Y HC THC HNH (864) - S 3/2013 51 ứng dụng tạo plasmid tái tổ hợp để nghiên cứu các chủng vi rút Rhino lu hành tại Khánh Hòa và Bình Định năm 2008-2010 Huỳnh Kim Mai, Trịnh Thị Xuân Mai Vin Pasteur Nha Trang TểM TT 30 chng vi rỳt Rhino thu thp t nhng bnh nhõn nhim trựng ng hụ hp cp hai tnh Khỏnh Hũa v Bỡnh nh t nm 2008 n nm 2010 c ng dng to plasmid tỏi t hp gii t vựng gen 5UTR-VP4/2 ca vi rỳt Rhino. Kt qu phõn tớch trỡnh t cho thy, cú s lu hnh ca c 3 loi HRV- A, HRV-B, v HRV-C, trong ú, HRV-A chim u th (50,0%), tip n l HRV-C (33,3%) v cui cựng l HRV-B (16,7%). T l mc ca cỏc loi cú s khỏc bit rừ theo nhúm tui (p<0.05). Tr em nh ch yu mc HRV-C, trong khi ú ngi ln li mc HRV-A. Ngoi ra, kt qu phõn tớch cõy ph h cũn cho thy, cỏc chng vi rỳt Rhino trong bi nghiờn cu cng cú s bin i a dng trong trỡnh t nucleotit v phõn thnh nhiu kiu huyt thanh khỏc nhau. Cỏc chng HRV-A trong bi nghiờn cu cú liờn quan n cỏc kiu huyt thanh HRV56, HRV47, HRV81, HRV67, HRV24, HRV20, HRV49, HRV12, cũn HRV-B li cú kiu huyt thanh HRV92, HRV35, HRV87, HRV-C thỡ cú tng quan gn vi cỏc chng NAT001_CA (M), C025-Hongkong, NAT 045_CA (M); N4, N10 (Thng Hi), v HRVC-35. S bin i a dng cú th l nguyờn nhõn khin cho Rhino l tỏc nhõn hng u trong cỏc ca nhim vi rỳt hụ hp min Trung Vit Nam. T khoỏ: Vi rỳt Rhino, HRV-A, HRV-B, HRV-C SUMMARY 5UTR-VP4/2 nucleotide fragment of 30 Rhinovirus from ARI patients in Khanh Hoa and Binh Dinh province collected during 2008 to 2010 were cloned for sequencing. Sequencing analysis results indicated that all HRV-A, HRV-B, and HRV-C were detected with the highest proportion of HRV-A (50%), followed by HRV-C (33.3%) and HRV-B (16.7%). Distribution of each species was significantly different by age groups. HRV-C was predominant in children while HRV-A in adult. In addition, phylogenetic tree analysis showed that the Rhino strains in this study were diverse in nucleotide sequence and distributed into several different serotypes such as HRV56, HRV47, HRV81, HRV67, HRV24, HRV20, HRV49, HRV12 (for HRV-A), HRV92, HRV35, HRV87 (for HRV-B). HRV-C related to NAT001_CA (USD), C025- Hongkong, NAT 045_CA (USD); N4, N10 (Shanghai), and HRVC-35. The genetic diversity may induced the turnover of rhinovirus which was a leading cause of respiratory virus infections in Central Vietnam. Keyword: Rhinovirus, HRV-A, HRV-B, HRV-C T VN Hi chng viờm ng hụ hp cp l bnh rt ph bin v d b mc phi mi la tui, c bit l tr em. Bnh do tỏc nhõn vi rỳt hụ hp gõy ra nh vi rỳt Rhino (HRV), vi rỳt hụ hp hp bo (RSV), vi rỳt cỳm, vi rỳt ỏ cỳm (parainfluenza), v.v , trong s ú, Rhino l vi rỳt chim u th nht [1,4]. Cú hn 100 kiu huyt thanh (serotype) ca vi rỳt Rhino ó c xỏc nh v phõn thnh ba loi chớnh HRV-A, B, C [10]. T l mc vi rỳt Rhino cng rt ph bin min Trung Vit Nam [8], tuy nhiờn, vic xỏc nh s phõn loi cng nh trỡnh t gen ca vi rỳt Rhino vn cha cú nghiờn cu no cụng b. Do vy, ti ny ó ng dng k thut to dũng gii trỡnh t vựng gen 5UTR-VP4/2 ca vi rỳt Rhino v so sỏnh vi cỏc chng ó cụng b trờn th gii nhm xỏc nh loi, s liờn quan n cỏc kiu huyt thanh v c im dch t hc ca mt s chng vi rỳt Rhino lu hnh ti hai tnh Khỏnh Ho v Bỡnh nh t nm 2008-2009. MU V PHNG PHP NGHIấN CU 1. Mu nghiờn cu: Bao gm 30 mu dch ngoỏy hng ca bnh nhõn cú triu chng viờm ng hụ hp cp thu thp ti hai tnh Khỏnh Hũa, v Bỡnh nh t nm 2008- 2010, cú kt qu xột nghim dng tớnh vi vi rỳt Rhino v khụng ng nhim vi cỏc vi rỳt hụ hp khỏc. 2. Phng phỏp nghiờn cu: on gen 5UTR-VP4/2 ca vi rỳt Rhino c khuych i bng phn ng RT-PCR, sau ú c tinh sch v gn chốn vo plasmid pGEMđ -T (Promega) to plasmid tỏi t hp. Plasmid tỏi t hp tip tc c s dng lm khuụn cho phn ng gii trỡnh t on chốn ca vi rỳt Rhino vi 4 cp mi M13-F, M13-R, 5UTR-F v VP4/2-R. Kt qu gii trỡnh t c x lý bng cỏc phn mm CLC viewer 6.5.3, FinchTV v Mega 5.0. KT QU 1. Kt qu to plasmid tỏi t hp: ó to c thnh cụng 30 mu plasmid tỏi t hp cha on 5UTR-VP4/2 (di khong 923 bp) ca vi rỳt Rhino nm chốn gia hai v trớ enzyme ct gii hn EcoRI cú trỡnh t (5-GAATTC-3) ca vector pGEM-T (Hỡnh 1). 2. Kt qu xỏc nh s phõn loi ca vi rỳt Rhino: Vi 30 mu phõn tớch, ó xỏc nh vi rỳt Rhino cú 3 loi HRV-A, HRV-B, v HRV-C ng vi 3 nhỏnh ca cõy ph h (hỡnh 2A), trong ú cú 15 mu thuc loi HRV-A (chim t l 50,0 %), 5 mu thuc loi HRV-B (chim t l 16,7%), v 10 mu thuc loi HRV-C (chim t l 33,3%) (hỡnh 2B). Y HỌC THỰC HÀNH (864) - SỐ 3/2013 52 Đoạn chèn Vi rút Rhino (~923bp) Hình 1: Cấu trúc của plasmid tái tổ hợp thu được. A B Hình 2: (A) Cây phả hệ phân loài của vi rút Rhino trong bài nghiên cứu. (B) Tỷ lệ phân bố của các loài. 3. Đặc điểm dịch tễ học của các ca bệnh nhiễm vi rút Rhino: So sánh sự phân bố theo tỉnh, năm, giới tính cho thấy tỷ lệ phân bố của 3 loài HRV-A, B, và C có sự khác nhau, tuy nhiên sự khác nhau chưa có ý nghĩa thống kê (p>0.05). Riêng đối với phân bố theo nhóm tuổi, sự khác biệt lại rõ rệt và có ý nghĩa (p<0.05). Theo đó, nhóm tuổi trẻ em chủ yếu mắc HRV-C trong khi ở người lớn lại chủ yếu mắc HRV-A (hình 3). 4. Kết quả phân tích các kiểu huyết thanh của vi rút Rhino: Phân tích cây phả hệ cho thấy, các chủng HRV-A trong bài nghiên cứu có liên quan đến các kiểu huyết thanh HRV56, HRV47, HRV81, HRV67, HRV24, HRV20, HRV49, HRV12, còn các chủng HRV-B lại có kiểu huyết thanh HRV92, HRV35, HRV87 trong khi đó HRV-C có tương quan gần với các chủng NAT001_CA (Mỹ), C025- Hongkong, NAT 045_CA (Mỹ); N4, N10 (Thượng Hải), và HRVC-35. HÌNH 1 TRANG Y HỌC THỰC HÀNH (864) - SỐ 3/2013 53 BÀN LUẬN Cả 3 loài HRV-A, B, C đều được xác định có lưu hành tại Khánh Hoà và Bình Định, hai tỉnh thuộc khu vực miền Trung Việt Nam. Trong đó, HRV-A và C chiếm ưu thế. Kết quả này tương đồng với nhiều công bố của các tác giả khác trên thế giới như tác giả Wisdom A và cs, 2009, nghiên cứu tỷ lệ nhiễm HRV trên bệnh nhân viêm đường hô hấp ở Anh cho kết quả tỷ lệ HRV-A chiếm cao nhất với 63%, HRV-C chiếm 30%, HRV-B chiếm tỷ lệ thấp với 7% [7]. Tác giả Huang T và cs, 2009, tác giả Heidi E Smut và cs, 2011, công bố tỷ lệ HRV-C chiếm ưu thế ở trẻ em bị viêm đường hô hấp cấp ở Thượng Hải (Trung Quốc) và Châu Phi [5,3]. Cả hai loài A, và C đều có liên quan đến tính chất gây bệnh nặng của vi rút Rhino [2,6]. Như vậy, kết quả lưu hành chiếm ưu thế của chủng HRV-A, và HRV-C giúp cảnh báo việc nhiễm vi rút Rhino ở miền Trung Việt Nam rất cần được sự quan tâm của ngành Y tế. Về mặt dịch tễ học, tuy nghiên cứu trên cỡ mẫu nhỏ nhưng cũng cho thấy rõ sự khác nhau giữa tỷ lệ nhiễm vi rút Rhino ở nhóm lứa tuổi trẻ em và người lớn. Kết quả này tương tự với kết quả của tác giả Wisdom và cs. HRV-C chiếm tỷ lệ cao ở lứa tuổi 1-2, không thấy HRV-C ở lứa tuổi 37-65 và trên 65 [7]. Nghiên cứu của tác giả Huang T và cs cũng kết luận tỷ lệ HRV-C ở trẻ em là chiếm ưu thế [5]. Bài nghiên cứu còn cho thấy sự đa dạng về di truyền trong các chủng HRV ở miền Trung Việt Nam thể hiện ở mối liên quan đến 17 kiểu huyết thanh khác nhau (trung bình cứ khoảng 1,7 chủng được phát hiện là thuộc một kiểu huyết thanh). Nhận định này phù hợp với công trình nghiên cứu của tác giả Mardis và cs, 2007 , vi rút Rhino có trình tự di truyền rất đa dạng điều này lý giải tỷ lệ nhiễm vi rút Rhino thường cao ở các bệnh nhân viêm đường hô hấp [9]. KẾT LUẬN Bài nghiên cứu đã giúp xác định được loài, và sự liên quan đến các kiểu huyết thanh của một số chủng vi rút Rhino lưu hành tại Khánh Hoà và Bình Định năm 2008-2010. Kết quả cho thấy cả 3 loài HRV-A, B, C đều phát hiện lưu hành ở miền Trung Việt Nam, trong đó HRV- A chiếm tỷ lệ cao nhất (50,0%), tiếp đến là HRV-C (33,3%), và HRV-B chỉ chiếm một tỷ lệ thấp (16,7%). Tỷ lệ mắc giữa các loài cũng có sự khác biệt rõ theo nhóm tuổi, HRV-C chủ yếu mắc ở trẻ nhỏ, HRV-A lại chủ yếu ở nhóm tuổi lớn hơn. Các chủng có sự biến đổi đa dạng trong trình tự nucleotit và tương ứng với nhiều kiểu huyết thanh khác nhau. Sự biến đổi đa dạng có thể là nguyên nhân khiến cho Rhino là tác nhân hàng đầu của các ca nhiễm vi rút hô hấp ở miền Trung Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. De Almeida MB, Zerbinati RM, Tateno AF, Oliveira CM, Romão RM, Rodrigues JC, Pannuti CS, da Silva Filho LV, (2010), “Rhinovirus C and respiratory exacerbations in children with cystic fibrosis”, Emerg Infect Dis, 16(6): 996-9. 2. Fuji N, Suzuki A, Lupisan S, Sombrero L, Galang H, Kamigaki T, Tamaki R, Saito M, Aniceto R, Olveda R, Oshitani H, (2011), “Detection of human Rhinovirus C viral genome in blood among children with severe respiratory infections in the Philippines”. PLoS One, 6(11):E27247. 3. Heidi E Smuts, Lesley J Workman, Heather J Zar, (2011), “Human Rhinovirus infection in young African children with acute wheezing”, BMC Infectious Diseases, 11:65. 4. Heikkinen T, Jarvinen A, (2003), “The common cold”. Lancet, 361:51–59. 5. Huang T, Wang W, Bessaud M, Ren P, Sheng J, Yan HJ, Zhang J, Lin X, Wang YJ, Delpeyroux F, and Deubel V, (2009), “Evidence of recombination and genetic diversity in human Rhinoviruses in children with acute respiratory infection”, PLoS ONE, 4 (7), E6355. 6. Longtin J, Marchand-Austin A, Winter AL, Patel S, Eshaghi A, Jamieson F, Low DE, Gubbay JB, (2010), “Rhinovirus outbreaks in long-term care facilities, Ontario, Canada”, Emerg Infect Dis, 16(9):1463-5. 7. Wisdom A, Leitch EC, Gaunt E, Harvala H, Simmonds P, (2009), “Screening respiratory samples for detection of human Rhinoviruses (HRVs) and enteroviruses: comprehensive VP4-VP2 typing reveals high incidence and genetic diversity of HRV species C”. J Clin Microbiol., 47(12):3958-67. 8. Yoshida LM, Suzuki M, Yamamoto T, Nguyen HA, Nguyen CD, Nguyen AT, Oishi K, Vu TD, Le TH, Le MQ, Yanai H, Kilgore PE, Dang DA, Ariyoshi K, (2010), “Viral pathogens associated with acute respiratory infections in central Vietnamese children”, Thepediatric Infectious Disease Journal, Vol 29, 75-77. 9. Mardis ER, Li H, DeRisi JL, (2007), “Genome-wide diversity and selective pressure in the human Rhinovirus”. Virol J, 3;4:40. 10. Palmenberg AC, Spiro D, Kuzmickas R, Wang S, Djikeng A, Rathe JA, Fraser- Liggett CM, and Liggett SB, (2009), “Sequencing and analyses of all known human Rhinovirus genomes reveal structure and evolution”, Science, 324 (5923), 55-59. . 3/2013 51 ứng dụng tạo plasmid tái tổ hợp để nghiên cứu các chủng vi rút Rhino lu hành tại Khánh Hòa và Bình Định năm 2008-2010 Huỳnh Kim Mai, Trịnh Thị Xuân Mai Vin Pasteur Nha Trang. [9]. KẾT LUẬN Bài nghiên cứu đã giúp xác định được loài, và sự liên quan đến các kiểu huyết thanh của một số chủng vi rút Rhino lưu hành tại Khánh Hoà và Bình Định năm 2008-2010. Kết quả. tính chất gây bệnh nặng của vi rút Rhino [2,6]. Như vậy, kết quả lưu hành chiếm ưu thế của chủng HRV-A, và HRV-C giúp cảnh báo vi c nhiễm vi rút Rhino ở miền Trung Vi t Nam rất cần được sự