc Minh Châu (2004) khảo sát Xí nghiệp heo giống 2/9 (9,28 con/ổ) Kết hai lơ thí nghiệm thí nghiệm khơng có khác biệt lơ đối chứng (P>0,05) Bảng 4.6 Tỷ lệ thai chết sinh Tỷ lệ thai chết (%) Lô Tỷ lệ thai chết khô (%) Tỷ lệ thai chết tươi (%) Tổng tỷ lệ thai chết (%) thí nghiệm lần 2,33 3,49 5,82 thí nghiệm lần 1,61 3,63 5,24 đối chứng 0,81 4,03 4,84 Tỷ lệ thai chết lúc sinh lơ thí nghiệm 5,82%, lơ thí nghiệm 5,24% Theo Trần Thị Dân (2000), tỷ lệ thai chết sinh khoảng - 6% Nái bị xem rối loạn sinh sản tỷ lệ thai chết ổ 10% Qua xử lý thống kê nhận thấy tất tiêu sinh sản (số sinh sống trung bình/ổ, số chọn ni trung bình/ổ, số thai chết khơ trung 43 bình/ổ số thai chết tươi trung bình/ổ, tổng số thai chếttrung bình/ổ) lơ thí nghiệm lơ thí nghiệm khơng có khác biệt so với lô đối chứng (P>0,05) Tielen ctv (1974) điều tra thực địa với 1100 heo nái rằng: heo nái tiêm vacxin DTH chủng C từ tuần trước phối giống đến tuần sau phối giống khơng có ảnh hưởng xấu đến tỷ lệ đậu thai, số heo sinh cịn sống trung bình/ổ, số heo chết trung bình /ổ số cai sữa trung bình/ổ Như tất tiêu sinh sản heo nái tiêm vacxin DTH thí nghiệm hồn tồn bình thường Vậy vacxin DTH tế bào an toàn tiêm cho nái mang thai (70 đến 75 ngày) 4.3.4 Kết theo dõi diện kháng thể heo trước bú sữa đầu Heo sơ sinh lấy máu trước bú sữa đầu để kiểm tra hiện kháng thể kháng DTH Tất cà 24 heo sơ sinh từ nái tiêm vacxin DTH tế bào thí nghiệm khơng mang kháng thể kháng DTH trước bú sữa đầu Kết phù hợp với nghiên cứu Vandeputte ctv (2001) 45 heo sơ sinh trước bú sữa đầu sinh từ heo nái tiêm vacxin DTH chủng C 4.4 Kết thí nghiệm heo 4.4.1 Kết theo dõi phản ứng phụ Sau tiêm vacxin DTH theo theo dõi thời gian tuần, không ghi nhận phản ứng phụ xảy ra, heo bú mẹ lại bình thường 4.4.2 Kết đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể lúc tuần tuần sau tiêm vacxin trình bày Bảng 4.7 Qua Bảng 4.7 nhận thấy HGKT heo vào lúc ngày tuổi heo không tiêm vacxin cao HGKT heo mẹ Kết phù hợp với nhận định Henry Too Sacha Seneque (2002), khoảng sau bú sữa đầu HGKT huyết đạt mức cao cao 44 HGKT heo mẹ Trong ngày đầu tiên, hàm lượng kháng thể heo heo mẹ tương đương (Phạm Hùng ctv, 2004) Bảng 4.7 Bảng HGKT trung bình heo tuần tuần sau tiêm vacxin HGKT HGKT trung HGKT trung Số bầy mẹ Lơ bình tuần bình tuần theo dõi ngày sau sau tiêm sau tiêm sinh TN 4,22 3,29