Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus nhược độc phục vụ chế tạo vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá biển

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VI KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS NHƯỢC ĐỘC PHỤC VỤ CHẾ TẠO VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN CÁ BIỂN Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Phạm Thị Tâm Sinh viên thực : Hà Huy Tùng Lớp: 12-02 Hà Nội – 2016 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán thuộc Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập hoàn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Tâm Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, người trực tiếp tận tình hướng dẫn dìu dắt em suốt trình em thực tập hoàn thành đề tài Em quên gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, anh chị khóa trước, bạn bè bên em, tận tình giúp đỡ, cổ vũ động viên suốt thời gian em thực tập hoàn thiện đề tài Trong trình thực tập không tránh khỏi sai sót, kính mong thầy cô giáo, anh chị bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Hà Huy Tùng Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung BHI broth Brain Heart Infusion Broth BHI Brain Heart Infusion bp Base pair DĐ Di động DH Dung huyết DNA Deoxyribonucleotide Acid Dntp Deoxynucleotitde ddNTP Dideoxynucleotitde EDTA Ethyllene diamine tetra acetic acid In Indol Kb Kilobase pairs KIA Kligler Iron Agar Lac lactose LB Lubria – Bertani PCR Polymerase Chain Reaction Rif Rifampicin TAE Tris - acetate – EDTA TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose TDH Thermostable direct haemolysin TLH Thermolabile haemolysin TRH Thermostable direct related haemolysin UV Ultrviolet light Vp-toxRS V parahaemolyticus toxRS MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát bệnh vi khẩn Vibrio parahaemolyticus 1.1.1 Tình hình giới .3 1.1.2 Tình hình nước 1.2 Tổng quan bệnh hoại tử gan thận cá biển 1.3 Tổng quan Vibrio parahaemolyticus 1.3.1 Đặc điểm Vibrio parahaemolyticus 1.3.2 Đặc tính sinh hóa Vibrio parahaemoluticus 12 1.3.4 Cơ chế gây bệnh Vibrio parahaemolyticus 14 1.4 Các phương pháp tạo chủng nhược độc 15 1.4.1 Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn .15 1.4.2 Các tác nhân tạo chủng nhược độc 18 1.4.2.1 Tác nhân vật lý 18 1.4.2.2 Tác nhân hóa học 20 1.5 Đặc điểm hệ miễn dịch cá xương 24 1.5.1 Miễn dịch đặc hiệu 24 1.5.2 Miễn dịch tự nhiên 25 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Môi trường dung dịch nuôi cấy 26 2.1.4 Thiết bị .28 2.2 Nội dung nghiên cứu .29 2.3 Phương pháp nuôi cấy giữ chủng vi sinh vật môi trường LB lỏng,rắn môi trường đặc hiệu 30 2.4 Phương pháp gây đột biến kháng sinh rifampicin 30 2.5 Phương pháp đánh giá mức độ nhược độc chủng đột biến .31 2.5.1 Thử khả dung huyết dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến nhược độc .31 SV: Hà Huy Tùng - 1202 2.5.2 Phương pháp sinh học phân tử 32 2.5.2.1 Phương pháp tách DNA tổng số 32 2.5.2.2 Phương pháp điện di DNA gel agarose .33 2.5.2.3 Khuếch đại gen độc tố gây bệnh hoại tử thận kỹ thuật PCR(Polymerase Chain Reaction) 34 2.5.3 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 36 PHẦN III: KẾT QUẢ .38 3.1 Kết lựa chọn tác nhân đột biến kháng sinh để gây đột biến chủng V.parahaemolyticus .38 3.2 Kết đánh giá mức độ giảm độc lực dòng V parahaemolyticus đôt biến 41 3.2.1 Kết thử khả dung huyết dòng V parahaemolyticus đột biến 41 3.2.2 Kết chạy PCR xác định gen độc tố dòng V.parahaemolyticus đột biến 44 Chúng tiến hành kiểm tra gen độc tố Tox R, tdh, tlh, trh dòng đột biến chủng A3.13 tự nhiên kết thể Bảng 3.3.Hình 3.4 .45 3.3 Kết xác định độc lực dòng V.parahaemolyticus cá .46 3.4 Kết đánh giá chủng V.parahaemolyticus đột biến nhược độc theo định hướng sản xuất vắc-xin 50 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 SV: Hà Huy Tùng - 1202 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Hình 1.2 Tác động tia tử ngoại tạo dimer thymine 19 Hình 1.3.Cấu trúc RNA polymerase (RNAP) 22 Hình 1.4 Vùng kháng Rif tiểu đơn vị β RNAP [13] 23 Hình 1.5 Đột biến kháng Rif vùng I gen rpoB .23 Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu .29 Hình 3.1 Khuẩn lạc chịu môi trường TCBS có bổ sung kháng sinh .40 Hình 3.2 Khả dung huyết chủng A3.13 Dòng 43 Hình 3.3 Sản phẩm điện di DNA tổng số dòng chủng A3.13 45 Hình 3.4: Sản phẩm PCR xác định gen độc tố Tox R, tlh 46 Hình 3.5 Cá sau gây nhiễm chủng đột biến, chủng đối chứng A3.13 cá khoẻ mạnh 49 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các thiết bị 28 Bảng 2.2.Thành phần phản ứng 35 Bảng 2.3: Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR .36 Biểu đồ 3.1: Kết đột biến lần 40 Bảng 3.1 Kết tạo dòng vi khuẩn kháng kháng sinh 41 Bảng 3.2 Kết khả dung huyết dòng V 42 parahaemolyticus đột biến 42 Bảng 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen độc tố dòng V.parahaemolyticus đột biến 45 Bảng 3.4 Kết gây nhiễm cá sau 15 ngày tiêm dòng V.parahaemolyticus đột biến .47 Bảng 3.5 Kết đánh giá khă sinh kháng thể bảo hộ cho cá dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến nhược độc so với chủng đối chứng 51 SV: Hà Huy Tùng - 1202 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Việt Nam quốc gia ven biển nằm bên bờ Tây Biển Đông, có bờ biển dài 3.260 km trải dài từ Bắc tới Nam tạo điều kiện thuận lợi cho hình thành phát triển kinh tế, đặc biệt nghề nuôi trồng thủy hải sản Nuôi trồng thủy sản ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm phát triển nhanh giới, mang lại tiềm to lớn để đẩy mạnh chiến lược phát triển kinh tế biển Theo thống kê Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn) ước tính hết quý I/ 2016, Tổng sản lượng thủy sản ước đạt 1,27 triệu tấn, tăng 2,9% so với kỳ Trong đó, sản lượng khai thác thủy sản 722,1 nghìn tấn, tăng 3,7% sản lượng nuôi trồng thủy sản ước đạt 549,6 nghìn tấn, tăng 1,9% so với kỳ năm trước.Ngành thủy sản dần hướng tới phát triển bền vững ngành xuất hàng hóa lớn, có khả cạnh tranh cao hội nhập vững với giới Hiện nay, đối tượng nuôi mô hình nuôi thủy sản Việt Nam phong phú.Trong đó, mô hình nuôi cá lồng ngày khẳng định vị trí Đây mô hình áp dụng cho nhiều loài cá có giá trị kinh tế cao Cá nuôi lồng phải chịu nhiều yếu tố gây stress phải thích nghi với môi trường sống mới, tập quán sinh sản kiếm ăn bị đảo lộn, sức đề kháng bị ảnh hưởng Vì thế, cá nuôi lồng thường mắc số bệnh vi khuẩn virus gây Đáng lưu ý bệnh hoại tử gan thận cá biển chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, làm thiệt hại không nhỏ đến người nuôi cá biển Bệnh hoại tử gan thận xuất hầu hết loài cá biển (cá mú, cá chẽm, cá giờ, cá hồng, cá bớp…), đặc biệt cá nuôi lồng, xuất cá nước Khi vi khuẩn V parahaemolyticus xâm nhập vào thể cá biển, gây hoại tử lên nội quan cá (đặc biệt gan, thận), lở loét lớp biểu bì Gan thận bị hoại tử, gan từ màu xám nâu chuyển thành màu vàng, làm cho cá biển chết hàng loạt Bệnh thường xảy giai đoạn cá, SV: Hà Huy Tùng - 1202 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học tìm phương pháp phòng trị bệnh hạn chế tổn thất dịch bệnh gây cần thiết Thực tế nuôi trồng thủy sản, người dân thường sử dụng nhiều hóa chất kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh gây tượng nhờn thuốc không mang lại hiệu cao Vi khuẩn có khả tạo màng bảo vệ trước thuốc diệt khuẩn kháng sinh Chính thế, dịch bệnh thường bùng phát trở lại nhanh sau thuốc hết tác dụng Mặt khác, dư lượng kháng sinh sản phẩm từ cá biển gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt cá sức khỏe người Hiện phương pháp phòng bệnh hiệu sủ dụng vắc-xin Việc nghiên cứu loại vắc-xin phòng bệnh tương đối cần thiết Một bước quan trọng để nghiên cứu vắc-xin phải tạo chủng vi khuẩn nhược độc, làm sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắcxin bệnh hoại tử gan thận cá biển Xuất phát từ lý luận thực tiễn trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cá biển.” làm sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh hoạt tử gan thận cá biển Mục tiêu đề tài Tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc để phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận số loại cá biển Nội dung nghiên cứu Tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc kỹ thuật đột biến sử dụng kháng sinh rifampicine Đánh giá đặc tính chủng đột biến: + Đánh giá lại khả dung huyết + Đánh giá mức độ an toàn chủng nhược độc cá Đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá sử dụng vi khuẩn nhược độc SV: Hà Huy Tùng - 1202 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát bệnh vi khẩn Vibrio parahaemolyticus 1.1.1 Tình hình giới Hiện giới ngành nuôi trồng thủy sản phát triển, kể đến nước đứng đầu sản lượng nuôi trồng thủy sản theo thứ tự gồm: Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Bangladesh, Chile, Nhật Bản, Na Uy Philippines Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy hải sản bị gây trở ngại nạn dịch bệnh lây lan khắp nơi Các dịch bệnh thường xảy thủy hải sản bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh còi,… tôm nuôi, bệnh xuất huyết virus, bệnh Indivirus… cá, bệnh nhóm Vibrio sp., nấm…gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng thủy hải sản [26] Một tác nhân gây bệnh đáng quan tâm bệnh nhóm vi khuẩn Vibriosp gây cho động vật thủy hải sản (tôm, cá) Chúng gây bệnh qua tất giai đoạn động vật thủy sản xem nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng giống thủy hải sản Nhiều trường hợp nhiễm bệnh phát Australia, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan nhiều loài thủy hải sản khác Các giảm sút gần ngành nuôi trồng thủy hải sản Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines Trung Quốc chủ yếu tác động nhóm vi khuẩn Vibriosp [26] Nhóm vi khuẩn Vibrio xác định tác nhân gây bệnh phổ biến loài cá biển giới Theo Peggy and Ruth (2009), tỷ lệ cá chết nhiễm Vibrio 50% đợt dịch, cá có dấu hiệu hôn mê, màu sắc thể biến đổi xuất vùng hoại tử Khi cá bệnh nặng nội quan xuất huyết bên chứa đầy dịch lỏng SV: Hà Huy Tùng - 1202 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học V parahaemolyticus Fujino phát lần vào mùa hè năm 1951 vùng ven biển Nhật Bản sau vụ ngộ độc ăn cá, hàu…Người ta xác định đuợc 21 loài thuộc giống Vibrio, có loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm V cholera, V parahaemolyticus, V vulnificus, V Alginolyticus,V cholera phân bố rộng khắp với số lượng lớn lan tới chân Mỹ, gây bệnh dịch tả cho số vùng châu Á, Ấn Độ Đông Nam Á Chúng gây đại dịch lây truyền qua tiếp xúc, nước, sữa, thực phẩm côn trùng [28] V parahaemolyticus vi sinh vật biển, tồn tự nhiên nước biển, thường gặp loại hải sản loại nhuyễn thể giáp sát nước biển Năm 1883, vi khuẩn V anguillarum lần phát thuộc giống Vibrio gây bệnh cá phân lập từ cá chình nuôi Địa Trung Hải Canestrini Tuy nhiên, quan tâm ngày nhiều nghề nuôi cá giới giúp hiểu cách rõ ràng dịch bệnh vùng nuôi, hệ thống nuôi loài vi khuẩn bùng nổ dịch bệnh Chẳng hạn, V alginolyticus xác định tác nhân thứ cấp tham gia gây bệnh cá trap (Sparus aurata) nuôi Israel loài cá bị thương tổn Trong theo Muroga cộng (1979) Bioscas (1991), vi khuẩn V vulnificus tác nhân gây bệnh cho cá chình Nhật Bản, với V anguillarum, V ordalii V salmonicida xuất tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho cá hồi nuôi Thái Bình Dương Đại Tây Dương [29] Năm 2001, Vibrio alginolyticus xác định tác nhân gây bệnh cá bớp có dấu hiệu lở loét Đài Loan Đến năm 2006 Vibrio vulnificus xác định nguyên nhân gây bệnh cá bớp Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu thức cá bớp bị lở loét nuôi Đồng Bằng Sông Cửu Long Trong báo này, trình bày kết phân SV: Hà Huy Tùng - 1202 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội độ kháng sinh 20µg/ml Dòng Đột biến lần từ chủng tự β β β γ γ γ β γ γ γ γ γ nhiên A3.13 chịu nồng độ kháng sinh 25µg/ml Dòng Đột biến lần từ chủng tự nhiên A3.13 chịu nồng độ kháng sinh 30 µg/ml Ghi chú: γ không dung huyết, β dung huyết Qua bảng 3.2 ta nhận thấy nồng độ pha loãng 1/2 tất dòng có khả dung huyết chứng tỏ dòng chứa gen độc tố, pha loãng đến 1/4 1/8 số dòng có khả dùng huyết pha loãng 1/16, 1/32, 1/64 hầu hết dòng không khả dung huyết, chủng tự nhiên A3.13 khả dung huyết độ pha loãng nồng Do nhận thấy có giảm độc tố pha loãng nồng độ khác A3.13 Không xuất vòng dung huyết Xuất dung huyết vòng dung huyết rõ Hình 3.2 Khả dung huyết chủng A3.13 Dòng SV: Hà Huy Tùng - 1202 43 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Qua kết thử khả dung huyết dòng vi khuẩn thu kết là: - Chủng tự nhiên A3.13 dòng có khả dung huyết nồng độ pha loãng từ 1/2 - 1/64 - Dòng 1, dòng 3, dòng dòng có khả dung huyết hầu hết nồng độ pha loãng từ 1/2 -1/16 - Dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng dòng khả dung huyết hầu hết nồng độ pha loãng từ 1/4, 1/2 đến 1/64 Từ chọn dòng đột biết theo chiều hướng giảm độc lực là: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng Chúng tiếp tục sử dụng dòng để tiếp tục đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá 3.2.2 Kết chạy PCR xác định gen độc tố dòng V.parahaemolyticus đột biến Các dòng vi khuẩn lựa chọn nghiên cứu mục 3.2.1 tiếp tục sử dụng để xác định gen độc tố Mục đích thí nghiệm để xác định chế giảm độc lực chủng nghiên cứu Các dòng vi khuẩn: dòng 1, dòng 2, dòng 3, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng 7, dòng 8, A3.13, nuôi cấy môi trường BHI, đem tăng sinh khối máy lắc vòng 24h, 28ºC với tốc độ 150 vòng/phút Sau đem dịch nuôi cấy ly tâm thu cặn tế bào Điện di kiểm tra lại Kết thể (Hình 3.3) SV: Hà Huy Tùng - 1202 44 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội (M: maker; 9: A3.13; 1: dòng 1; 2: dòng 2; 3: dòng 3; 4: dòng 4; 5: dòng 5; 6: dòng 6; 7: dòng 7; 8: dòng 8; M: maker.) Hình 3.3 Sản phẩm điện di DNA tổng số dòng chủng A3.13 Kết thể qua Hình 3.3 cho thấy kết tách DNA tốt, sản phẩm dùng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR Chúng tiến hành kiểm tra gen độc tố Tox R, tdh, tlh, trh dòng đột biến chủng A3.13 tự nhiên kết thể Bảng 3.3.Hình 3.4 Bảng 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen độc tố dòng V.parahaemolyticus đột biến Dòng Tox R Tdh Tlh trh A3.13 Có Có Có Không Dòng Có Không Có Không Dòng Có Không Có Không Dòng Có Không Có Không Dòng Có Không Có Không Dòng Có Không Có Không Dòng Có Không Có Không Dòng Có Không Có Không Dòng Có Không Có Không SV: Hà Huy Tùng - 1202 45 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Qua bảng kết kiểm tra gen độc tố dòng đột biến chủng A3.13 chứng tỏ gen độc tố chủng sau xử lý rifampicin hoàn toàn giống số lượng kích thước so với chủng tự nhiên Theo nghiên cứu Zulkifli cộng sự, 1987 2009 [31] Gen toxR có mặt tất chủng không gây bệnh chủng gây bệnh, có chức điều hòa biểu gen độc tố loài V parahaemolyticus Sự có mặt gen dòng vi khuẩn chứng tỏ chúng V.parahaemolyticus trình gây đột biến tượng tạp nhiễm Gen Tox R (368bp) Gen tlh (450bp) Hình 3.4: Sản phẩm PCR xác định gen độc tố Tox R, tlh Từ kết đánh giá mức độ giảm độc lực độc tố dung huyết kết xác định gen đôc tố PCR cho phép bước đầu kết luận sơ rằng: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng dòng vi khuẩn bị đột biến gen theo hướng giảm độc lực Tuy nhiên, để làm rõ chế đột biến, gen phân tích trình tự để xác định kiểu đột biến, dự đoán có tượng đột biến điểm gen độc tố 3.3 Kết xác định độc lực dòng V.parahaemolyticus cá Vi khuẩn V parahaemolyticus vi khuẩn gây bệnh cá biển, nhiên gây bệnh số loại cá nước ngọt, khóa luận thực gây nhiễm cá rô phi Trên đối tượng động vật mẫn cảm, sử dụng rô phi có kích thước 3cm để gây nhiễm dòng vi khuẩn gây đột biến dòng SV: Hà Huy Tùng - 1202 46 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội tự nhiên A3.13, Liều tiêm cho cá 0,5ml canh khuẩn chứa 103CFU/ml – 106CFU/ml Cá thí nghiệm nuôi điều kiện cho giống tự nhiên, thời gian theo dõi 15 ngày Kết tiến hành gây nhiễm thực nghiệm dòng đột biến dòng tự nhiên ban đầu A3.13 cho rô phi phòng thí nghiệm có kết cụ thể Bảng 3.4 Hình 3.5 Bảng 3.4 Kết gây nhiễm cá sau 15 ngày tiêm dòng V.parahaemolyticus đột biến Liều gây Tỷ lệ Dòng vi Số cá thí Số cá Thời gian STT nhiểm chết khuẩn chết nghiệm sống sót (CFU/ml) (%) 103 30 100 3-7 ngày A3.13 104 30 100 3-7 ngày đối chứng 105 30 100 3-7 ngày 106 30 100 3-7 ngày 103 30 90 5-8 ngày 104 30 90 5-8 ngày 105 30 93,3 5-8 ngày 106 30 96,7 5-8 ngày 103 30 25 16,7 8-10 ngày 104 30 25 16,7 8-10 ngày 105 30 24 20 8-10 ngày 106 30 21 30 8-10 ngày 103 30 83,3 3-7 ngày 104 30 90 3-7 ngày 105 30 90 3-7 ngày 106 30 93,3 3-7 ngày 103 30 23 23,3 8-10 ngày Dòng Dòng Dòng SV: Hà Huy Tùng - 1202 47 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội 10 Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng Nước cất 104 30 22 26,7 8-10 ngày 105 30 19 36,7 8-10 ngày 106 30 17 43,3 8-10 ngày 105 30 27 10 5-8 ngày 105 30 26 13.3 5-8 ngày 105 30 23 23,3 5-8 ngày 105 30 22 26.7 5-8 ngày 103 30 24 20 5-8 ngày 104 30 24 20 5-8 ngày 105 30 24 20 5-8 ngày 106 30 23 23,3 5-8 ngày 103 30 100 3-9 ngày 104 30 100 3-9 ngày 105 30 100 3-9 ngày 106 30 100 3-9 ngày 103 30 28 6,7 5-7 ngày 104 30 27 10 5-7 ngày 105 30 25 16,7 5-7 ngày 106 30 22 26,7 5-7 ngày 30 30 0 Lô cá có gây bệnh với dòng 1, dòng 3, dòng chủng tự nhiên A3.13 sau 48-72 gây nhiễm cá bắt đầu chết Biểu hiển có xuất huyết toàn thân nội tạng, biếng ăn, lờ đờ, hoạt động Chủng tự nhiên A3.13 dòng gây chết hoàn toàn cá thí nghiệm, dòng 2-5 con, dòng 1-3 nồng độ khác nhau, dòng có tượng hoại tử gan thận rõ ràng SV: Hà Huy Tùng - 1202 48 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Các lô cá có gây nhiễm với dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng 8, cho số lượng cá sống sót cao hơn, từ 20-27 sau 2448 lây nhiễm cá có tượng ăn hoạt động Tuy vậy, sau 48 cá hoạt động lại bình thường Một số cá bị chết bị stress tiêm Cá tiêm chủng A3.13 đối chứng Cá tiêm chủng đột biến Cá khoẻ mạnh không tiêm Hình 3.5 Cá sau gây nhiễm chủng đột biến, chủng đối chứng A3.13 cá khoẻ mạnh Lô cá tiêm chủng A3.13 đối chứng, dòng 1, dòng 3, dòng cá chết có biểu bệnh hoại tử gan thận vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây như: cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn Cơ thể có màu đen đặc biệt vùng lưng vết thương tổn da, vây sưng lên bị lở loét Cơ hạch, mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục Lớp da có nhiều sắc tố melanin màu đen thể dấu hiệu hoại tử, có tượng lở loét lớp biểu bì Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử SV: Hà Huy Tùng - 1202 49 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học lan nhanh, hoá lỏng lách có màu đỏ anh đào, dần hình dạng ban đầu nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng Các quan bên khoang bụng xuất mạch máu rõ lên Tim cá bị bệnh xuất vết nâu đen Cá tiêm chủng đột biến dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng biểu bênh hoại tử gan thận vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây Như vậy, từ kết thu thí nghiệm gây đột biến đánh giá mức độ giảm độc lực, xác định dòng vi khuẩn nhược độc, dòng: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng 3.4 Kết đánh giá chủng V.parahaemolyticus đột biến nhược độc theo định hướng sản xuất vắc-xin Một chủng vi khuẩn nhược độc đạt tiêu chuẩn sản xuất vắc-xin đạt hai tiêu chí: 1) an toàn động vật mẫn cảm 2) có khả sinh kháng thể bảo hộ Từ kết xác định dòng vi khuẩn nhược độc, tiếp tục đánh giá hai tiêu chí dòng vi khuẩn đột biến là: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng Cá mú sử dụng cho nghiên cứu có kích thước 3cm, mạnh khỏe, kiểm tra không nhiễm bệnh hoại tử gan thận phản ứng PCR Liều gây miễn dịch cho cá 105CFU/ml, sau gây miễn dịch sở 15 ngày, cá thử thách chủng tự nhiên A3.13 với liều công cường độc 107CFU/ml (Yong-hua Hu, Tian Deng, Bo-guang Sun, Li Sun,2012) Kết thể Bảng 3.5 SV: Hà Huy Tùng - 1202 50 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Bảng 3.5 Kết đánh giá khă sinh kháng thể bảo hộ cho cá dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến nhược độc so với chủng đối chứng Liều gây nhiễm 105 CFU Dòng 107 CFU 109 CFU 1011 CFU số cá số cá số cá số cá số cá số cá số cá số cá ban sống ban sống ban sống ban sống đầu sót đầu sót đầu sót đầu sót Dòng 30 24 30 20 30 18 30 14 Dòng 30 19 30 19 30 18 30 16 Dòng 30 23 30 21 30 16 30 13 Dòng 30 24 30 19 30 13 30 10 Dòng 30 25 30 22 30 18 30 13 Chủng đối chứng A3.13 30 30 30 30 Qua bảng kết thu thấy khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá dòng cao nhất, dòng 2, dòng Trạng thái bệnh tích dòng gần giống chậm chạp, lờ đờ, ăn, không xuất huyết, cá chết sau 24 bị stress sau tiêm Ở kết gây cảm nhiểm cho cá số cá chết dòng cao dòng 6, qua kết thử khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá số cá chết dòng lại cao dòng Và số cá chết dòng lại có dấu hiệu bệnh hoại tử gan thận vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây Từ kết kết luận dòng: dòng 2, dòng 4,dòng 5, dòng 8, có khả sinh kháng thể bảo hộ cá, dòng sử dụng làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin Và không nên sử dụng dòng để làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin dòng có đột biến giảm độc lực khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá thấp gây chết cá SV: Hà Huy Tùng - 1202 51 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Từ chủng Vibrio parahaemolyticustự nhiên A3.13 phân lập từ gan ruột cá hồng có dấu hiệu hoại tử Cát Bà, Hải Phòng Chúng tiến hành sử dụng kháng sinh rifampicin để tạo chủng nhược độc Chúng tạo dòng đột biến cụ thể là: dòng 1(Chịu nồng độ kháng sinh 10µg/ml), dòng (Chịu nồng độ kháng sinh 15µg/ml), dòng (Chịu nồng độ kháng sinh 20µg/ml), dòng (chịu nồng độ kháng sinh 25 µg/ml), dòng (chịu nồng độ kháng sinh 30µg/ml), dòng (Chịu nồng độ kháng sinh 35µg/ml), dòng (chịu nồng độ kháng sinh 40µg/ml), dòng (chịu nồng độ kháng sinh 45µg/ml) - Từ dòng vi khuẩn qua đánh giá mức độ giảm độc lực môi trường thạch máu, PCR cá Chúng xác định dòng vi khuẩn nhược độc, dòng: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng - Từ dòng vi khuẩn đánh giá khả sinh kháng thể bảo hộ chúng xác định dòng:dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 8, có khả sinh kháng thể bảo hộ cá Khả tạo kháng thể bảo hộ dòng cao với tỷ lệ cá sống lên đến 93,3%, dòng dòng tỷ lệ cá sống 86,6% dòng tỷ lệ cá sống 80% Các dòng sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất vắc-xin Kiến nghị - Đánh giá, phân tích chế đột biến - Tiếp tục đánh giá dòng vi khuẩn đột biến lựa chọn dòng có vi khuẩn an toàn nhất, tạo đáp ứng miễn dịch bền vững để nghiên chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển SV: Hà Huy Tùng - 1202 52 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học - Qua kết chạy PCR thấy kích thước số lượng gen không thay đổi so với chủng gốc ban đầu, vi khuẩn đột biến giảm độc lực Chúng nghi ngờ đột biến điểm để kiểm tra xác dạng đột biến cần giải trình tự gen đột biến so với gen tự nhiên góc ban đầu Nhưng thời gian có hạn nên hoàn thành đề tài với nội dung SV: Hà Huy Tùng - 1202 53 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr186-198 [2] Trần Linh Thước (2005), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nxb Giáo dục [3] Từ Thanh Dung (2011), Thử nghiệm văcxin phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra nuôi thâm canh, Tạp chí thương mại thủy sản Tài liệu tiếng Anh [4] Alsina M and Blanch A.R (1994) Improvement and update of a set of keys for biochemical-identification of Vibrio species, Journal of Applied Bacteriology 77: 719-721 [5] Austin B., Austin D.A (2007) Vibrios, bacterial fish pathogens: diseases in farmed and wild fish, Praxis Publishing Ltd, Chichester, UK, p 594 [6] Benjamin R.L., Scott E.L., Douglas R.C., Kenneth D.C (2008), Isolation of Rifampicin resistant Flavobacterium psychrophilum strains and their potential as live attenuated vaccine candidates,Vaccine 26: 5582 – 5589 [7] Chao G., Jiao X., Zhou X., Yang Z., Huang J., Zhou L., Qian X (2009), Distribution, prevalence, molecular typing, and virulence of Vibrio parahaemolyticusisolated from different sources in coastal province Jiangsu, China, Food Control 20: 907-912 [8] Christopher A.B., Thomas J.C., Kim O (2011),Vibrio parahaemolyticus cell biology and pathogenicity determinants", Microbes and Infection 13: 992-1001 SV: Hà Huy Tùng - 1202 54 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội [9] Daniels N.A., MacKinnon L., Bishop R., Altekruse S., Ray B., Hammond R.M., Thompson S., Wilson S., Bean N.H., Griffin P.M., Slutsker L (2000),Vibrio parahaemolyticus infections in the United States 1973–1998 Journal of Infectious Diseases 181: 1661 – 1666 [10] Elizabeth A.C., NataliyaK., Arkady M., Katsuhiko M., Satish N., Alex G., Seth A.D (2001), Structural mechanism for Rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase,Cell 104: 901 – 912 [11] FriesenJ.D Archambault J (1993), Genetics of eukaryotic RNA polymerases I, II, and III Microbiology and Molecular Biology Reviews: 57(3):p 703-724 [12] Harikrishnan R., Balasundaram C., Heo M.S (2010), Molecular studies, disease status and prophylactic measures in grouper aquaculture: Economic importance, diseases and immunology, Aquaculture 309: 1-14 [13] Harris K.A., Hartley J.C (2003), Development of broad-range 16S rDNA PCR for use in the routine diagnostic clinical microbiology service, Journal of Medical Microbiology 52: 685-691 [14] Kaneko T., Colwell R.R (1973), Ecology of Vibrio parahaemolyticus in Chesapeake Bay", Journal of Bacteriology 113: 24-32 [15] Kaper J.B., Colwell R.R., Joseph S.W., Colwell R.R., Kaper J.B (1983),Vibrio parahaemolyticus and related halophilic vibrios Critical Rev Microbiol 10: 77-123 [16] Kazuyuki K., Shigeko T., Hiroo I (1979), Effect of Mediumon Flagellation of Vibrio parahaemolyticus, Appied and Environmental Microbioogyl 37: 1248-1249 [17] KumarK.P., Chatterji D (1992), Differential inhibition of abortive transcription initiation at different promoters catalysed by E.coli RNA polymerase – effect of Rifampicin on purine or pyramidine–initiated phosphodiester synthesis, Federation of European biochemical societiesletter306 (1): 46 -50 SV: Hà Huy Tùng - 1202 55 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội [18] Lee, A.S.G., Irene H.K., Lim, Lynn L.H Tang Sin Yew Wong,(2005) High frequency of mutations in the rpoB gene in Rifampicin – resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Singapore Journal of Clinical Microbiology, 43(4): 2026 – 2027 [19] Nash G., Anderson I.G., Shariff M., Shamsudin M.N (1987), Bacteriosis associated with epizootic in the giant sea perch, Lates calcarifer, and the estuarine grouper, Epinephelus tauvina, cage cultured in Malaysia, Aquaculture 67:105-111 [20]Shyne A.P.S, Sobbhana K S, George K C, Phenotypic characteristics parahaemolyticus and antibiotic Paul R.R (2008) sensitivity of Vibrio strains isolated from diseases grouper (Epinephelus spp.), joumal of the marine biological association 50: 1-6 [21] Tuyet D.T., Thiem V.D., Von S.L., Chowdhury A., Park E., Canh D.G., Chien B.T., Van T.T., Naficy A., Rao M.R., Ali M., Lee H., Sy T.H., Nichibuchi M., Clemens J., Trach D.D (2006), Clinical, epidemiological, and socioeconomic analysis of an outbreak of Vibrio parahaemolyticus in Khanh Hoa Province, Vietnam Journal of Infectious Diseases 186(11): 1615–1620 [22] Uribe C., Folch H., Enriquez R and Moran G (2011), Innate and adaptive immunity in teleost fish: a review, Veterinarni Medicina 56(10): 486–503 [23] Van W.B (2008),A history of fish immunology and vaccination The early days, Fish Shellfish Immunol 25: 397-408 [24] Zhang X.H and Austin B (2005), “A review haemolysins in Vibrio species”, Journal of Applied Microbiology 98: 1011–1019 [25] Zulkifli Y., Alitheen N.B., Son R., Yeap S.K, Lesley M.B and Raha A.R (2009), “Identification of Vibrio parahaemolyticus isolates by PCR SV: Hà Huy Tùng - 1202 56 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học targeted to the toxR gene and detection of virulence genes”, International Food Research Journal 16: 289-296 Tài liệu internet [26] http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-tim-hieu-ve-vibrio-sp-gay-benh-tren- thuy-san-11372/ [27] http://thuvienluanvan.info/luan-van/tim-hieu-ve-vibrio-sp-gay-benhtren-thuy-san-38786/ [28] http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BB%AD_ngo%E1%BA%A1i [29] http://vietfish.org/thu-nghiem-vacxin-phong-benh-gan-than-mu-chocatra-nuoi-tham-canh.htm [30] http://www.tuamvisinh.com/tin-tuc/kiem-tra-dinh-tinh-vibrio-choleravibrio-parahaemolyticus.html SV: Hà Huy Tùng - 1202 57