PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 LY TRÍCH DNA
4.2.2.3 So sánh kết quả PCR trên DNA của cơ và lông
Sau khi tiến hành 10 phản ứng khuếch đại DNA trên các mẫu lông ở cả ba giống, chỉ có 2 mẫu thành công, 8 mẫu còn lại không phân biệt được giới tính chính xác. Tỷ lệ thành công trên mẫu lông là 20%, ít hơn so với mẫu cơ (100%) một cách có ý nghĩa (p < 0,001). Trong đó, hai mẫu lông thành công đều là mẫu lông gốc (đạt 40%), các mẫu lông ngọn đều không thành công (0%).
Theo Sambrook và Russell (2001), độ tinh sạch của DNA ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả PCR. DNA có tỷ số OD từ 1,8 – 2,0 được xem là sạch (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). Ở đây, mẫu lông có tỷ số OD trung bình 1,49 (xem bảng 4.2). Tỷ số này thấp chứng tỏ lượng protein còn trong dịch DNA rất nhiều (nhất là keratin) nên ức chế phản ứng khuếch đại DNA. Mẫu lông ngọn còn có tỷ số OD trung bình thấp hơn mẫu lông gốc khá nhiều (xem bảng 4.3) nên kết quả PCR của mẫu lông gốc không thành công.
Một yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến hiệu quả PCR là nồng độ DNA mẫu và những chất ức chế khác (Sambrook và Russell, 2001). Thông thường, DNA mẫu của động vật hữu nhũ được dùng khoảng 1µg trong phản ứng và có xu hướng giảm xuống
còn 0,1µg (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). Ở đây, chúng tôi sử dụng 0,15 µg DNA mẫu trong 1 phản ứng. Ở mẫu cơ, nồng độ DNA ly trích được khá cao (369,55 ng / µl) nên thường sử dụng < 1µl DNA mẫu là có thể thực hiện được phản ứng. Trong khi đó, mẫu lông có nồng độ DNA khá thấp (27,1 ng / µl) (xem bảng 4.2), nên chúng tôi phải sử dụng 3 µl - 15 µl thì mới đủ lượng DNA mẫu cho phản ứng nhân bản. Khi đó, lượng EDTA có trong TE 1X (buffer cho DNA mẫu) được đưa vào phản ứng cũng tăng theo. Tuy nhiên, nếu lượng EDTA hiện diện nhiều trong phản ứng khuếch đại DNA thì nó có thể ức chế phản ứng bằng cách bẫy bắt Mg2+ - một coenzyme của Taq polymerase và làm cô lập Mg2+ với Taq. Chính vì vậy, PCR ở mẫu lông có hiệu quả rất thấp, nhất là ngọn lông.
Một kinh nghiệm được rút ra từ sự thất bại trên mẫu lông là khi pha loãng DNA mẫu sau khi tủa trong cồn tuyệt đối lạnh thì phải pha với lượng nhỏ TE 1X để có được dung dịch DNA có hàm lượng > 100 ng / µl.