Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn photobacterium damselae nhược độc phục vụ chế tạo vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trên cá biển

Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học VIệN ĐạI HọC Mở HÀ NộI KHOA CÔNG NGHệ SINH HọC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VI KHUẨN PHOTOBACTERIUM DAMSELAE NHƯỢC ĐỘC PHỤC VỤ CHẾ TẠO VẮC-XIN PHÒNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÊN CÁ BIỂN Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Phạm Thị Tâm Sinh viên thực : Đỗ Thị Tuyết Nhung Lớp : 12.02 Hà Nội – 2016 Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 i Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học LờI CảM ƠN Trước hết, em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán thuộc Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập hoàn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Tâm Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, người trực tiếp tận tình hướng dẫn dìu dắt em suốt trình em thực tập hoàn thành đề tài Em quên gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, anh chị khóa trước, bạn bè bên em, tận tình giúp đỡ, cổ vũ động viên suốt thời gian em thực tập hoàn thiện đề tài Trong trình thực tập không tránh khỏi sai sót, kính mong thầy cô giáo, anh chị bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2016 Sinh viên Đỗ Thị Tuyết Nhung Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 ii Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Từ viết tắt P.damselae Photobacterium damselae BHI Broth Brain Heart Infusion Agar TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose UV Ultraviolet kDa Kilo Dalton BCG: Bacillus Calmette Guerin Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 iii Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học MụC LụC LờI CảM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MụC LụC MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát bệnh vi khuẩn P.damselae 1.1.1 Lịch sử phát bệnh giới 1.1.2 Lịch sử phát bệnh Việt Nam 1.2 Tổng quan bệnh tụ huyết trùng cá biển 1.3 Tổng quan Photobacterium damselae 1.3.1 Phân loại khoa học 1.3.2 Đặc điểm hình thái 1.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.3.4 Độc tố vi khuẩn chế gây bệnh 1.3.5 Nghiên cứu tạo Vac-xin vi khuẩn cho cá biển: 11 1.4 Tổng quan tạo chủng vi khuẩn nhược độc 13 1.4.1 Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhược độc 13 1.4.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 1.4.1.2 Tình hình nghiên cứu nước: 14 1.4.2 Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn: 15 1.4.3 Các tác nhân tạo chủng nhược độc 17 1.4.3.1 Tác nhân vật lý 17 1.5 Đặc điểm hệ miễn dịch cá xương 24 1.5.1 Miễn dịch đặc hiệu 24 1.5.2 Miễn dịch tự nhiên 25 PHầN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 iv Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học 2.2 Vật liệu nghiên cứu 26 2.2.1 Hóa chất 26 2.2.2 Môi trường dung dịch nuôi cấy 26 2.2.3 Thiết bị 27 2.2 Nội dung nghiên cứu 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phương pháp vi sinh 29 2.3.2 Phương pháp tạo chủng nhược độc kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm 29 2.3.2.1 Phương pháp gây đột biến tia cực tím 29 2.3.2.2 Phương pháp gây đột biến kháng sinh rifampicin 31 2.3.4 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 31 PHầN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết tạo chủng đột biến nhược độc 33 3.1.1 Đánh giá khả gây bệnh chủng gốc Photobacterium damselae 33 3.1.2 Đánh giá sơ dòng vi khuẩn gây đột biến 35 3.1.2.1 Dòng vi khuẩn gây đột biến tác nhân tia UV 35 3.1.2.1 Dòng vi khuẩn gây đột biến tác nhân kháng sinh rifampicin 37 3.2 Đánh giá mức độ an toàn chủng đột biến 39 3.3 Đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 KẾT LUẬN 42 KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 v Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học DANH MụC BảNG BIểU Bảng 1.1 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn P.damselae Bảng 3.1 Đánh giá khả gây bệnh chủng gốc Photobacterium damselae cá 33 Bảng 3.2 Số khuẩn lạc sống sót sau xử lý UV 35 Bảng 3.3 Kết đánh giá sơ dòng vi khuẩn gây đột biến tác nhân tia UV cá mú 36 Bảng 3.4 Số khuẩn lạc sống sót sau xử lý kháng sinh rifampicin 37 Bảng 3.5 Kết đánh giá sơ dòng vi khuẩn gây đột biến tác nhân kháng sinh rifampicin cá mú 38 Bảng 3.6 Đánh giá mức độ an toàn chủng đột biến 40 Bảng 3.7 Kết đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ chủng 41 Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 vi Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học DANH MụC HÌNH Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn P.damselae kính hiển vi điện tử Hình 1.2 Tác động tia tử ngoại tạo dimer thymine 19 Hình 1.3: Tác động tia UV làm cho DNA có chỗ phình cấu trúc 20 Hình 1.4: Cấu trúc RNA polymerase (RNAP) 22 Hình 1.5 Vùng kháng Rif tiểu đơn vị β RNAP 23 Hình 1.6 Đột biến kháng Rif vùng I gen rpoB 23 Hình 2.1 Minh họa thí nghiệm chiếu tia UV 30 Hình 2.2 Vị trí tiêm cá gốc vâyCHƯƠNG III 32 Hình 3.1 Cá rô chết lô tiêm chủng DX3 35 Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 vii MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam đất nước nằm bán đảo Trung Ấn , đựơc thiên nhiên phú cho nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển nghành thuỷ sản Với bờ biển dài 3200 km trải dài suốt 13 vĩ độ Bắc Nam tạo nên khác rõ rệt vùng khí hậu ,thời tiết,chế độ thuỷ học Ven bờ có nhiều đảo ,vùng vịnh hàng vạn hécta đầm phá, ao hồ sông ngòi nội địa,thêm vào lại có ưu vị trí nằm nơi giao lưu ngư trường chính, khu vực đánh giá có trữ lượng hải sản lớn, phong phú chủng loại nhiều đặc sản quí Việt Nam mạnh khai thác nuôi trồng thuỷ sản vùng nước mặn, ,lợ Do thủy sản ngành kinh tế mũi nhọn Việt Nam,có giá trị ngoại tệ xuất đứng hàng thứ tư ngành kinh tế quốc dân (sau dầu, gạo, hàng may mặc) Theo báo cáo Tổng cục Thủy sản,năm 2015 năm khó khăn ngành nông nghiệp nói chung có thủy sản Đó bất lợi từ thời tiết thị trường Nhưng ngành thủy sản đạt kết khả quan nhiều phương diện Với tổng sản lượng thủy sản 6,56 triệu tấn; đó, khai thác 3,03 triệu tấn, nuôi trồng 3,53 triệu tấn; diện tích nuôi trồng 1,28 triệu ha; kim ngạch xuất khoảng 6,72 tỷ USD Trong năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản không ngừng phát triển đặc biệt nghề nuôi cá biển Nghề nuôi cá biển phải kể đến nuôi cá lồng phát triển mạnh mẽ khắp giới Trong vùng ôn đới việc nuôi cá hồi (Salmon) đạt mức tăng trưởng cao vùng nhiệt đới nhiều loài cá nuôi phổ biến cá chẽm, cá mú, cá hồng Qua thống kê cho thấy, nghề nuôi cá phát triển bên cạnh người dân gặp không khó khăn Một số khó khăn vấn đề bệnh dịch Theo số nghiên cứu tác nhân gây bệnh chủ yếu cá biển thường virus, nấm, vi khuẩn nguy hiểm bệnh tụ huyết trùng (xuất huyết nhiễm trùng) vi khuẩn Photobacterium damselae gây Vi khuẩn công gây bệnh cá biển nuôi tất giai đoạn phát triển từ ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm Trong thực tế, để khắc phục tình trạng nhiễm bệnh cá người dân sử dụng thuốc clorin để xử lý môi trường khu vực nuôi sử dụng kháng Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 sinh để khống chế vi khuẩn Tuy nhiên việc làm không đem lại hiệu quả, tình trạng cá nuôi nhiễm bệnh tiếp diễn gây thiệt hại nghiêm trọng cho cư dân nuôi trồng Do đó, người ta nghĩ phương pháp phòng bệnh cho cá trước nhiễm bệnh sử dụng vắc-xin Việc nghiên cứu loại vắc-xin phòng bệnh vô cần thiết Một bước quan trọng để nghiên cứu vắc-xin phải tạo chủng vi khuẩn nhược độc, làm sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng ( xuất huyết nhiễm trùng) cá biển Xuất phát từ lý luận thực tiễn trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng cá biển.” làm sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng cá biển Mục tiêu nghiên cứu Tạo chủng vi khuẩn Photobacterium damselaenhược độc có khả tạo kháng thể bảo hộ cá Nội dung nghiên cứu Tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselaenhược độc kỹ thuật đột biến sử dụng tia UV Tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselaenhược độc kỹ thuật đột biến sử dụng kháng sinh rifampicin Đánh giá lại mức độ gây bệnh qua lây nhiễm cá Đánh giá mức độ an toàn chủng đột biến Đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá sử dụng vi khuẩn nhược độc Địa điểm thời gian nghiên cứu Địa điểm: Đề tài thực Viện Đại học mở Hà Nội Thời gian thực hiện: 07/2015 – 06/2016 Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát bệnh vi khuẩn P.damselae 1.1.1 Lịch sử phát bệnh giới Trùng tượng nhiễm trùng vi khuẩn gọi pseudotuberculosis trường hợp mạn tính, bệnh biểu số quan nội tạng cá nốt sần màu trắng vi khuẩn tích lũy Đó vi khuẩn ưa mặn Photobacterium damselae subsp.piscicida (trước Pasteurella piscicida) yếu tố gây bệnh huyết trùng[30] Bệnh lần phát từ quần thể cá rô trắng (Morone americanus) hoang dã cá vược (Morone saxatilis) vào năm 1963 xảy bệnh dịch vịnh Chesapeake, Hoa Kỳ Sniezsko đồng nghiệp đặt vi sinh vật gây bệnh phân lập từ quần thể cá vào chi Pasteurella sở đặc tính hình thái sinh hóa chúng Sau đó, Jansen Surgalla kiểm tra vi sinh vật phát đủ phân biệt đặc điểm sinh lý, từ đề xuất tên cho chủng vi sinh vật gây bệnh Pasteurella piscicida[30] Căn bệnh dần bùng phát gây ảnh hưởng lớn kinh tế Nhật Bản, khu vực Địa Trung Hải, gây thiệt hại trang trại cá tráp cá chẽm Từ năm 1969, bệnh bệnh nguy hiểm Nhật Bản (Kusuda & Yamaoka, 1972) Từ năm 1990 trở thành mối đe dọa cho trang trại cá Nam Châu Âu Gây thiệt hại kinh tế nước châu Âu khác có Pháp, Ý, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Bồ Đào Nha[28] Bệnh lý bùng phát phụ thuộc vào nhiệt độ thường xảy nhiệt độ nước tăng lên 18-20°C Dưới nhiệt độ này, cá tình trạng ủ bệnh (Romalde, 2002) [36] Vi khuẩn P.damselae có khả tuân thủ xâm nhập vào tế bào biểu mô cá Khả xâm nhập chứng minh trước Magariños et al (1996) Yoshida et al (1997) Tuy nhiên, nghiên cứu Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 10-4 CFU/con 30 17 56,67 15 50 23 76,67 10-5 CFU/con 30 10 33,33 12 40 15 50 10-6 CFU/con 30 0 3,33 3,33 10-7 CFU/con 30 0 0 0 10-8 CFU/con 30 0 0 0 Từ Bảng 3.1 nhận thấy liều gây nhiễm từ 10-2 CFU/ml đến 10-5 CFU/ml làm cá chết Liều gây nhiễm an toàn cho cá từ 10-6 CFU/ml đến 10-8 CFU/ml ( tỷ lệ gây chết