Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI VŨ THỊ BÍCH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 9.42.01.21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI- NĂM 2020 Cơng trình hồn thành tại: Phòng thí nghiệm mơn Di truyền – Hóa sinh, Khoa Sinh học, Đại học Sư phạm Hà Nội Phòng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Xuân Viết PGS.TS Phạm Thị Tâm PGS.TS Khuất Hữu Thanh Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân Trường ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội Phản biện 3: PGS.TS Dương Minh Lam Trường ĐHSP Hà Nội Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi … … ngày … tháng… năm… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Quốc Gia, Hà Nội Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Bài báo cơng bố Cao Thị Thanh Hương, Phạm Thị Tâm, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Xuân Viết, Vũ Thị Bích Huyền (2015) Đặc tính sinh học vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập từ cá biển mắc bệnh hoại tử gan thận Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thơn 8/2015: 72-78 Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Phạm Thị Tâm, Mẫn Hồng Phước, Nguyễn Đăng Quang, Đỗ Thanh Vân, Đặng Thị Hồng Thắm,(2018) Tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus giảm độc lực phương pháp xử lý kháng sinh rifampicin, Báo cáo khoa học Hội nghị nghiên cứu giảng dạy Sinh học toàn quốc lần thứ ba, tháng 5/2018: 1156-1163 Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Đặng Thị Hồng Thắm, Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm (2018) Đánh giá tính ổn định khả đáp ứng miễn dịch chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus L4650 giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc - xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thơn số 21/2018: 79-85 Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Huỳnh Việt Tùng, Phạm Thị Tâm, Mẫn Hồng Phước (2019) Đặc điểm sinh hóa di truyền chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho cá mú nuôi Cát Bà, Hải Phòng Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y tập 26 số 7/2019: 62-73 Vu Thi Bich Huyen, Nguyen Xuan Viet, Pham Thi Tam, Man Hong Phuoc, Huynh Viet Tung, Nguyen Dang Quang, Do Thanh Van (2020) Development of attenuated Vibrio parahaemolyticus mutant strains as potential live vaccines Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 28(1): 52-67 Trình tự gen cơng bố NCBI: 02 trình tự (đã trích dẫn tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y) - Gen toxR chủng A3.3 với mã số (accession number) MH047286 - Gen tlh chủng A3.3 với mã số (accession number) MH047289 Hội thảo Khoa học Quốc tế Vu Thi Bich Huyen, Chu Dinh Toi, Nguyen Xuan Viet, Man Hong Phuoc, Pham Thi Tam (2019) Isolation and evaluation the potential as live attenuated vaccine candidate of rifampicin-resistant Vibrio parahaemolyticus strains 2019 International Academic Conference for Graduate Student of Nanjing Agricultural University in October 2019, Nanjing, China MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Với lợi bờ biển dài (3.260 km) trải suốt từ Bắc đến Nam, tiềm phát triển ngành nuôi trồng thủy sản lớn Theo Tổng cục Thống kê, năm 2018 GDP toàn ngành thủy sản đạt 190.123 tỷ đồng, chiếm 3,43% tồn kinh tế 23,57% tồn ngành nơng nghiệp, tăng trưởng 6,46% so với năm 2017, đạt tốc độ tăng trưởng cao ngành nơng nghiệp, đóng góp 0,22 điểm phần trăm vào tăng trưởng chung tồn ngành nông nghiệp nước [187] Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam giới ln phải đối mặt với khó khăn thách thức, đặc biệt tổn thất bệnh dịch gây Theo Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), bệnh dịch gây thiệt hại cho ngành ni trồng thủy sản tồn cầu tỷ USD năm, xảy hầu phát triển Ở Việt Nam, ước tính năm ngành thủy sản thiệt hại gần tỷ USD bệnh dịch gây [22] Bệnh hoại tử gan thận cá phát 14 quốc gia, 48 loài cá, biết vi khuẩn Vibro parahaemotycus gây [112] Cá bị bệnh có triệu chứng: xuất đốm đỏ, lở loét da, vẩy tróc, vây mòn cụt, nội quan xuất huyết, đặc biệt gan thận, gan chuyển thành màu vàng, cá bị bệnh chết hàng loạt, tỉ lệ chết lên đến 90% [112, 138] V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận làm cá chết hàng loạt với số lượng lớn báo cáo niên tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Bà Rịa-Vũng Tàu…[184, 185, 186] Cho đến nay, việc kiểm soát điều trị bệnh hoại tử gan thận cho cá nuôi người nuôi cá chủ yếu sử dụng kháng sinh để tiêu diệt vi khuẩn V parahaemolyticus [34, 61] Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh cách thường xuyên thiếu kiểm soát chặt chẽ dẫn tới tượng kháng thuốc nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh [26] Mặt khác, dư lượng kháng sinh sản phẩm từ cá gây ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm sức khỏe người tiêu thụ [107] Do đó, sử dụng vắc-xin phòng bệnh giải pháp hiệu mang đến phát bền vững cho ngành nuôi trồng thủy sản nước ta Vắc-xin phòng bệnh vi khuẩn gồm nhiều loại khác nhau: vắc-xin bất hoạt, vắc-xin nhược độc, vắc-xin tái tổ hợp, vắc-xin tiểu phần, vắc-xin DNA [125] Hầu hết vắc-xin phòng bệnh vi khuẩn cho cá thương mại hóa giới vắc-xin bất hoạt tính an toàn cao loại vắc-xin Tuy nhiên, vắc-xin bất hoạt đánh giá có thời gian bảo hộ khơng dài [152] Mặc dù, có vài nghiên cứu tạo vắc-xin bất hoạt, vắcxin tái tổ hợp vắc-xin DNA phòng bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus cá công bố, vắc-xin cấp phép thương mại hóa để sử dụng cá chưa có Vắc-xin nhược độc sử dụng vi khuẩn giảm độc lực hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng ứng dụng sản xuất vắc-xin thương mại cho cá nhờ khả cho tỉ lệ bảo hộ cao thời gian bảo hộ dài Tạo chủng vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc có khả gây đáp ứng miễn dịch cho cá có ý nghĩa quan trọng mang tính định thành bại việc phát triển loại vắc-xin nhược độc Vì vậy, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cần thiết, phù hợp với xu hướng mang đến triển vọng ứng dụng cao phòng bệnh hoại tử gan thận cá biển ni lồng có giá trị kinh tế Xuất phát từ sở lý luận thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận số loài cá biển” tiến hành nhằm tạo làm sở ban đầu cho việc hướng đến sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoạt tử gan thận cá biển Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Tạo chủng vi khuẩn V parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả gây đáp ứng miễn dịch cho cá làm ứng viên cho nghiên cứu sản xuất vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cho số lồi cá biển ni lồng có giá trị kinh tế 2.2 Mục tiêu cụ thể - Tạo vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực từ chủng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan thận cá phân lập phương pháp xử lý với kháng sinh rifampicin - Xác định sở di truyền liên quan đến biến đổi trình tự nucleotide gen mã hóa protein độc tố (gen độc tố toxR, tdh, trh, tlh) gen rpoB dòng vi khuẩn Vibrio giảm độc lực - Đánh giá khả bảo hộ dòng vi khuẩn giảm độc lực tạo Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu phân lập xác định chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho số lồi cá biển ni (cá mú, cá hồng, cá bớp) vùng biển miền Bắc Việt Nam - Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực từ chủng vi khuẩn gây bệnh phương pháp xử lý chủng gây bệnh với rifampicin phân tích sai khác trình tự nucleotide số gen mã hoá protein độc tố (toxR, tdh, trh, tlh) gen rpoB dòng V parahaemolyticus giảm độc lực so với vi khuẩn dại - Đánh giá khả đáp ứng miễn dịch dòng V parahaemolyticus lồi cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) chọn dòng V parahaemolyticus làm ứng viên nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển nuôi Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho số loài cá biển Phạm vi nghiên cứu Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập từ cá biển nuôi vùng biển quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng); vùng biển Đồng Châu (Thái Bình); vùng biển Hải Thịnh (Nam Định) dòng đột biến giảm độc lực tạo Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp thêm sở liệu chủng V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho cá nuôi số vùng biển miền Bắc đặc điểm hình thái, hóa sinh khả kháng kháng sinh, đồng thời, cung cấp sở khoa học cho nghiên cứu dịch tễ xây dựng giải pháp chẩn đoán bệnh Phát đột biến gen độc tố gen ropB dòng V parahaemolyticus kháng rifampicin, giảm độc lực có ý nghĩa khoa học góp phần định hướng cho nghiên cứu nhằm phát triển vắc-xin sống nhược độc sử dụng phòng bệnh cho cá biển ni lồng Kết đánh giá khả bảo hộ (RPS) dòng V parahaemolyticus giảm độc lực bệnh hoại tử gan thận cá mú chấm cam (E coioides) cung cấp sở khoa học cho nghiên cứu miễn dịch phòng bệnh cho cá biển ni lồng 6.2 Ý nghĩa thực tiễn Vi khuẩn V parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả gây đáp ứng miễn dịch ứng viên để sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá mú chấm cam số loài cá biển khác Tính mới, tính độc đáo, tính khả thi đề tài Luận án cơng trình nghiên cứu tạo vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực làm ứng viên cho sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cá biển phương pháp xử lý kháng sinh rifampicin Lần kích thước đầy đủ gen tlh vi khuẩn V parahaemolyticus nhân thành công Phát sai khác trình tự nucleotide gen tlh rpoB dòng giảm độc lực chủng dại, cung cấp sở di truyền chứng minh mối liên quan đột biến gen độc tố tlh gen rpoB với tính giảm độc lực vi khuẩn V paraheamolyticus Chọn dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực L4650 ứng viên tiềm cho nghiên cứu phát triển vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận số lồi cá biển ni lồng Dòng đột biến giảm độc lực L4650 biểu ổn định độc lực, tỉ lệ sống sót cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) tiêm liều 100 µl/con, 105 CFU/ml đạt 100% Tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá mú tiêm chủng vi khuẩn L4650 đạt cao, từ 96,91 - 100% sau 15 ngày tiêm chủng 93,33 - 100% sau tháng tiêm chủng Địa điểm thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Đề tài thực phòng thí nghiệm Di truyền - Hóa sinh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2014 đến tháng 4/2019 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận số lồi cá 1.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa sinh trưởng vi khuẩn Vibrio 1.1.2 Hệ gen vi khuẩn V parahaemolyticus 1.1.3 Độc tố gen quy định độc tố haemolysin Ba loại protein haemolysin: TDH (thermostable direct haemolysin), TRH (TDHrelated haemolysin) TLH (thermolabile haemolysin) mã hóa ba gen tdh, trh tlh Gen toxR mã hóa cho protein điều hòa có vai trò thiết yếu việc điều chỉnh tồn độc lực vi khuẩn 1.1.4 Gen rpoB tính kháng rifampicin Gen rpoB mã hóa tiểu đơn vị β enzyme RNA polymerase Rifampicin có khả liên kết với tiểu đơn vị β - protein mã hóa gen rpoB, gây cản trở khởi đầu phiên mã vi khuẩn 1.1.5 Kháng nguyên vi khuẩn V parahaemolyticus 1.2 Bệnh hoại tử gan thận cá biển 1.2.1 Triệu chứng 1.2.2 Chẩn đoán điều trị 1.3 Vắc-xin chế miễn dịch chủ động 1.3.1 Vắc-xin phân loại vắc-xin cho cá 1.3.2 Miễn dịch đặc hiệu cá xương 1.3.3 Phương thức đưa vắc-xin vào thể cá 1.4 Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá 1.4.1 Tạo vi khuẩn giảm độc lực tác nhân vật lý 1.4.2 Tạo vi khuẩn giảm độc lực tác nhân hóa học 1.4.3 Tạo vi khuẩn giảm độc lực kĩ thuật gen 1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Những nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cá vi khuẩn V parahaemolyticus gây tập trung vào hướng tạo vắc-xin bất hoạt, vắcxin tái tổ hợp với sản phẩm protein màng ngoài, vắc-xin DNA Tuy nhiên, vắc-xin thương mại cấp phép sử dụng cho cá phòng chống V parahaemolyticus đến chưa có, kể vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cá Trong nghiên cứu này, chúng tơi tạo dòng vi khuẩn giảm độc lực đánh giá tiềm dòng tạo nhằm chọn vài dòng để sử dụng nguyên liệu cho sản xuất vắc-xin nhược độc phòng chống vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh cho cá biển CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Cá bệnh Cá biển (cá mú, cá hồng, cá chẽm, cá giò) có triệu chứng mắc bệnh hoại tử gan thận thu thập vùng nuôi trồng thủy sản ven biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng); vùng biển Đồng Châu (Thái Bình); vùng biển Hải Thịnh (Nam Định) Các mẫu sử dụng để phân lập vi khuẩn 24 kể từ thời điểm thu thập mẫu 2.1.2 Cá thí nghiệm Cá ngựa vằn (Danio rerio) dài - 3,5 cm cá rô phi (Oreochromis niloticus) dài 6,5 cm Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I (Từ Sơn, Bắc Ninh) cung cấp Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) dài 5,5 - cm Trung tâm Giống thủy sản (Hải Phòng) cung cấp 2.1.3 Vi khuẩn Chủng V parahaemolyticus VTCC 12233 cung cấp từ Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội sử dụng làm chủng đối chứng 2.1.4 Hóa chất 2.1.5 Thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Sơ đồ bước thực Cá biển ni lồng có biểu đặc trưng bệnh hoại tử gan thận Phân lập Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập Gây nhiễm vi khuẩn lại cho cá mú chấm cam Xử lý rifampicin tử μg/ml đến 250 μg/ml Các dòng vi khuẩn V parahaemolyticus kháng rifampicin Đánh giá, chọn lọc Các dòng vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực Chọn lọc chủng tiềm Đánh giá tính ổn định, khả tạo đáp ứng miễn dịch chủng vi khuẩn giảm độc lực tiềm Hình 2.1 Sơ đồ bước thực 2.2.2 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh Gan, thận, da, vây cá nghi bị bệnh hoại tử gan thận nghiền nhỏ dung dịch nước muối 1,5%, pha loãng dung dịch này, cấy trải lên bề mặt môi trường TCBS Chọn lọc khuẩn lạc có hình thái: tròn, bóng, lồi, có màu xanh đậm 2.2.3 Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn 2.2.4 Phương pháp nhuộm Gram 2.2.5 Phương pháp xác định khả sinh trưởng vi khuẩn 2.2.6 Phương pháp đánh giá đặc điểm hóa sinh, đặc tính kháng kháng sinh chủng vi khuẩn (a) Đánh giá đặc điểm sinh hóa: khả lên men, sinh khí, sinh H2S, sinh indol, sinh catalase, khả di động khả gây dung huyết (b) Xác định tính kháng kháng sinh: với kháng sinh ampicillin (25 µg), gentamycin (30 µg), norfloxacin (10 µg), enrofloxacin (5 µg) erythromycin (15 µg) 2.2.7 Phương pháp đánh giá độc lực vi khuẩn Cá mú chấm cam tiêm gây nhiễm chủng V parahaemolyticus phân lập Xác định tỉ lệ sống sót cá sau 14 ngày 2.2.8 Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin Nuôi cấy liên tục chủng vi khuẩn dại, gây bệnh môi trường chứa rifampicin với nồng độ tăng dần từ 10 đến 250 µg/ml Chọn lọc dòng vi khuẩn kháng rifampicin 2.2.9 Phương pháp đánh giá độc lực dòng vi khuẩn kháng rifampicin (a) Tỉ lệ sống sót cá sau gây nhiễm chủng/dòng vi khuẩn Các dòng vi khuẩn kháng rifampicin chọn lọc đánh giá độc lực phương pháp gây nhiễm vi khuẩn cá ngựa vằn cá rô phi Xác định tỉ lệ sống sót cá sau gây nhiễm (b) Giá trị LD50 chủng/dòng vi khuẩn Phương pháp xác định giá trị LD50 chủng dại dòng vi khuẩn kháng rifampicin tiến hành cá rô phi theo phương pháp Reed Muench (1938) 2.2.10 Nhóm phương pháp sinh học phân tử 2.2.10.1 Phương pháp thiết kế mồi Sử dụng phần mềm CLC Genomics Workbench 8.5 (QIAGEN Bioinformatics) để thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen độc tố toxR, tdh, trh, tlh chủng vi khuẩn V parahaemolyticus 2.2.10.2 Phương pháp tách DNA tổng số: DNA tổng tách kit i-genomic BYF DNA Extraction Mini (iNtRON, Hàn Quốc) 2.2.10.3 Phương pháp PCR khuếch đại gen, giải trình tự gen (a) PCR khuếch đại gen độc tố rpoB Bảng 2.1: Trình tự đặc điểm cặp mồi dùng phản ứng PCR Gen đích toxR toxR tlh tlh Mồi toxR-4 toxR-7 toxR2 toxR4 tlhF tlhR tlh1 tlh3 Trình tự mồi (5’ – 3’) GTCTTCTGACGCAATCGTTG ATACGAGTGGTTGCTGTCATG ACTCTACCCCCCTAAAAGCA CTGCCCCAGTACAACCAACC AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGCG TGTCGTGGCCATTTTGCTT CCGTGATGCCAAAATCAAAA Tm Kích thước sản Nguồn (℃) phẩm (bp) 54,1 Kim Y.B &cs (1999) 368 [69] 55,0 55,5 1070 Tự thiết kế 58,5 58,0 Bej A.K &cs (1999) 450 [29] 56,1 55,7 1484 Tự thiết kế 52,0 tdh tdh trh trh tdhF tdhR tdh1 tdh2 trhF trhR trh1 trh2 GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC ACTGGACTGTGGTTGGT CCTCGAATTACGCAACAA TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT TCGCATTTTTTCACCATTCCC TAAGTTCACGCATTGAG 53,3 54,5 56,7 50,3 52,2 52,8 54,2 49,6 1110F GTAGAAATCTACCGCATGATG 54,1 CM32b CGGAACGGCCTGACGTTGCAT 53,3 rpoB 269 Bej A.K &cs (1999) [29] 865 Tự thiết kế 500 Bej A.K &cs (1999) [29] 772 Tự thiết kế 984 Tarr C.L &cs (2007) [145] Mollet C & cs (1997) [105] (b) Phương pháp giải trình tự: Sản phẩm PCR gửi giải trình tự First BASE Laboratories, Malaysia 2.2.11 Phương pháp tin sinh: Kết giải trình tự gen phân tích với phần mềm BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) CLC Genomics Workbench 8.5 Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index) Swiss model (https://swissmodel.expasy.org/interactive) 2.2.12 Phương pháp đánh giá tính ổn định độc lực độ an tồn dòng vi khuẩn giảm độc lực cá mú chấm cam (a) Đánh giá tính ổn định dòng giảm độc lực (b) Đánh giá mức độ an tồn dòng giảm độc lực 2.2.13 Phương pháp đánh giá khả đáp ứng miễn dịch dòng giảm độc lực cá mú (a) Đánh giá khả đáp ứng miễn dịch cho cá Tỉ lệ bảo hộ (RPS) vắc-xin theo công thức Amend (1981) [23]: RPS (%) = [1-(% cá tiêm vắc-xin chết/% cá đối chứng chết)] x 100 (b) Đánh giá độ dài miễn dịch: đánh giá tỉ lệ bảo hộ sau 1, 2, 4, tháng tiêm chủng cho cá 2.2.14 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý thống kê Excel phần mềm Stata 2.0 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận 3.1.1 Phân lập vi khuẩn Vibrio Phân lập 26 mẫu vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio từ mẫu cá nghi mắc bệnh hoại tử gan thận Sau đó, chọn lọc 11 mẫu vi khuẩn: B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2; N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6 có đặc điểm khuẩn lạc V parahaemolyticus: màu xanh đậm, mặt bóng có hình tròn đều, đường kính từ - mm 3.1.2 Phân tích đặc điểm sinh hóa vi khuẩn phân lập Mười mẫu vi khuẩn phân lập có đặc điểm sinh hóa giống với chủng đối chứng dương V parahaemolyticus VTCC 12233 phù hợp với đặc điểm V parahaemolyticus: lên men glucose, không lên men lactose, khơng sinh H2S, khơng sinh khí, sinh indol, khả di động, sinh catalase, gây tan huyết kiểu β 10 thứ sau gây nhiễm Ở tuần tiếp theo, tỉ lệ cá chết thấp dần khoảng dao động ngày theo dõi Kết phù hợp báo cáo đặc điểm gây bệnh V paraheomolyticus, làm cá chết hàng loạt thể cấp tính chết rải rác cá thể thứ cấp tính Bảng 3.5 Tỉ lệ sống sót mú gây nhiễm với 11 mẫu vi khuẩn Chủng LBT6 B3.13 A3.3 B5M2 B5M3 B5M4 B13M B20M N9.2 N13.1 HH334 PBS Ngày 82,22 ± 1,25 81,11 ± 1,70 78,89 ± 0,67 85,56 ± 0,47 55,56 ± 0,47 74,44 ± 1,25 82,22 ± 0,82 71,11 ± 0,47 55,56 ± 0,47 60,00 ± 1,41 62,22 ± 0,94 100 Ngày 55,56 ± 0,47 53,33 ± 1,24 70,00 ± 0,00 67,78 ± 0,47 27,78 ± 0,82 47,78 ± 0,47 55,56 ± 0,47 55,56 ± 2,05 45,56 ± 0,47 48,89 ± 1,25 48,89 ± 1,25 100 Tỉ lệ sống sót cá sau ngày gây nhiễm (%) Ngày Ngày Ngày Ngày 11 28,89 ± 17,78 ± 13,33 ± 14,44 ± 0,47 0,47 0,00 0,47 35,56 ± 14,44 ± 7,78 ± 6,67 ± 0,47 0,47 0,47 0,00 48,89 ± 31,11 ± 13,33 ± 11,11 ± 0,47 0,47 0,47 0,47 45,56 ± 33,33 ± 22,22 ± 20,00 ± 0,47 0,00 1,25 0,82 17,78 ± 8,89 ± 4,44 ± 2,22 ± 0,47 0,47 0,00 0,47 38,89 ± 26,67 ± 20,00 ± 18,89 ± 0,94 0,82 0,0 0,47 35,56 ± 25,56 ± 24,44 ± 22,22 ± 1,25 0,47 0,47 0,47 44,44 ± 30,00 ± 21,11 ± 18,89 ± 2,05 1,63 0,47 0,47 35,56 ± 13,33 ± 4,44 ± 2,22 ± 0,47 0,82 0,47 0,47 30,00 ± 23,33 ± 18,89 ± 17,78 ± 0,82 1,41 0,94 0,47 28,89 ± 23,33 ± 21,11 ± 20,00 ± 0,47 0,82 1,63 1,41 100 100 100 100 Ngày 13 13,33 ± 0,82 6,67 ± 0,00 11,11 ± 0,00 18,89 ± 0,47 2,22 ± 0,47 18,89 ± 0,47 22,22 ± 0,47 16,67 ± 0,00 2,22 ± 0,47 17,78 ± 0,47 20,00 ± 1,25 100 Ngày 14 13,33ab ± 0,47 6,67ab ± 0,00 10,00ab ± 0,00 18,89b ± 0,47 2,22a ± 0,47 18,89b ± 0,47 22,22b ± 0,47 16,67ab ± 0,00 2,22a ± 0,47 16,67ab ± 0,00 20,00b ± 1,41 100c Ghi : chữ a, b, c thể khác biệt có ý nghĩa với p