Tạo chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri đột biến bằng phương pháp knockout gen wzz (O antigen chain length determinant gene)

7TRẦN THỊ THANH THANH TẠO CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KNOCKOUT GEN wzz O – ANTIGEN CHAIN LENGTH DETERMINANT GENE Chuyên ngành: Vi sinh Mã số: 60

7

TRẦN THỊ THANH THANH

TẠO CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP KNOCKOUT GEN wzz

(O – ANTIGEN CHAIN LENGTH DETERMINANT GENE)

Chuyên ngành: Vi sinh

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS NGUYỄN QUỐC BÌNH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động viên, giúp đỡ của ba mẹ, thầy cô, anh chị và các bạn

Con xin cảm ơn gia đình đã luôn ủng hộ và

động viên con trong cuộc sống cũng như trên con

đường học vấn

Em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quốc Bình Thầy đã định hướng và tạo mọi điều kiện để

em hoàn thành tốt khóa luận Cảm ơn Thầy đã truyền

đạt cho em nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu

Xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng CNSH Thủy Sản, phòng CNSH Y Dược đã nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian qua

Cảm ơn những người bạn của tôi đã luôn bên cạnh chia sẽ, động viên và cổ vũ tinh thần cho tôi trong thời gian thực hiện khóa luận

Trần Thị Thanh Thanh

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH x

DANH MỤC SƠ ĐỒ xiv

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra 3

1.2 Tình hình nghiên cứu vaccine cho cá kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 4

1.2.1 Những nghiên cứu trên thế giới 4

1.2.2 Những nghiên cứu ở Việt Nam 6

1.3 Lipopolysacharide (LPS) và vai trò của gen wzz trong quá trình tổng hợp LPS 7

1.3.1 Cấu trúc và chức năng của LPS 7

1.3.2 Quá trình tổng hợp LPS và vai trò của gen wzz 9

1.3.3 Một số nghiên cứu về gen wzz 11

1.4 Phương pháp knockout gen sử dụng hệ thống tái tổ hợp tương đồng λ Red 12

1.5 Tạo chủng E icataluri đột biến gen wzz bằng phương pháp

knockout gen và triển vọng làm vaccine 13

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thiết bị, hóa chất, vật liệu 15

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ 15

2.1.2 Hóa chất 15

2.1.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết plasmid 15

2.1.2.2 Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm PCR 15

2.1.2.3 Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose 16

2.1.2.4 Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn 16

2.1.2.5 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 16

2.1.2.6 Hóa chất dùng cho điện di DNA 16

2.1.2.7 Thang DNA 17

2.1.2.8 Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp hóa biến nạp 17

2.1.2.9 Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp điện biến nạp 17

2.1.3 Môi trường 18

2.1.3.1 Môi trường LB (Luria Bertami) 18

2.1.3.2 Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) 18

2.1.4 Chủng vi sinh vật 18

2.1.5 Plasmid 18

2.1.5.1 Plasmid pKD4 18

2.1.5.2 Plasmid pCAMBIA 1300 19

2.1.5.3 Plasmid pGEM-T Easy 20

2.1.5.4 Plasmid pJET1.2/blunt 20

2.1.5.5 Plasmid pKD46 21

2.1.5.6 Plasmid pGP704 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Tạo dòng E coli DH5α mang đoạn gen wzz của E ictaluri 23

2.2.1.1 Thiết kế mồi 23

2.2.1.2 Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E ictaluri 23

2.2.1.3 Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy mang đoạn gen wzz (pGEMT::wzz) 24

2.2.1.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp 24

2.2.1.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz vào E coli DH5α 25

2.2.1.6 Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc 25

2.2.1.7 Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn 26

2.2.1.8 Giải trình tự gen wzz 26

2.2.2 Tạo chủng E ictaluri mang plasmid pKD46 27

2.2.2.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp E ictaluri bằng phương pháp điện biến nạp 27

2.2.2.2 Biến nạp plasmid pKD46 vào E ictaluri 27

2.2.2.3 Kiểm tra dòng tế bào E ictaluri mang pKD6 bằng phản ứng

cắt giới hạn 28

2.2.2.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp E ictaluri mang plasmid pKD46 bằng phương pháp điện biến nạp 28

2.2.3 Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 29

2.2.3.1 Thiết kế mồi 29

2.2.3.2 Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP 30

2.2.3.3 Biến nạp cassette 1 STEP vào E ictaluri mang pKD46 30

2.2.4 Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP 30

2.2.4.1 Thiết kế mồi 32

2.2.4.2 Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP 32

2.2.4.3 Biến nạp cassette 2 STEP vào E ictaluri mang pKD46 33

2.2.5 Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 34

2.2.5.1 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu của gen wzz 35

2.2.5.2 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn cuối của gen wzz 37

2.2.5.3 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu (Hwzz) và đoạn cuối (Twzz) của gen wzz 38

2.2.5.4 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn gen kháng kanamycin từ pCAMBIA 1300 40

2.2.5.5 Tạo dòng E coli DH5α mang plasmid chứa

cassette HTK (pJET::HTK) 42

2.2.5.6 Tạo dòng tế bào E coli DH5α λpir mang plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK 43

2.2.5.7 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E ictaluri::pKD46 để tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz 45

2.2.5.8 Tạo dòng E coli SM10 λpir chứa plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK 45

2.2.5.9 Tạo chủng E ictalruri đột biến gen wzz bằng phương pháp tiếp hợp 46

2.2.6 Loại bỏ plamid pKD46 ra khỏi chủng E ictaluri đột biến gen wzz 47

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Nuôi cấy chủng E ictaluri hoang dại 48

3.2 Tạo dòng E coli DH5α mang đoạn gen wzz của E ictaluri 49

3.2.1 Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E ictaluri 49

3.2.2 Kết quả nhân dòng gen wzz trong E coli DH5α bằng vector pGEM-T Easy 50

3.3 Tạo chủng E ictaluri mang plasmid pKD46 53

3.4 Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 54

3.4.1 Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP 54

3.4.2 Biến nạp cassette 1 STEP vào E ictaluri mang pKD46 để tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz 55

3.5 Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP 55

3.5.1 Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP 55

3.5.2 Biến nạp cassette 2 STEP vào E ictaluri mang pKD46 để

tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz 57 3.6 Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng

suicide plasmid pGP704 58

3.6.1 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang

đoạn đầu của gen wzz 58

3.6.1.1 Khuếch đại và thu nhận đoạn đầu gen wzz 58 3.6.1.2 Nhân dòng đoạn đầu của gen wzz trong E coli DH5α

bằng vector pJET1.2/blunt 59

3.6.2 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang

đoạn cuối của gen wzz 61

3.6.2.1.Khuếch đại và thu nhận đoạn cuối gen wzz 61 3.6.2.2 Nhân dòng đoạn cuối của gen wzz trong E coli DH5α

bằng vector pJET1.2/blunt 62

3.6.3 Tạo dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt

mang đoạn đầu và đoạn cuối của gen wzz 64 3.6.4 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang

đoạn gen kháng kanamycin từ pCAMBIA 1300 66

3.6.4.1 Khuếch đại và thu nhận đoạn gen kháng kanamycin

từ pCAMBIA 1300 66

3.6.4.2 Nhân dòng đoạn gen kháng kanamycin trong E coli DH5α

bằng vector pJET1.2/blunt 67

3.6.5 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang cassette HTK (pJET::HTK) 69

3.6.6 Tạo dòng tế bào E coli DH5α λpir mang plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK 71

3.6.7 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E ictaluri::pKD46 để tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz 73

3.6.8 Tạo dòng E coli SM10 λpir chứa plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK 77

3.6.9 Tạo chủng E ictalruri đột biến gen wzz bằng phương pháp tiếp hợp 78

3.7 Loại bỏ plamid pKD46 ra khỏi chủng E ictaluri đột biến gen wzz 82

Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 83

4.2 Đề nghị 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84

PHỤ LỤC 89

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

BHI Brain heart infusion

CD14 Cluster of differentiation 14

CNSH Công nghệ sinh học

CFU Colony forming units

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleotide triphosphate

FRT Flippase Recognition Target

LB Luria bertani

LPS Lipopolysaccharide

MCS Multi cloning site

NCBI National Center for Biotechnology Information

OMP Outer membrane protein

OD Optical density

PCR Polymerase chain reaction

RNA Ribonucleic acid

TCR T cell receptor

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 16

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 3

Hình 1.2 Cấu trúc của LPS 8

Hình 1.3 Cấu trúc LPS trên màng vi khuẩn Gram âm 8

Hình 1.4 Quá trình tổng hợp LPS ở vi khuẩn Gram âm theo con đường phụ thuộc wzy 10

Hình 2.1 Thang DNA 17

Hình 2.2 Plasmid pKD4 19

Hình 2.3 Plasmid pCAMBIA 1300 19

Hình 2.4 Plasmid pGEM-T Easy 20

Hình 2.5 Plasmid pJET1.2/blunt 21

Hình 2.6 Plasmid pKD46 22

Hình 2.7 Plasmid pGP704 22

Hình 3.1 Khuẩn lạc của E ictaluri phát triển trên môi trường BHI sau 72 giờ 48

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FserC/RserC trên gel agarose 1% 48

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen wzz trên gel agarose 1% 49

Hinh 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% 51

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme SalI và EcoRI trên gel agarose 1% 51

Hình 3.6 Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen wzz của chủng E ictaluri

cung cấp bởi Trung tâm CNSH so với chủng E ictaluri 93-146 trên ngân hàng gen

NCBI bằng công cụ Blast 52

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme EcoRI trên gel agarose 1% 53

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR 1 STEP trên gel agarose 1% 54

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1 % 56

Hình3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR 2 STEP trên gel agarose 1% 57

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FHwzz/RHwzz trên gel agarose 1% 59

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% 60

Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% 60

Hình 3.14 Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn Hwzz được nhân dòng trong pJET1.2/blunt so với chủng E ictaluri 93-146 trên ngân hàng gen NCBI bằng công cụ Blast 61

Hình 3.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FTwzz và RTwzz trên gel agarose 1% 62

Hình 3.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% 63

Hình 3.17 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI và XbaI trên gel agarose 1% 63

Hình 3.18 Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn Twzz được nhân dòng trong

pJET1.2/blunt so với chủng E ictaluri 93-146 trên ngân hàng gen NCBI bằng công

cụ Blast 64

Hình 3.19 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% 65

Hình 3.20 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme SalI và XbaI trên gel

agarose 1% 66

Hình 3.21 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FKm/RKm trên gel

agarose 1% 67

Hình 3.22 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% 68

Hình 3.23 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI trên gel

agarose 1% 68

Hình 3.24 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI trên gel

agarose 1% 70

Hình 3.25 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% 70

Hình 3.26 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BglII trên gel

agarose 1% 71

Hình 3.27 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% 72

Hình 3.28 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BglII 73

Hình 3.29 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FserC/RserC trên gel

agarose 1% 75

Hình 3.30 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FKm/RKm trên gel

agarose 1% 75

Hình 3.31 Kết quả điện di sản phẩm PCR cặp mồi WF1/WR1 trên gel

Hình 3.34 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% 77

Hình 3.35 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BglII trên gel

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 29

Sơ đồ 2.2 Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 2 STEP 31

Sơ đồ 2.3 Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp sử dụng

suicide plasmid pGP704 34

MỞ ĐẦU

Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có tiềm năng xuất khẩu lớn và mang lại lợi nhuận cao cho người nuôi Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam (The Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers – VASEP), sản phẩm cá tra Việt Nam đang dẫn đầu thị phần thế giới (2009) VASEP

dự báo, vị trí dẫn đầu thị trường thế giới của Cá tra Việt Nam sẽ còn giữ vững trong nhiều năm tới Với tiềm năng kinh tế lớn như vậy, cá tra hiện là một trong những sản phẩm xuất khẩu chủ lực của Việt Nam Theo quy hoạch của Bộ Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn, đến năm 2010 sản lượng cá tra là 1,5 triệu tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 1,5 tỉ USD và đến năm 2020, sản lượng ước đạt 2 triệu tấn, kim ngạch xuất khẩu 2 tỷ USD

Một trong những giải pháp quan trọng để nâng cao sản lượng cá tra là nuôi công nghiệp tập trung với quy mô lớn Tuy nhiên, việc nuôi cá với mật độ cao tạo điều kiện cho các bệnh nhiễm khuẩn phát triển và lây lan như bệnh mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh do nấm, kí sinh trùng …Trong đó, đã và đang gây thiệt hại nghiêm

trọng nhất là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra Khi cá bị

nhiễm bệnh, tỷ lệ chết có thể lên đến 90% Để điều trị bệnh, người nuôi thường sử dụng thuốc hóa học và một số loại kháng sinh Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và hóa chất không đúng qui định và lặp đi lặp lại trong thời gian dài đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc và hiệu quả không cao Hơn nữa, lượng tồn dư kháng sinh trong

cá không chỉ ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm, mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng Để giải quyết vấn đề trên, biện pháp sử dụng vaccine phòng bệnh được đánh giá là có hiệu quả, ít tốn kém và đảm bảo an toàn sinh học

Do đó, việc tìm kiếm các loại vaccine cho cá tra kháng lại các bệnh nhiễm khuẩn đang là vấn đề cấp bách cho công nghiệp nuôi cá tại Việt Nam

Đối với vi khuẩn E ictaluri, O antigen được chứng minh là một kháng

nguyên mạnh và là yếu tố gây độc quan trọng Chiều dài chuỗi O antigen được điều

hòa bởi gen wzz (length chain determinant gene) Nghiên cứu ở các loài vi khuẩn Gram âm khác như E coli, Samonella, Yersinia… cho thấy khi chủng vi khuẩn đột

biến gen wzz thì O antigen sẽ phân bố chiều dài chuỗi một cách ngẫu nhiên và có

độc tính thấp hơn so với chủng hoang dại

Từ những thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo chủng

Edwardsiella ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen” nhằm làm

cơ sở cho việc sản xuất vaccine nhược độc phòng bệnh cho cá tra

Mục tiêu của đề tài

- Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen

Nội dung đề tài bao gồm

- Tạo dòng đoạn gen wzz của E ictaluri trong E coli DH5α

- Tạo chủng E ictaluri mang plasmid pKD46

- Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP

- Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 2 STEP

- Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp sử dụng

suicide plasmid pGP704

- Loại bỏ plasmid pKD46 ra khỏi chủng E ictaluri đột biến gen wzz

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra

Edwardsiella ictaluri thuộc giống Edwardsiella, họ Enterobacteriaceae, bộ Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria E ictaluri là

vi khuẩn Gram âm, hình que, phần lớn ở dạng đơn, đôi và một ít ở dạng chuỗi, kích thước 1x 2 – 3 µm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ tiêm mao, kị khí tùy ý, catalase dương tính, cytocrom oxidase âm [14], [21]

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

E ictaluri được phân lập lần đầu tiên năm 1976 từ cá nheo Mỹ nhiễm bệnh

[13] Chúng phát triển chậm trên môi trường nuôi cấy Khi nuôi cấy trên môi trường thạch BHI ở 28 – 300C, sau 36 – 48 giờ, vi khuẩn phát triển hình thành những

khuẩn lạc nhỏ tròn lồi, trơn láng đường kính 1 – 2 mm E ictaluri phát triển yếu

hoặc không phát triển ở 370C [26], [36]

E ictaluri gây bệnh nhiễm trùng máu ở cá nheo Mỹ [21] và bệnh gan thận

mủ ở cá tra, cá basa Việt Nam [1] Khi phẩu thuật cá bệnh thấy xuất hiện những điểm hoại tử màu trắng đục chủ yếu ở thận, lách, gan đường kính từ 1 – 3 mm Bệnh gây chết hàng loạt và tỉ lệ chết rất cao có thể lên đến 90% [21]

E ictaluri xâm nhiễm vào cá theo 2 con đường: (1) Từ nguồn nước, vi

khuẩn có thể xâm nhập vào cơ quan khứu giác thông qua mũi cá đang mở, chúng di chuyển vào bên trong dây thần kinh khứu giác và sau đó lên não Sự truyền nhiễm

lan rộng từ màng não đến sọ và da tạo nên những lỗ thủng trên đầu cá (thường gọi

là triệu chứng “hole-in-the-head”); (2) Vi khuẩn cũng có thể theo đường tiêu hóa và

đi vào trong máu dẫn đến nhiễm trùng máu Bằng con đường này, vi khuẩn đi vào mao mạch trong biểu bì dẫn đến hoại tử và làm mất sắc tố của da cá Bệnh gây hoại

tử ruột, gan, lách và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm khuẩn [30]

Tuy nhiên, cơ chế gây độc của vi khuẩn vẫn chưa thực sự rõ ràng Những

nghiên cứu về yếu tố gây độc của E ictaluri chủ yếu tập trung vào LPS, OMP, các

gen gây độc…

LPS là một nội độc tố Ngoài ra, LPS còn vai trò chủ yếu trong sự xâm nhiễm của vi khuẩn vào tế bào chủ và có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ Nhiều nghiên cứu đã xác định LPS là yếu tố gây độc quan trọng của vi

khuẩn E ictaluri [3], [30] Hoạt tính chondroitinase phân giải mô sụn gây triệu

chứng “hole in the head” ở cá Copper và cộng sự cho rằng hoạt tính chondroitinase

cũng góp phần vào độc tính của E ictaluri Khi cá nheo Mỹ được xử lý với chủng đột biến E ictaluri MI 15 (bị mất hoạt tính chondroitinase) cho thấy không có cá

chết mà cũng không thấy dấu hiệu bệnh Thune và cộng sự (2007) cũng đã xác định những gen liên quan đến độc tính nằm trên vùng phát sinh bệnh 26,135 bp chứa 33 gen thuộc hệ thống tiết loại III [30] Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng xác

định protein màng và hemolysine cũng là nhân tố gây độc của E ictaluri [17]

1.2 Tình hình nghiên cứu vaccine cho cá kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

1.2.1 Những nghiên cứu trên thế giới

Plumb J.A và cộng sự (1995) đã sử dụng chủng E ictaluri chết (xử lý bằng

formalin) cấp cho cá tra bằng phương pháp ngâm tăng dần: ngâm một lần, ngâm hai lần, ngâm và kết hợp cấp ba lần theo đường cho ăn Kết quả cho tỉ lệ sống lần lượt

là 56,7%; 64,2% và 68,8% so với lô đối chứng là 43,6% [22] Hiện nay, loại vaccine vô hoạt này đã được công ty dược phẩm Biomed (Mỹ) sản xuất và đưa ra thị trường với giấy phép tạm thời để điều trị bệnh nhiễm trùng máu đường ruột cho

cá nheo Mỹ [24]

Công ty sức khỏe thủy sản Escogen, Canada cũng đã sản xuất và đưa ra thị

trường vaccine E ictaluri vô hoạt (cấp theo đường miệng) để phòng chống bệnh

nhiễm trùng máu đường ruột [24]

Tuy nhiên, các loại vaccine vô hoạt không tạo được đáp ứng miễn dịch trong thời gian dài và hiệu quả không rõ ràng [16], [23], [24], [29], [31]

Nhiều công trình nghiên cứu khác chủ yếu tập trung vào các yếu tố gây độc

và gây đáp ứng miễn dịch của E ictaluri như LPS, protein màng và các gen gây

độc Một số loại vaccine nhược độc đã cho thấy khả năng phòng bệnh khá hiệu quả,

và đã được thương mại hóa trên thị trường [3]

Lauwrence và cộng sự (1997) đã nghiên cứu tạo chủng E ictaluri nhược độc đột biến gen purA Chủng này được sử dụng làm vaccine cho cá nheo Mỹ theo

phương pháp ngâm một lần ở nồng độ độ 3,65 x 107 CFU/ml cho tỉ lệ sống là 66,7% [16]

Nhóm tác giả Ronald L.Thune, Đại học bang Louisiana (1999) đã tạo thành

công chủng E ictaluri đột biến gen aroA Chủng đột biến được sử dụng làm

vaccine bằng phương pháp ngâm một lần và ngâm tăng cường ở nồng độ 107CFU/ml và 108 CFU/mL Kết quả là tỉ lệ sống của cá đạt 54,1 – 63,8% khi được ngâm một lần và 77,3 – 94,4% khi được ngâm tăng cường [28]

Richard K.Cooper và cộng sự đã tạo thành công chủng E ictaluri đột biến

gen mã hóa enzyme chondroitinase và đã đăng kí bản quyền (US patent No 5536658) Chủng này đã được thử nghiệm tiêm cho cá với nồng độ 108 CFU/ml để kiểm tra độc lực Lô cá đối chứng được tiêm chủng hoang dại, sau 4 ngày cá biểu hiện bệnh và bắt đầu chết vào ngày thứ 6 Lô cá được tiêm chủng đột biến không có dấu hiệu bệnh sau 2 tuần quan sát Sau khi tiếp tục tiêm chủng hoang dại, cá vẫn không có dấu hiệu bệnh trong khi lô cá đối chứng chết toàn bộ Kết quả cho thấy tỷ

lệ bảo vệ của chủng đột biến là 100% [25]

Craig A và cộng sự đã nghiên cứu chủng đột biến E ictaluri rifampicin –

mutant (RE – 33) sử dụng như một loại vaccine sống biến đổi (modified live

vaccine) Chủng E ictaluri RE – 33 này đã được đăng kí bản quyền (US pantent

No 6019981) và loại vaccine này hiện nay đã được thương mại hóa (AQUAVAC – ESC) [2], [31]

1.2.2 Những nghiên cứu ở Việt Nam

Ở nước ta hiện nay tuy đã có một số công trình nghiên cứu và phát triển

vaccine E ictaluri cho cá tra nhưng chưa có sản phẩm thích hợp đáp ứng được nhu

cầu

Từ năm 2006 đến cuối năm 2007, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản

II đã kết hợp với Công ty Thuốc Thú y TW (Navetco) thực hiện đề tài cấp nhà nước

“Nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá ba sa, cá mú, cá giò,

cá hồng mỹ nuôi công nghiệp”, trong đó đối tượng được quan tâm đặc biệt là cá tra Sau 2 năm thực hiện, nghiên cứu sử dụng vaccine phòng bệnh đốm trắng cho cá tra

đã đạt được một số kết quả khả quan và có triển vọng áp dụng vào thực tế Tuy nhiên hiện nay, vaccine vẫn còn đang thử nghiệm chưa thương mại hóa sản phẩm [34]

Công ty dược phẩm thủy sản PHARMAQ của Na Uy đã chọn cá tra Việt Nam là đối tượng nghiên cứu vaccine cho cá nuôi ở khu vực châu Á Từ cuối năm

2009, công ty đã kết hợp với Đại học Cần Thơ tiến hành thử nghiệm vaccine E ictaluri cho cá tra ở 3 điểm thí nghiệm thuộc các tỉnh Đồng Tháp, An Giang và Bến

Tre Thử nghiệm cho kết quả khả quan và có triễn vọng ứng dụng thực tiễn rộng rãi [35]

Một nghiên cứu khác của Trường đại học Nông Lâm kết hợp với Công ty Công nghệ Sinh học Schweizer, thử nghiệm vaccine vô hoạt (vi khuẩn đã chết) bằng phương pháp ngâm và cho ăn 2 lần thì tỉ lệ sống là 52% [20]

Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh đang tiến hành

nghiên cứu tạo các chủng E ictaluri đột biến nhược độc bằng phương pháp

knockout gen và phương pháp sử dụng kháng sinh rifampicin Hiện nay, trung tâm

đã tạo được 4 chủng E ictaluri đột biến bao gồm: Chủng E ictaluri kháng rifampicin; Chủng E ictaluri đột biến gen purA; Chủng E ictaluri đột biến gen aroA; Chủng E ictaluri đột biến gen mã hóa enzyme chondroitinase Kết quả

thử nghiệm độc lực của chủng đột biến gen purA (E ictaluri PAM24) cho thấy

chủng này không gây chết cá ở nồng độ 3,4 x 105 CFU/ml, trong khi đó các

chủng hoang dại (có ký hiệu E ictaluri ĐT và E ictaluri VL33 ) gây chết cá

rất cao: 92,22% và 95,56% ở nồng độ lần lượt là 1,8x105 CFU/ml và 2,4x105 CFU/ml Quá trình thử nghiệm độc lực đối với các chủng đột biến còn lại đang được triển khai Một hướng nghiên cứu khác cũng đang được thực hiện tại Trung

tâm là vaccine tiểu phần dựa trên một số protein có tính kháng nguyên của E ictaluri như OmpA, OmpN, GAPDH Tuy nhiên, những nghiên cứu này đang ở

trong giai đoạn bước đầu thu nhận và tinh sạch protein

1.3 Lipopolysacharide (LPS) và vai trò của gen wzz trong quá trình tổng hợp LPS

1.3.1 Cấu trúc và chức năng của LPS [4], [11], [12], [27], [33]

LPS là thành phần chính của lớp màng ngoài của vi khuẩn Gram âm, góp phần quan trọng tạo nên sự toàn vẹn cấu trúc của vi khuẩn và giúp bảo vệ màng khỏi sự tấn công của một vài loại hóa chất LPS cũng tăng điện tích âm của màng tế bào và giúp ổn định cấu trúc màng nói chung

Cấu trúc LPS gồm 3 vùng khác nhau: lipid A, oligosaccharide lõi và O antigen

- Lipid A thường là đường đôi glucosamine gắn với nhiều acid béo Những chuỗi acid béo kị nước này gắn chặt LPS vào màng tế bào vi khuẩn Lipid A là thành phần gây độc chính của vi khuẩn Gram âm Khi tế bào vi khuẩn bị ly giải bởi

hệ thống miễn dịch, những mảnh vỡ của màng chứa lipid A được giải phóng vào vòng tuần hoàn, gây sốt, tiêu chảy, và có thể gây sốc nội độc tố (còn gọi là sốc nhiễm trùng)

- Lõi của LPS luôn luôn chứa một thành phần oligosaccharide gắn trực tiếp với lipid A và thường chứa đường như heptose và 3-deoxy-D-mannooctulosonic Acid (KDO, keto-deoxyoctulosonate)

- O antigen (O polysaccharide hoặc O side chain) là domain ngoài cùng của LPS O antigen gồm nhiều phiên bản lặp lại (thường là 10 – 30 lần) của một đơn vị

oligosaccharide (O unit) Mỗi đơn vị Oligosaccharide gồm khoảng từ 2 đến 6 phân

tử đường O antigen được phơi bày ra bên ngoài bề mặt tế bào vi khuẩn và do đó nó

là mục tiêu nhận biết của kháng thể vật chủ O antigen có tính chuyên biệt kháng nguyên cao Sự thay đổi trong cách sắp xếp và liên kết giữa các phân tử đường trong O unit tạo nên các cấu trúc khác nhau của O antigen, đặc trưng cho việc nhận biết kháng nguyên

Hình 1.2 Cấu trúc của LPS

Hình 1.3 Cấu trúc LPS trên màng vi khuẩn Gram âm

Từ lâu, LPS được coi là nội độc tố và là nhân tố gây đáp ứng miễn dịch mạnh

ở động vật LPS cũng tham gia vào quá trình sản xuất nhiều loại chất trung gian liên quan tới sốc nhiễm khuẩn LPS hoạt động như một nội độc tố đầu tiên bởi vì nó bám vào phức hợp receptor CD14/TLR4/MD2 và xúc tiến sự tiết các cytokine tiền viêm trong nhiều loại tế bào, đặc biệt là ở đại thực bào Ngoài ra, những nghiên cứu trong vài năm gần đây cho thấy LPS có vai trò trong việc hoạt hóa nhiều nhân tố phiên mã

1.3.2 Quá trình tổng hợp LPS và vai trò của gen wzz

Trong quá trình tổng hợp LPS, Lipid A và oligosaccharide lõi được tổng hợp cùng với nhau, trong khi O antigen được tổng hợp độc lập [11]

Hầu hết các O antigen được tổng hợp theo con đường phụ thuộc Wzy (Wzy dependent pathway), tuy nhiên cũng có một vài loại O antigen được tổng hợp bằng các hình thức polymer hóa khác (Wzy independent pathway) [11]

Trong con đường tổng hợp phụ thuộc Wzy, đầu tiên O unit được tổng hợp bằng cách chuyển liên tục những phân tử đường (từ đường tương ứng của nucleotide) đến lipid vận chuyển undecaprenol-phosphate (UndP) nhờ những enzyme glycosyltransferase chuyên biệt Quá trình này xảy ra trong tế bào chất Ban đầu, O unit hoàn chỉnh vẫn tập hợp trên undecaprenylphosphate Sau đó, enzyme O unit flippase (Wzx) chuyển O unit từ màng trong ra màng ngoài Ở đó, O unit được polymer hóa tạo thành O antigen nhờ O antigen polymerase (Wzy) và sau đó được nối với lipid lõi A nhờ enzyme WaaL ligase [4], [5], [12], [27] Sự di chuyển cuối cùng của phân tử LPS hoàn chỉnh ra bề mặt tế bào được giả thiết là điều hòa bởi một phức hợp protein ngoài màng Imp/RlpB [27]

Chiều dài chuỗi O antigen được điều hòa bởi gen wzz, còn được gọi là Cld

[chain length determinant] hay Rol [regulator of O antigen length] Khi chủng vi

khuẩn bị đột biến gen wzz thì chiều dài chuỗi O antigen sẽ phân bố một cách ngẫu

nhiên [27]

Đến nay, cơ chế protein Wzz ảnh hưởng tới quá trình polymer hóa vẫn chưa được hiểu rõ Bastin và cộng sự cho rằng Wzz hoạt động như thiết bị bấm giờ phân

tử, cho phép sự polymer hóa bởi Wzy tiếp tục trong một khoảng thời gian định trước nào đó hoặc cho tới khi chiều dài đặc trưng của chuỗi O antigen được hình thành Một giả thuyết khác được đưa ra bởi Monora và cộng sự cho rằng protein Wzz hoạt động như một chaperone phân tử để tập trung phức hợp protein gồm Wzy, WaaL và chuỗi polysaccharide đang được hình thành Chiều dài O antigen chuyên biệt là kết quả động học do tỉ lệ khác nhau của Wzy so với WaaL Hiện nay vẫn chưa có bằng chứng sinh hóa cụ thể nào cho cả hai mô hình này [27]

Gen wzz có tính chất bảo tồn loài cao Protein Wzz nằm trong họ

“polysaccharide co – polymerase” (PCP) Thành viên của nhóm này liên quan đến

sự điều hòa chiều dài chuỗi của nhiều polysaccharide trong đó có O antigen, capsular polysaccharide, và exopolysaccharide Protein Wzz có cấu hình màng: hai xoắn helix xuyên màng lần lượt nằm gần đầu amino và đầu carboxyl Đến nay, thông tin cấu trúc của những protein trong họ này vẫn chưa được xác định rõ [27]

Hình 1.4 Quá trình tổng hợp LPS ở vi khuẩn Gram âm theo con đường phụ thuộc wzy

1.1.3 Một số nghiên cứu về gen wzz

Chiều dài của chuỗi O antigen ảnh hưởng đến cách vi khuẩn Gram âm tương tác với các protein bổ thể của hệ miễn dịch tự nhiên Chuỗi O antigen càng dài sẽ ngăn chặn bổ thể tiếp cận với bề mặt tế bào để ly giải vi khuẩn Những chủng đột biến bị mất hoàn toàn chuỗi O antigen dễ dàng bị tiêu diệt bởi bổ thể hơn so với chủng hoang dại Do đó, chiều dài chuỗi O antigen có đóng vai trò quan trọng trong

độc tính của vi khuẩn [15] Chiều dài chuỗi O antigen được điều hòa bởi gen wzz

Vì vậy, nhiều nghiên cứu đã tạo ra các chủng đột biến gen wzz, khảo sát sự thay đổi

chiều dài chuỗi O antigen và kiểm tra độc tính để tìm ra những chủng nhược độc có triển vọng làm vaccine

Đối với chủng E coli O7, đột biến gen wzy biểu hiện O antigen với chỉ 1 tiểu phần O7 antigen của chủng hoang dại Trong khi đó, đột biến gen wzz biểu hiện

chuỗi O antigen với chiều dài ngắn hơn so với chủng hoang dại [9] Ảnh hưởng của chiều dài O antigen đối với sự kháng huyết thanh vẫn chưa được làm rõ nhưng có

một vài sự liên hệ giữa chiều dài chuỗi O antigen và độc tính của E coli [10]

Một số loại vi khuẩn biểu hiện hai loại kiểu mẫu O antigen và được điều hòa

bởi hai gen wzz khác nhau [15] Salmonella enterica hoang dại biểu hiện hai kiểu chuỗi O antigen: chuỗi O antigen dài (16 đến 35 unit) được điều hòa bởi gen wzz st;

chuỗi O antigen rất dài ( > 100 unit) được điều hòa bởi gen wzz fepE Murray và cộng

sự đã tiến hành thử nghiệm trên chuột với 3 chủng Salmonella enterica đột biến gen wzz: chủng đột biến gen wzz st ; chủng đột biến gen wzz fepE và chủng đột biến cả

hai gen wzz st /wzz fepE Kết quả cho thấy chủng đột biến cả hai gen wzz st /wzz fepE cho kết quả chuỗi O antigen ngắn hơn, nhạy với huyết thanh hơn và có độc lực thấp

nhất Chủng đột biến gen wzz st không biểu hiện chuỗi O antigen dài, nhạy cảm với

huyết thanh và có độc lực thấp hơn so với chủng hoang dại Đột biến gen wzz fepE

không khác nhiều so với chủng hoang dại [18]

Ở Pseudomonas aeruginosa PAO1, chủng hoang dại chủ yếu biểu hiện hai loại O antigen dài và rất dài được điều hòa bởi hai gen wzz1 và wzz2 Đột biến gen

wzz1 làm giảm sự biểu hiện của chuỗi O antigen dài, đột biến gen wzz2 dẫn đến

không biểu hiện chuỗi O antigen rất dài Chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2

giảm biểu hiện cả hai loại chuỗi O antigen Các chủng đột biến đã được thử nghiệm

trên chuột để kiểm tra độc tính Kết quả chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 có độc lực thấp nhất Đối với chủng hoang dại, tất cả chuột đều chết ở liều gây độc khoảng 5.5 × 105 CFU nhưng đối với chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 thì ở

liều lượng này, chúng hoàn toàn không gây độc Chủng đột biến gen wzz1 cho kết quả giảm độc lực đáng kể Liều gây chết 50% của chủng này cao gấp 4,5 lần so với

chủng hoang dại Chủng đột biến gen wzz2 có giảm độc lực nhưng không đáng kể [15]

H Najdenski và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm để đánh giá vai trò của O-

antigen đối với độc tính của vi khuẩn Yersinia enterocolitica O:8 Tiến hành tiêm

cho thỏ với 3 chủng đột biến: (i) Chủng đột biến bị mất hoàn toàn O antigen, (ii)

chủng đột biến gen wzy bị mất protein Wzy nên biểu hiện LPS với chỉ một O unit duy nhất, (iii) chủng đột biến gen wzz bị mất protein Wzz nên biểu hiện LPS với

chiều dài O antigen phân bố một cách ngẫu nhiên Kết quả cho thấy chủng đột biến

gen wzz có độc lực thấp nhất [19]

Những kết quả nghiên cứu trên chứng tỏ chiều dài của O antigen có ảnh hưởng lớn đến độc tính của vi khuẩn Do đó, nghiên cứu tạo ra các chủng đột biến

gen wzz mang lại nhiều hứa hẹn trong việc sản xuất vaccine sống nhược độc [19]

1.4 Phương pháp knockout gen sử dụng hệ thống tái tổ hợp tương đồng λ Red [7], [32]

λ Red bao gồm các gen gam, bet và exo mã hóa cho một hệ thống tái tổ hợp

tương đồng rất hiệu quả Protein Gam có khả năng bất hoạt hoạt tính exonuclease V

của RecBCD, cho phép sự biến nạp đoạn DNA dạng thẳng Sản phẩm của gen bet

và exo giúp thúc đẩy sự tái tổ hợp ở hai vùng tương đồng ngắn Hệ thống này rất

hữu dụng trong việc bất hoạt các gen mục tiêu ở vi khuẩn Gram âm

Dựa trên hệ thống λ Red, một phương pháp tạo đột biến đơn giản mà không cần tạo dòng đã được phát triển Phương pháp này sử dụng hệ thống λ Red để bất

hoạt gen thông qua sự tái tổ hợp tương đồng gữa vùng gen trên nhiễm sắc thể và đoạn DNA dạng thẳng mang gen kháng kháng sinh với 2 bên là trình tự tương đồng với gen đích (Cassette)

Phương pháp đã được sử dụng thành công cho nhiều loại vi khuẩn Gram âm

bao gồm: E coli, Salmonella, Yersinia, Shigella, Serratia, Klebsiella, Pseudomonas…

Tuy nhiên, độ dài trình tự tương đồng cần thiết để xảy ra tái tổ hợp tương đồng là

khác nhau ở các loài E coli chỉ cần trình tự tương đồng khoảng 50 nucleotide là đủ

để xảy ra sự tái tổ hợp nhưng đối với Vibrio cholerae, trình tự 100 nucleotide mới

đủ để tái tổ hợp tương đồng xảy ra Còn đối với Y pseudotuberculosis, đoạn tương

đồng ngắn thường không đủ để xảy ra sự tái tổ hợp mà cần phải có phải có đoạn tương đồng khoảng 500 nucleotide

1.5 Tạo chủng E icataluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen

và triển vọng làm vaccine

Hiện nay, những sản phẩm được sử dụng trong phòng chống bệnh gan thận

mủ do E ictaluri gây ra chủ yếu các loại vaccine vô hoạt Vaccine vô hoạt là

vaccine được sản xuất trực tiếp từ chủng vi khuẩn gây bệnh, bị bất hoạt bằng nhiệt

độ, áp suất hay bằng hóa chất (formalin, glutaraldehyde…), sau đó bổ sung chất bổ trợ thích hợp để gia tăng khả năng gây đáp ứng miễn dịch Vaccine vô hoạt có ưu điểm là dễ sản xuất và an toàn khi sử dụng Tuy nhiên, loại vaccine này lại có hiệu quả không cao [34]

Trong khi đó, vaccine nhược độc sử dụng vi khuẩn sống đã giảm hoặc không còn độc lực lại rất có hiệu quả cao trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào cũng như duy trì nhớ miễn dịch Do đó, việc nghiên cứu các chủng

E ictaluri nhược độc để làm vaccine là một hướng có nhiều tiềm năng [34]

Phương pháp tạo vi khuẩn nhược độc đơn giản nhất là phương pháp cấy chuyền nhiều lần trong phòng thí nghiệm để làm giảm độc lực, sau đó gây nhiễm cho vật chủ Tuy nhiên, độc lực vi khuẩn có thể phục hồi khi chúng được tăng sinh trong cơ thể vật chủ Vì vậy, phương pháp này không an toàn và không thích hợp để

áp dụng trong sản xuất vaccine [34]

Hiện nay, việc tạo chủng nhược độc thường được thực hiện theo hướng tạo

ra các đột biến bằng tác nhân vật lý (nhiệt độ, tia UV), hóa học (hóa chất, kháng sinh), hoặc bằng phương pháp sinh học phân tử (knockout gen)

Phương pháp knockout gen được sử dụng để bất hoạt các gen độc tính hoặc các gen cần thiết cho quá trình sinh dưỡng của vi khuẩn trong vật chủ Các chủng này vẫn có thể kích thích hệ thống miễn dịch của vật chủ theo con đường gây bệnh của chủng hoang dại nhưng không đủ độc để làm chết vật chủ Vì vậy, knockout gen là một phương pháp rất hữu dụng trong việc tạo chủng vi khuẩn đột biến nhược độc

Đối với vi khuẩn E ictaluri, nhiều nghiên cứu đã xác định O antigen một kháng nguyên mạnh và là một yếu tố gây độc quan trọng E ictaluri biểu hiện O antigen dài và chiều dài của O antigen được điều hòa bởi gen wzz Ở các loài vi khuẩn Gram âm khác như E coli, Samonella, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, các nhà nghiên cứu đã tạo được chủng đột biến gen wzz và cho thấy

chúng có độc lực thấp hơn so với chủng hoang dại

Từ những cơ sở trên, có thể thấy rằng việc sử dụng phương pháp knockout

gen dựa trên hệ thống tái tổ hợp λ Red để tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz

mang lại nhiều triển vọng cho việc tạo ra một loại vaccine sống nhược độc để phòng chống bệnh gan thận mủ cho cá tra ở Việt Nam

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thiết bị, hóa chất, vật liệu

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ

- Máy điện biến nạp (BTX ECM 399)

- Máy gel doc (Biorad)

- Máy ủ heat block techne (Dri-block DB-2D)

- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf)

- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5415R (Rppendorf) 13200 max

- Máy PCR (MasterCycler gradient) (Eppendorf)

- Vortex (Vortex-2genie, Jencons-PLS)

- Bộ điện di DNA Power Pac200 (Biorad)

- Máy đo quang phổ

2.1.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết plasmid

- Bộ kít tách chiết plasmid của Qiagen

2.1.2.2 Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm PCR

- Bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR của Qiagen

2.1.2.3 Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose

- Bộ kít tách chiết DNA từ gel agarose của Qiagen

2.1.2.4 Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn

Các enzyme cắt giới hạn được cung cấp bởi Biolab: SalI, EcoRI, BamHI, XbaI, BglII Các thành phần của phản ứng cắt được sử dụng theo

hướng dẫn của nhà sản xuất

2.1.2.5 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR

Các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR được cung cấp bởi

Fermentas: Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X Thành

phần phản ứng PCR được liệt kê trong Bảng 2.1

2.1.2.6 Hóa chất dùng cho điện di DNA

Agarose (BioLab), Tris base (Promega), Acid acetic (Merck), Bromophenol

blue (Merck), Ethidium Bromide (Merck)

(a): Thang DNA 100 bp; (b): Thang DNA 1 kb; (c): Thang DNA 1 kb plus

2.1.2.8 Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp hóa

2.1.4 Chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài được cung cấp bởi Trung

tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm:

- Chủng Edwardseilla ictaluri hoang dại S7

- Chủng Escherichia coli: E.coli DH5α; E coli DH5α λpir; E coli SM10

λpir

2.1.5 plasmid

2.1.5.1 Plasmid pKD4

- Kích thước 3267 bp

- Mang trình tự khởi đầu sao chép ori6K gamma

- Mang gen kháng ampicillin và gen kháng kanamycin nằm giữa hai trình

tự FRT

- Được sử dụng để tạo cassette 1 STEP

Hình 2.2 Plasmid pKD4 2.1.5.2 Plasmid pCAMBIA 1300

- Kích thước 8958 bp

- Mang gen kháng kanamycin

- Được sử dụng làm bản mẫu để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin dùng trong thiết kế cassette

Hình 2.3 Plasmid pCAMBIA 1300

2.1.5.3 Plasmid pGEM-T Easy

- Kích thước 3015 bp

- Có gắn thêm T ở vị trí nối gen chèn giúp tăng hiệu quả nối

- Mang gen kháng ampicillin và trình tự khởi đầu sao chép f1 ori

- Mang gen lacZ mã hóa cho tiểu phần α của β galactosidase giúp chọn

lọc những khuẩn lạc có gen chèn dựa trên sự chọn lọc màu sắc trắng/ xanh của khuẩn lạc

- Plasmid pGEM-T Easy được sử dụng để nhân dòng

Hình 2.4 Plasmid pGEM-T Easy 2.1.5.4 Plasmid pJET1.2/blunt

- Plasmid đầu bằng cho phép gắn chèn đoạn DNA dạng đầu bằng

- Plasmid pJET1.2/blunt được sử dụng để nhân dòng

Hình 2.5 Plasmid pJET1.2/blunt 2.1.5.5 Plasmid pKD46

- Kích thước 6329 bp

- Mang gen kháng kanamycin

- Mang hai trình tự khởi đầu sao chép repA101ts và oriR101 Sự khởi đầu sao chép repA101ts nhạy cảm với nhiệt độ, do đó plasmid không nhân lên được ở 37oC – 42oC

- Mang các gen exo, bet và gam mã hóa cho hệ thống tái tổ hợp λ Red

được điều khiển bởi promoter ParaB Promoter ParaB tăng cường sản xuất

λ Red khi có arabinose

- Mang gen kháng ampicillin

- Sử dụng plasmid pKD46 biến nạp vào E ictaluri để tận dụng hệ thống

tái tổ hợp λ Red

Hình 2.6 Plasmid pKD46

2.1.5.6 Plasmid pGP704

- Kích thước 3705 bp

- Mang trình tự khởi đầu sao chép oriR6K, cần phải có protein π do gen

pir mã hóa mới nhân lên được Do đó, plasmid chỉ được duy trì trong những chủng có gen pir như E coli DH5α λpir; E coli SM10 λ pir

- Mang gen kháng ampicillin

Hình 2.7 Plasmid pGP704

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tạo dòng E coli DH5α mang đoạn gen wzz của E ictaluri

2.2.1.2 Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E ictaluri

Ly trích DNA bộ gen E ictaluri theo quy trình sau:

- Cấy 1 khuẩn lạc E ictaluri vào 5 ml môi trường BHI colistin, nuôi cấy lắc

- Thu dịch nổi, bảo quản - 20oC

DNA bộ gen E ictaluri được sử dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen wzz bằng cặp mồi WF1/WR1 Sản phẩm PCR được tinh sạch

qua cột để dòng hóa

2.2.1.3 Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy mang đoạn

gen wzz (pGEMT::wzz)

Taq DNA polymerase có hoạt tính terminal transferase, thêm

deoxyadenosine (A) vào đầu 3’ của sản phẩm PCR Hệ thống vector pGEM-T Easy được thiết kế mang một thymidine (T) ở đầu 3’của cả hai bên T nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình nối bằng cách ngăn chặn việc tự đóng vòng của vector

và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR Nhờ vậy, phản

ứng nối xảy ra dễ dàng Thành phần phản ứng nối như sau:

Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ

2.2.1.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5α bằng phương pháp hóa

biến nạp

Các tế bào E coli được phát triển ở pha log Tế bào thu được bằng cách li

tâm và huyền phù tế bào trong dung dịch có chứa CaCl2, tế bào có khả năng kết dính DNA (khả nạp) Trộn DNA vào dung dịch đệm phosphate với CaCl2 tạo ra phức hợp calcium-phosphate-DNA dính chặt vào màng tế bào và đi vào tế bào chất nhờ hiện tượng thực bào Các tế bào phát triển trên môi trường không chọn lọc, cho phép tổng hợp protein kháng kháng sinh, sau đó được nuôi trên môi trường chứa kháng sinh cho phép xác định các khuẩn lạc chứa plasmid

Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp được tiến hành như sau:

- Cấy 1 khuẩn lạc E coli vào 5 ml môi trường LB lỏng Nuôi cấy qua đêm ở